注射式血管化脂肪组织及其构建方法 技术领域 本发明涉及生物工程领域， 特别是涉及一种基于自体干细胞的注射式血管化脂肪 组织及其构建方法。
背景技术 每年全世界有数百万例患者， 因为创伤、 肿瘤切除术和先天性缺陷导致的软组织、 面部和乳房缺损， 需要通过手术进行修复重建。 由于乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一， 发病率高达 10％～ 15％， 并且还呈逐年上升和年轻化的趋势， 肿瘤切除造成的软组织和乳 房缺损数量最多。据美国矫形外科医师协会报道， 2004 年全世界有超过 500 万人实行了乳 房重建手术， 其中有 400 万是由于肿瘤切除。
一般认为， 理想的脂肪软组织填充材料应该与天然组织有相似的柔软性、 相同的 渗透压、 稳定的理化性能、 良好的生物相容性、 不致癌、 不致敏、 不致畸、 不钙化等。 目前较普 遍使用的乳房和面部填充及再造材料包括医用材料和自体移植物两大类。医用材料又包
括硅胶、 聚丙烯酰胺凝胶、 三酰甘油 ( 甘油三酯 )、 透明质酸等植入型假体和液体石蜡、 凡士 林等注射用混合物。 目前的研究表明使用这些材料易出现假体破裂或渗漏、 炎症反应、 肉芽 肿、 包膜挛缩、 假体移位、 感染、 蒙道尔病等并发症， 安全性受到很大的质疑。以硅胶假体为 例， 1992 年美国食品与药物管理局禁止了所有硅胶假体的使用。
相对而言， 自体移植物具有来源丰富， 应用范围广泛， 生物相容性好， 无免疫排斥 反应， 手感好， 安全可靠及可调整等许多优点。针对小范围及小体积的缺损和塑性， 自体脂 肪颗粒注射是目前临床经常使用的一种方案。 该方法以自体脂肪颗粒作为人体组织填充材 料， 无排斥反应， 不存在致病、 致癌性。 取材来源于身体脂肪较多的部位， 可以在填充同时可 进行吸脂手术， 取得取多补少一举两得的效果。 供区和受区几乎不留手术瘢痕， 对人体的正 常解剖结构影响及副损伤都很小、 安全持久。 适应证广泛， 几乎人体表皮下组织凹陷缺损均 可填充。自 1889 年 Van der Meulen 首次报道了脂肪组织的自体移植以来， 该技术已成功 地应用于①面部凹陷性缺损或畸形， 如颧部、 颞部、 额部、 眶； ②较深的皱纹、 鼻唇沟及鞍鼻 ； ③上唇过薄， 耳垂较小等 ； ④乳房发育不良、 哺乳后乳房萎缩， 双侧乳房不对称及乳头凹陷 ； ⑤阴茎增粗、 丰大阴唇、 阴道松弛紧缩、 手背软组织萎缩填充。该治疗方案缺点在于由于注 入到乳房内的脂肪颗粒不能很好地建立起血液供应系统， 当大量脂肪堆集在一起， 会因供 血不足导致脂肪细胞坏死、 溶解、 吸收， 极易引发感染、 血肿、 变形、 疼痛、 硬结、 囊肿、 坏死等 后遗症。研究发现约有 50％～ 60％的脂肪颗粒被吸收， 存活下来的组织也逐渐被纤维化或 钙化， 效果不持久， 常需要多次注射维持形状。
针对大体积的软组织缺损， 尤其是乳房肿瘤切除术后的修复， 目前多采用转移下 腹部皮瓣的手术治疗方案， 通过显微外科血管吻合技术移植游离的肌皮瓣以达到隆乳目 的， 其外形逼真、 质地好、 易于塑形， 血运系统良好， 但给供区不可避免地造成创伤和瘢痕， 引起功能障碍， 如局部肌肉神经萎缩、 腹部软弱和形成腹壁疝等， 而且移植后吸收明显， 效 果不能持久， 尤其是当带蒂组织移植体的蒂部扭转或受压时可出现移植组织坏死等不良反应。患者常常难以接受此办法， 移植物供体受到相应的限制。
目前， 应用组织工程学原理来构建脂肪组织已成为组织工程研究领域的热点之 一。
