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1、10申请公布号CN102000323A43申请公布日20110406CN102000323ACN102000323A21申请号201010501767422申请日20100930A61K38/17200601A61P37/06200601A61P35/0020060171申请人中山大学地址510080广东省广州市中山二路74号中山大学北校区中山医学院72发明人孙希卞国武阮志燕胡少敏杨琳琳刘灵辉吕志跃吴忠道74专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司44102代理人陈卫54发明名称SJ16蛋白在制备免疫抑制药物中的应用57摘要本发明公开了SJ16蛋白在制备免疫抑制药物中的应用方法。该药物的必要组。
2、成性多肽序列包含SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段SEQIDNO1或SEQIDNO2或SEQIDNO3序列或与上述蛋白具有70以上同一性的功能性变体中的一种或几种。本发明是首次提出将SJ16应用于制备免疫抑制药物。该药物来源于病原体生物资源天然血吸虫蛋白，较之现有的同类药物具有低毒高效的优点，具有很好的社会和经济效益。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表2页附图0页CN102000333A1/1页21SJ16蛋白在制备免疫治疗药物中的应用。2如权利要求1所述的免疫治疗药物，其特征在于该药物的必要组成性多肽序列包含SJ16蛋白或SJ16蛋。
3、白的活性片段SEQIDNO1或SEQIDNO2或SEQIDNO3序列或与上述蛋白具有70以上同一性的功能性变体中的一种或几种。3如权利要求2所述的免疫治疗药物，其特征在于所述功能性变体的同一性为80以上。4如权利要求2所述的免疫治疗药物，其特征在于该药物的必要组成性多肽包含权利要求2所述的任一蛋白序列的数量为10以上。5如权利要求1所述的免疫治疗药物，其特征在于该药物应用于制备免疫移植反应、肿瘤、器官特异性自身免疫病或系统性自身免疫病的药物。6如权利要求1所述的免疫治疗药物，其特征在于该药物制成适合免疫治疗的各种剂型。权利要求书CN102000323ACN102000333A1/6页3SJ16。
4、蛋白在制备免疫抑制药物中的应用技术领域0001本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种新型的免疫抑制药物。背景技术0002免疫抑制剂IMMUNOSUPPRESSANT，ISA是一类具有免疫抑制作用的药物，主要功能为抑制机体异常的免疫反应，从而达到治疗自身免疫性疾病，抗肿瘤，抗器官移植排斥等目的。免疫抑制剂主要的作用机理是，通过抑制与免疫反应有关细胞T细胞和B细胞等免疫细胞的增殖和功能，达到降低机体的免疫反应的目的。免疫抑制剂大致可分为四代。第一代以肾上腺皮质激素、雷公藤多苷片、硫唑嘌呤和抗淋巴细胞球蛋白为代表；第二代以环孢素和他克莫司为代表；第三代以单克隆抗体雷帕霉素抗T淋巴细胞单克隆抗体、霉酚酸。
5、脂MYCOPHENOLATEMOFETIL，MMF为代表；第四代以抗IL2受体单克隆抗体为代表。但以上的免疫抑制剂药物均有一定的毒性，增加宿主对感染和肿瘤的易感性；另外也无法抑制慢性排斥反应，是移植器官难以在宿主体内长期稳定存活的主要原因。0003随着分子生物学和基因组学的发展，使从微生物病原体等生物资源中寻找研发有别于现有免疫抑制剂机制的、低毒高效的原创性新的型免疫抑药物成为可能。特别是随着对免疫逃避机制的研究深入，发现了一批与免疫逃避有关的免疫调节分子，与寄生虫主动调节宿主的免疫应答相关，为从微生物病原体中寻求新的免疫抑制剂奠定了基础。0004众所周知，血吸虫是一种多细胞生物，它能在广泛分。
6、布免疫细胞的人体血液系统中存活而不被功能完善的免疫系统清除，提示血吸虫在和人类长期共进化的过程中，可以产生一些可调节宿主免疫应答功能的物质，下调宿主免疫反应，借以逃避宿主的免疫应答。研究发现，当血吸虫尾蚴侵入宿主体内的过程中，在皮肤停留23D转化为童虫，在此过程中血吸虫只引起轻微的炎症反应，而死的血吸虫尾蚴或皮内注射死虫的提取物却可以引起强烈的炎症反应。这提示，活的血吸虫可能合成、分泌抑制炎症反应的物质，而这种物质可能有抑制炎症反应的免疫调节功能。SJ16是从血吸虫的分泌物中寻找到一种分子量为168KDA的蛋白质。我们于1999年，克隆到SJ16的编码基因，并构建了重组表达体系，其纯化表达产物。