在种子细胞研究方面， 由于成体脂肪细胞 ( 个大、 壁薄、 内有脂肪颗粒 ) 的不增殖 性和易受损伤性， 人们将兴趣越来越多的转向具有特定分化潜能， 良好自我更新和扩增能 力的干细胞。脂肪干细胞 (adipose derived adult stem cells) 已被证实能向脂肪细胞、 软骨细胞、 心肌细胞， 神经细胞及成骨细胞等多个方向定向转化。 而自体脂肪干细胞具有可 供取材的脂肪组织来源丰富， 抽取方便， 可反复获得， 操作损伤小， 无免疫排异反应， 细胞容 易培养， 增殖速度很快等优点， 已被越来越多的人所接受 ； 另外， 前脂肪细胞是一种类成纤 维细胞， 能够增殖并特异性向脂肪细胞分化， 可从经酶消化的脂肪组织或皮下脂肪抽吸物 中分离而来， 对外界机械损伤的抵抗力较强。 用普通的细胞培养方法就可以生长， 并能够在 体外扩增及分化， 目前脂肪组织工程的研究也主要集中在脂肪干细胞和前脂肪细胞。
在支架材料方面， 脂肪族聚酯类生物降解高分子中的聚乙醇酸 (polyglyclic aicd)、 聚乳酸 (polylactic acid) 及两者的共聚物 (polylacticacid/polyglyclic aicd copolymers)、 胶原等已用于动物实验。但存在主要问题是 ： 一方面常用的合成高分子材料 相对于乳房组织显得太硬， 另一方面如果不能及时建立血供， 复合细胞的可降解高分子材 料同样会被机体吸收， 难以长期保持稳定。同注射型脂肪颗粒一样， 材料和细胞被降解、 吸 收， 三维结构不稳定的主要因素仍然是无法及时建立血管网导致的血液供应不足。
目前已有用微球体系构建血管网的研究， 研究主要集中在用合成材料微球烧结后 形成的通道作为血管化的预留空间， 然后复合内皮细胞， 其效果良好， 但是与脂肪组织相比 还是有很大的距离。
综上所述， 自体移植对于小体积和大体积缺损的修复都是目前较常用的治疗方 案， 其中注射式脂肪颗粒最能被患者接受， 但存在供给区创伤和吸收等不可克服的问题。 脂 肪组织工程结合自体干细胞技术提供了一种很有前景的方向， 但目前还未取得突破性的进 展， 最大的难点在于供血不足引起的移植物降解、 吸收或坏死。 发明内容
本发明的目的是提供一种构建微血管的方法。 本发明的另一目的是提供一种基于自体干细胞的注射式血管化脂肪组织及其构建方法。 本发明所述的构建血管的方法， 是将组织细胞采用天然生物材料制成微球， 利用 微球间的间隙作为形成血管的通道， 构建血管， 主要包括以下步骤 ：
1) 将自体干细胞分别诱导为平滑肌细胞和内皮细胞， 平滑肌细胞与涂覆材料均匀 混合， 然后加入组织细胞微球， 使其在培养空间能形成至少两层， 进行培养， 直至含有平滑 肌细胞的涂覆材料均匀分布在组织细胞微球表面并通过自组装作用将微球连接成整体， 微 球之间的间隙形成通道 ；
2) 在通道内表面复合内皮细胞。
本发明所述的构建血管的方法， 在步骤 1) 之前， 还包括构建组织细胞微球 ： 将组 织细胞包裹在海藻酸钠基水凝胶材料中， 制成组织细胞微球 ；
在步骤 3) 之后， 还包括步骤 4) 将血管化生长因子包裹在海藻酸钠基水凝胶材料 中， 制成细胞因子缓释微球， 然后与步骤 3) 获得的组织均匀混合。
步骤 1) 所述组织细胞微球和步骤 4) 所述细胞因子缓释微球可采用各种方法将组 织细胞或生长因子包裹在海藻酸钠基水凝胶材料中制成微球， 优选非接触式高压静电法， 6 7 过程如下 ： 将组织细胞或生长因子以 10 ～ 10 个 /ml 的密度与海藻酸钠基水凝胶材料混 合后通过注射泵挤出， 经过高压静电场的拉力滴入固化液中， 制成组织细胞或生长因子微 球；
其中， 所述海藻酸钠基水凝胶材料可以是海藻酸钠、 海藻酸钠 / 胶原、 海藻酸钠 / 明胶、 海藻酸钠 / 纤维蛋白原中的一种或多种 ； 所述固化液为含二价阳离子的盐溶液， 如氯 化钙、 氯化钡等， 优选氯化钙溶液。
所述海藻酸钠基生物材料中海藻酸钠的最终浓度为 1-10％， 明胶、 胶原或纤维蛋 白原的最终浓度为 0.01-5％， 氯化钙溶液浓度为 100mM ～ 500mM。
所述组织细胞微球或生长因子微球的粒径可根据本领域技术人员的需要来决定， 优选微米级， 为便于配合， 生长因子微球的粒径应小于组织细胞微球的粒径 ； 优选的组织细 胞微球的粒径为 100μm ～ 500μm ； 细胞因子缓释微球的粒径为 20μm ～ 50μm。 所述涂覆材料为细胞亲和力高、 有自组装作用的生物材料， 优选选自胶原、 纤维蛋 白原、 matrigel 等的一种或多种。
所述步骤 2) 如下进行 ： 将内皮细胞悬液作为培养液， 将步骤 1) 制备的组织利用脉 动培养或普通培养方式进行培养， 使内皮细胞附着在所述通道的内壁， 形成外壁为平滑肌 细胞、 内壁为内皮细胞的血管组织。 所述内皮细胞悬液包含诱导内皮化培养基， 培养条件依 据本领域的公知技术决定。
本发明所述构建血管的方法中， 所述培养是在一定的培养空间进行的， 所述培养 空间可选择各种本领域常用的培养用具所形成的空间， 如离心管、 12 孔板等， 优选的， 培养 空间应该能够使微球可在至少一个方向形成至少两层， 从而使两层微球之间可以形成一定 长度的贯通通道， 然后培养， 直至含有平滑肌细胞的涂覆材料均匀分布在组织细胞微球表 面并通过自组装作用将微球连接成整体， 微球之间的间隙以及两层微球间的贯通通道形成 通道， 最后用内皮细胞悬液作为培养液进行脉动培养或普通培养， 构建血管。
本发明还提供一种基于自体干细胞的注射式血管化脂肪组织。
本发明所述的注射式血管化脂肪组织是模仿天然脂肪组织的成分和结构， 完全采 用自体细胞， 用天然生物材料包裹细胞形成微米级小球， 利用小球间的孔隙作为血管形成 的通道， 并结合血管化因子缓释系统， 构建出可注射式的血管化脂肪组织。包括以下步骤 ：
1) 脂肪细胞微球的构建 ： 取脂肪干细胞， 包裹于海藻酸钠基水凝胶材料内形成脂 肪干细胞微球， 然后用成脂诱导培养液培养， 使脂肪干细胞分化为脂肪细胞， 得到脂肪细胞 微球 ；
2) 以上述的方法构建血管， 其中组织细胞为脂肪干细胞， 包括 ： i) 将脂肪干细胞 分别诱导成平滑肌细胞和内皮细胞 ； ii) 将平滑肌细胞与涂覆材料均匀混合 ； iii) 将加入 脂肪细胞微球， 与包含平滑肌细胞的涂覆材料均匀混合， 使脂肪细胞微球在培养空间能形 成至少两层， 进行培养， 直至含有平滑肌细胞的涂覆材料均匀分布在脂肪细胞微球表面并 通过自组装作用将脂肪细胞微球连接成整体， 微球之间的间隙形成作为构建微血管的空间
的通道 ； iv) 在通道内表面复合内皮细胞， 形成血管 / 脂肪细胞体系 ；
3) 细胞因子缓释微球的构建 ： 将血管化细胞因子包裹于海藻酸钠基水凝胶材料 内， 制成细胞因子缓释微球 ；
4) 注射式血管化脂肪组织的构建 ： 将步骤 3) 制得的细胞因子缓释微球与步骤 2) 得到的血管 / 脂肪细胞体系混合， 制得注射式血管化脂肪组织。
其中， 步骤 1) 所述脂肪干细胞是自体细胞， 可通过本领域熟知的各种方式获得， 特别的， 可采用抽脂手术得到的自体脂肪组织来提取脂肪干细胞， 该提取过程是本领域公 知技术 ； 而且另外， 可将提取得到的脂肪干细胞先进行体外平面培养扩增， 得到所需数量后 再用于制备脂肪干细胞微球 ；
所述脂肪干细胞微球可采用本领域熟知的各种方法制备， 优选非接触式高压静电 6 7 法， 其制备过程如下 ： 将脂肪干细胞以 10 ～ 10 个 /ml 的密度与海藻酸钠基水凝胶材料混 合后通过注射泵挤出， 经过高压静电场的拉力滴入固化液中， 制成干细胞微球 ； 同样， 步骤 3) 中所述的细胞因子缓释微球也可采用同样方法进行 ： 将血管化生长因子与海藻酸钠混 合后滴入固化液中制成。