7、RSJ16可降低和减轻角叉菜胶引起的实验动物皮肤足趾肿胀。同时RSJ16可引起实验小鼠的腹腔毛细血管通透性增加，白细胞计数降低，及耳廓肿胀的缩小。这些研究提示SJ16是具有确切抗炎作用的虫源性分子。但尚未有人对SJ16在免疫抑制作用方面进行研究。发明内容0005本发明对SJ16在免疫抑制作用方面进行了研究。其目的在于提供一种低毒高效的新型生物免疫抑制药物。0006具体的技术方案如下0007我们猜测SJ16参与了血吸虫的免疫逃避，SJ16作为抗炎分子，很可能具有抑制宿主免疫应答的效应或作用。通过动物实验，证实了以上猜测，证明SJ16具有良好的免疫抑说明书CN102000323ACN1020003。
8、33A2/6页4制功能。0008进一步，我们对SJ16基因进行分析，目的在于找出SJ16免疫抑制功能的活性片段及其基因表达序列。通过对SJ16蛋白全长序列SEQIDNO4进行了分析，发现有2个核定位序列肽段。分别将这两个核定位序列肽段去除，或同时去除，得到了三个不同的活性成分片段。在本发明中，对这三个活性片段分别命名为SJ161、SJ162、SJ163对应于SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO3基因编码见序列表。0009体外细胞实验表明，SJ16及其活性成分片段或其任意组合物均具有抑制树突状细胞的成熟、抑制T细胞增殖，下调IL12等细胞因子的表达，抑制TH1和增强TH2的细胞免疫。
9、应答的作用。可通过抑制淋巴细胞对组织，特别是对移植物的攻击，或抑制炎症细胞因子的产生与其相关炎症反应；达到免疫抑制的目的。0010根据需要针对活性片段进行重组表达，得到一系列具有免疫抑制作用的重组表达产物。通过实验证明，在重组蛋白中，与SJ16蛋白或其活性片段具有70以上的同一性的功能性变体或这些功能性变体的组合物都具有较好的免疫抑制作用，其中更优选的范围是具有80以上的同一性的功能性变体或这些功能性变体的组合物。0011在对上述SJ16蛋白及其活性片段进行重组多肽的研究结果也表明，含SJ16蛋白活性氨基酸片段的数量为10以上的多肽的免疫抑制作用较好。0012在此研究的过程中，我们还提供了含有。
10、SJ16蛋白活性成分基因编码所述的融合蛋白的多核苷酸及该多核苷酸序列相应的核酸构建体系、表达载体和宿主细胞。0013居于上述研究，我们将上述活性物质应用于制备免疫抑制药物。药物的必要组成性多肽序列可以包含SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段SEQIDNO1或SEQIDNO2或SEQIDNO3序列或与上述蛋白具有70以上同一性的功能性变体中的一种或几种。0014此类药物可应用于免疫相关性疾病，包括免疫移植反应、肿瘤、器官特异性自身免疫病，系统性自身免疫病，如系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎、WEGENER肉芽肿病等。0015本发明可以用来制备注射用制剂、口服制。
11、剂或缓释制剂等各种适合免疫治疗的剂型。0016本发明与现有的免疫抑制药物相比，有以下明显的创新和优点0017第一，本发明首次提出将SJ16应用于制备免疫抑制药物。0018第二，本发明提供的免疫制药物来源于天然血吸虫蛋白，在长期与宿主的共进化过程中发展出了一系列的免疫抑制和免疫逃避作用，通过免疫耐受机制及诱导，可以在很大程度上避免现有的免疫抑制药物的毒副作用，具有低毒高效的特点，这是本发明的最大优势所在。0019第三，本发明提供的疫抑制药物来源于病原体生物资源，具有极其广阔的市场空间和较好的社会、经济效益。附图说明00200021具体实施方式0022实施例1说明书CN102000323ACN10。
12、2000333A3/6页500230024根据日本血吸虫SJ16基因序列设计引物，经PCRDESIGN软件分析，由上海生工生物工程公司合成，引物P1为5GCCATATGAACATGACTTTAATTAAC，引入NDEI酶切位点；引物P2为5ACTTAATACTTTGTAGAATTCGAACC，引入HINDIII酶切位点。扩增出全长SJ16基因。0025实施例20026SJ16全长的表达和鉴定及纯化0027利用所设计的一对引物P1、P2成功扩增。将其克隆到PGEX4T1载体上，挑取筛选到的PGEX4T1SJ161重组质粒的DNA，以其为模板，用P1、P2引物进行PCR扩增获取的特异性条带；双酶切。