其中海藻酸钠基水凝胶材料可以是海藻酸钠、 海藻酸钠 / 胶原、 海藻酸钠 / 明胶、 海藻酸钠 / 纤维蛋白元中的一种或多种 ； 所述固化液为含二价阳离子的盐溶液， 如氯化钙、 氯化钡等， 优选氯化钙溶液。 所述海藻酸钠基水凝胶材料中， 海藻酸钠的最终浓度为 1-10％， 明胶、 胶原或纤维 蛋白原的最终浓度为 0.01-5％， 氯化钙溶液浓度为 100mM ～ 500mM。
所述脂肪干细胞微球的粒径为 100μm ～ 500μm ； 所述细胞因子缓释微球的粒径 为 20μm ～ 50μm。
所述血管化细胞因子为促进毛细血管发生和促进血管成熟的细胞因子， 包括 血管内皮细胞生长因子 (VEGF)、 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、 表皮生长因子 (EGF， Epidermal Growth Factor)、 血小板衍生生长因子 (PDGF)、 转化生长因子 (TGF-β1) 和血管 生成素 -1(angiopoietin-1) 等血管相关生长因子。
步骤 1) 或步骤 2) 中所述的将脂肪干细胞诱导成脂肪细胞， 平滑肌细胞和内皮细 胞是本领域公知的方法， 将脂肪干细胞在相应的诱导剂的作用下进行培养即可。
步骤 1) 中的脂肪干细胞微球经过成脂培养后， 其中的脂肪干细胞由于分化为脂 肪细胞， 微球内将充满高浓度脂肪细胞团簇 ； 本领域公知的成脂诱导剂有多种组成， 如： 高 糖 DMEM， 10％胎牛血清， 0.5mmol/L IBMX， 1μmol/L 地塞米松， 10μmol/L 胰岛素， 1％青链 霉素原液等， 都可用于本发明 ；
将脂肪干细胞诱导成内皮细胞的内皮诱导剂也有多种组成， 如低糖 DMEM， 2 ％胎 牛血清， 2 ％马血清， 10ng/mL VEGF， 2ng/mL bFGF(R&D 系统 )， 1×ITS(Sigma)， 0.61g/L 尼 克酰胺， 0.1μmol/L 地塞米松， 2g/L BSA， 0.1g/L 鸟氨酸， 0.03g/L 脯氨酸， 0.73g/L 谷氨酰 胺， 1g/L 葡萄糖， 2g/L 半乳糖及适量微量元素 ( 氯化锌、 硫酸锌和氯化锰 ) 等 ； 将脂肪干 细胞诱导成平滑肌细胞的平滑肌诱导剂也有多种组成， 例如 ： 含 5ng/mL TGF-β1 和 50ng/ mLPDGF-BB 的 M-199 诱导液。
步骤 2) 所述涂覆材料是具有自组装特性的高细胞亲和力的生物材料， 如胶原、 纤 维蛋白原、 matrigel 等生物材料中的一种或多种 ； 其使用浓度优选 0.01mg/ml ～ 100mg/
ml ； 其中， 步骤 iii) 所述的培养是将包含平滑肌细胞的涂覆材料与脂肪细胞微球均 匀混合后， 在一定的培养空间内静置培养， 直至涂覆材料充分与微球表面结合并相互发生 自组装作用， 然后常规培养或脉动培养直至平滑肌细胞贴附到涂覆材料上并铺展生长 ； 此 时采用的培养液是对应的诱导平滑肌细胞的培养液， 详细成分在前面已有罗列， 是公知技 术； 培养条件是常规的培养平滑肌细胞的条件。步骤 iii) 所述的培养时间优选为 24 ～ 72 小时。
如无特别指明， 本文提及的培养除脉动培养之外都是在二氧化碳培养箱中培养。
所述步骤 iv) 中所述复合内皮细胞的方法为 ： 将内皮细胞悬液作为培养液， 将步 骤 iii) 制备的组织利用脉动培养或普通培养方式进行培养， 使内皮细胞附着在通道的内 壁， 形成外壁为平滑肌细胞、 内壁为内皮细胞的血管组织。 采用的培养基和培养条件是本领 域诱导内皮细胞常用的， 由本领域技术人员依据本领域的公知技术决定。