13、验证其大小与预期序列一致；将所筛选的重组质粒送TAKARA公司测序，测序结果无误。获得的重组质粒确实为PGEX4T1SJ161重组质粒。将PGEX4T1SJ161重组质粒转化的工程菌经IPTG诱导表达后，15SDSPAGE电泳显示在分子量约46KDA处出现一明显蛋白条带，而空质粒转化菌在诱导前后以及重组质粒工程菌在诱导前后均无此条带的出现，表明此蛋白条带可能为目的蛋白条带。菌体裂解上清上亦有此蛋白条带的出现，显示该蛋白为可溶性表达。将裂解上清经过GST亲和层析柱，经过THROMBIN酶酶切以后，可以得到分子量为19KDA左右的单一蛋白。0028PGEX4TBL21转化菌经诱导后出现一分子量约为。
14、26KDA明显表达带，此为GST蛋白。PGEX4T1转化的BL21DE3菌经IPTG诱导后，较诱导前于约40DA出现一条明显的融合蛋白表达条带。免疫印迹分析，该蛋白能特异地被抗GST抗体1500稀释识别，于约40DA位置有一条条带，PGEX24T1转化菌经诱导于约26KDA处有一条条带为PGEX4T1转化菌经诱导表达GST蛋白能特异地被抗GST抗体识别。0029GST柱亲和层析纯化。0030实施例30031SJ161、SJ162、SJ163的表达和鉴定0032根据SJ161的蛋白序列直接合成相应的DNA序列，命名为SJ161序列。根据SJ162、SJ163之间引入柔性臂GGAGGA，使SJ16。
15、2、SJ163融合；再根据其蛋白序列设计相应的核酸序列。分别将其克隆到PGEX4T1载体上，挑取筛选到的PGEX4T1SJ161、PGEX4T1SJ162、PGEX4T1SJ163重组质粒的DNA，以其为模板，用相应引物进行PCR扩增获取的特异性条带；双酶切验证其大小与预期序列一致；将所筛选的重组质粒送TAKARA公司测序，测序结果无误。获得的重组质粒确实为PGEX4T1SJ161、PGEX4T1SJ1623重组质粒。将PGEX4T1SJ161、PGEX4T1SJ1623重组质粒转化的工程菌经IPTG诱导表达后，15SDSPAGE电泳显示其分别在分子量约40KDA、84KDA处出现一明显蛋白条。
16、带，而空质粒转化菌在诱导前后以及重组质粒工程菌在诱导前后均无此条带的出现，表明此蛋白条带可能为目的蛋白条带。菌体裂解上清上亦有此蛋白条带的出现，显示该蛋白为可溶性表达。将裂解上清经过GST亲和层析柱，经过THROMBIN酶酶切以后，可以得到分子量为14KDA、36KDA左右的单一蛋白0033PGEX4T1转化的BL21DE3菌经IPTG诱导后，较诱导前于约40KDA、84KDA出现一条明显的融合蛋白表达条带。免疫印迹分析，该蛋白能特异地被抗GST抗体1500稀释识别，于约40KDA、84KDA位置有一条条带，PGEX24T21转化菌经诱导于约26KDA处有一条条带为PGEX4T1转化菌经诱导表。
17、达GST蛋白能特异地被抗GST抗体识别。说明书CN102000323ACN102000333A4/6页60034GST柱亲和层析纯化。0035实施例40036内毒素测定0037通过利用鲎试剂法检测重组蛋白SJ161MG/ML中的内毒素含量，并利用AFFINITYPAKTMDETOXIGELTMENDOTOXINREMOVINGGEL去除重组蛋白中的内毒素，并用鲎试剂法最后检测内毒素含量，保证RESJ16的内毒素含量小于02EU/KG02内毒素含量每千克。0038实施例50039SJ16的抗炎作用0040不同剂量的SJ161，5，10G/KG均可以明显减轻二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和毛细血管通透性增。
18、加，抑制角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀，明显抑制实验性腹膜炎小鼠腹腔毛细血管通透性增高，且具有一定的剂量赖关系见表1。0041表1RESJ16对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀作用和毛细血管通透性改变的影响00420043注与生理盐水对照组及地塞米松对照组相比P005；P001NOTE院COMPAREDWITHNORMALSALINENSANDDEXAMETHASONECONTROLS袁P005；P0010044实施例60045SJ16体外抑制T细胞增殖实验0046SJ16原核重组表达产物可以明显抑制小鼠脾脏淋巴细胞的转化和增殖，腹腔注射SJ16可以抑制巨噬细胞的细胞毒活性，减少NO和TNF的释放，减少血清中。
19、IFNR的表达水平，并且可以诱导胸腺和脾脏淋巴细胞的凋亡。当SJ16作用于小鼠骨髓来源树突状细胞，以LPS和地塞米松刺激为对照组，实验结果如下SJ16明显抑制DC表面标记分子MHCII、CD40、CD80和CD86的表达对照组MHCII、CD40、CD80和CD86分别为23，207，184和189，LPS组为486，767，338，341，而SJ16处理组分别为259，267，192，199。与地塞米松组类似，分别为257，267，192和199。同说明书CN102000323ACN102000333A5/6页7时混合淋巴试验表明SJ16刺激的BMDC诱导同种异基因T细胞增殖的能力明显降低对。
20、照组为421，LPS组为759而SJ16处理组为453，地塞米松组为486。0047实施例70048SJ16对T细胞选择性毒性实验MTT法0049从CBA小鼠分离得到脾细胞后，用CD4磁珠分选CD4T细胞，分别用终浓度015G/ML的SJ16刺激。细胞37度培养3D。检测SJ16对T细胞的毒性作用。MTT检测结果显示SJ16对T细胞具有明显抑制作用，其中SJ165G/ML的抑制率最高为59。0050实施例80051SJ16对T细胞活性的影响检测0052分别用SJ1615UG/ML、刀豆蛋白CONA组，阴性对照和环孢素CSA组，阳性对照作为刺激物，与感染血吸虫的小鼠T细胞进行共培养，37度培养箱。
21、中培养24H，同时检测细胞因子的表达情况。实验共分ACONTROL，BCONA5UG/ML组，CRSJ161UG/ML组，DRSJ165UG/ML组，ERSJ1610UG/ML组，FCSA5UG/ML组，共六组。结果如下CONTROL组，CONA5UG/ML组，RSJ161UG/ML组，RSJ165UG/ML组，RSJ1610UG/ML组，CSA5UG/ML组的IL12P70的含量分别为15030NG/ML，54043NG/ML，41518NG/ML，32930NG/ML，17030NG/ML，25023NG/ML，而对比IL10，CONTROL组，CONA5UG/ML组，RSJ161UG/M。
22、L组，RSJ165UG/ML组，RSJ1610UG/ML组，CSA5UG/ML组的IL12P70的含量分别为8013NG/ML，26020NG/ML，42011NG/ML，53018NG/ML，54030NG/ML，50023NG/ML，证实其可以下调IL12，上调IL10，诱导T细胞向TH2方向发展。0053实施例90054利用小鼠皮肤移植模型，经皮下注射含SJ16编码基因的重组真核表达质粒PCDNA3SJ16，结果发现受体小鼠对同种皮肤移植物暂时性的耐受，延长了移植物的平均存活时间72D，其效果与环孢素ACSA相似54D，提示SJ16基因DNA免疫有明显的免疫抑制作用。0055实施例100。
23、056通过序列分析，将SJ161定点突变，得到新的功能性变体，其序列MKVTPIIFAVFCVVGGMTLITGTTLEQGPHPSEKDMELVYIDAEYEKEAGLKSICNEIKRSFREDLGMKMLDVAKIL。分别观察SJ16和功能性变体SJ161M对活化染色质诱导的红斑狼疮样综合征小鼠的治疗作用。CONA活化的BALB/C小鼠脾细胞中提取活性染色质。以染色质100G/只D0、D14、D28背部皮内注射免疫同系小鼠三次，建立狼疮样综合征小鼠模型。SJ16、SJ161M1MGKG1D1分别灌胃给药D35D50，致病后35天开始给药，连续15天，观察SJ16及SJ161M对活化染色质。
24、诱导的红斑狼疮样综合征小鼠的治疗作用。发现SJ16及SJ161M对SLE样红斑狼疮样综合征小鼠的治疗作用明显抑制三种抗自身抗体和总IGG的升高，可明显改善模型动物受CONA刺激后低水平的增殖，腹腔巨噬细胞产生IL10水平升高，在一定程度上降低了蛋白尿水平，明显改善肾损害。研究结果显示SJ16及SJ161M对小鼠红斑狼疮样综合征有治疗作用，从分子水平上抑制了腹腔巨噬细胞的活性，均具有抗炎免疫抑制作用。0057实施例110058进行SJ16的毒性实验。质量1821G昆明种小鼠，雌雄各10只，称取基因重组说明书CN102000323ACN102000333A6/6页8SJ16蛋白10G用蒸馏水配制50ML混悬液，按013ML/10G经口灌胃，每间隔3H灌胃小鼠2次，累计2次灌胃总量达12G/KG相当于人群推荐用量0102G/KG的600倍，灌胃前停食12H，连续观察1周，并记录动物中毒症状及死亡情况。1周内试验动物未见明显中毒症状及死亡发生，采用霍恩法测定LD5010G/KG。按急性经口毒性分级标准判定基因重组SJ16蛋白属实际无毒级。说明书CN102000323ACN102000333A1/2页90001序列表CN102000323ACN102000333A2/2页100002序列表CN102000323A。