具体的说， 将平面培养的内皮细胞消化离心后均匀悬于成内皮诱导培养液中 ； 将 混合了涂覆材料的脂肪细胞微球与内皮细胞悬液均匀混合， 混合均匀后内皮悬液就在微球 之间的空隙， 即通道中 ； 常规平面培养或脉动培养至内皮细胞贴附到微球和通道表面， 并使 得临近微球表面的内皮细胞连接起来 ； 最终形成由向外依次为内皮细胞层、 平滑肌细胞层、 涂覆材料层、 脂肪细胞团簇的复合结构的管道， 得到血管 / 脂肪细胞体系。
所述非接触式高压静电法制备微球可采用中国专利申请 200910079726.8 的非接 触式高压静电发生器进行 ； 所述脉动培养可选用中国专利申请 200910079726.8 的脉动培 养器进行， 因此， 本发明将中国专利申请 200910079726.8 作为参考文献。
如上所述， 本发明的具体实施方法如下 ：
其操作流程见图 2。采用抽脂手术获得病人自体脂肪干细胞， 常规培养增殖 至足够数量 ； 取出一部分脂肪干细胞采用非接触式高压静电发生器 ( 见中国专利申请 200910079726.8) 制成固态脂肪干细胞微球， 囊芯材料为海藻酸钠基水凝胶材料， 如海藻酸 钠、 海藻酸钠 / 胶原、 海藻酸钠 / 明胶、 海藻酸钠 / 纤维蛋白原中的一种或多种， 固化液为氯 化钙溶液。对脂肪干细胞微球进行成脂培养， 形成材料包裹的高浓度脂肪细胞团簇 ；
对部分脂肪干细胞进行成平滑肌诱导以形成平滑肌细胞， 将其消化、 离心、 收集 后均匀分散于胶原、 纤维蛋白原、 matrigel 等涂覆材料溶液中， 调整平滑肌细胞的密度为 6 8 10 ～ 10 个 /ml， 涂覆材料浓度为 0.01mg/ml ～ 100mg/ml ； 将包含平滑肌细胞的涂覆材料 与脂肪细胞微球均匀混合后在受限的空间内静置培养足够时间， 优选 24 ～ 72 小时， 使涂覆 材料充分与微球表面结合并相互发生自组装作用， 常规培养或脉动培养直至平滑肌细胞贴 附到涂覆材料上并铺展生长 ；
对部分脂肪干细胞进行成内皮诱导以形成内皮细胞， 将其消化、 离心、 收集后均匀 分散于贴附了平滑肌细胞的微球体系中， 常规培养或脉动培养直至内皮细胞贴附到平滑肌 层和通道表面。
所述培养是在一定的培养空间进行的， 所述培养空间可选择各种本领域常用的培 养用具所形成的空间， 如离心管、 12 孔板等， 优选的， 培养空间应该能够使脂肪细胞微球可 在至少一个方向形成至少两层， 使两层微球之间可以形成一定长度的贯通通道 ； 另外， 为使 获得的可注射的脂肪组织， 更优选小于注射用针管的空间， 当然也可采用较大的培养空间
构建较大体积的血管化脂肪组织， 注射时将构建的血管化脂肪组织分割成适当尺寸即可。
采用非接触式高压静电发生器制血管化细胞因子 ( 如 bFGF， VEGF 等 ) 缓释微球。
然后， 将复合了平滑肌细胞和内皮细胞的脂肪细胞微球体系与生长因子微球均匀 混合， 获得注射式血管化脂肪组织 ( 见图 1 的示意图 )， 随后可继续进行常规培养或脉动培 养， 或者将其吸入一次性注射器中， 注入患者需要修复或塑性的部位。 由于控制了细胞微球 和生长因子微球的粒径， 血管化生长因子微球将分布于细胞微球体系的通道中。该混合体 具有预先构建的仿生微血管结构， 随着扩散过程和载体材料的降解， 生长因子逐渐被释放 出来， 促进微血管的继续发育和成熟以及毛细血管网的形成。
血管化是组织工程领域普遍面临的一个重要的、 亟待解决的问题。本发明的血管 构建方法， 通过微血管结构的直接构建和毛细血管的诱导生成， 能够解决组织移植后被吸 收的问题， 为组织修复提供了很好的解决方法。
基于自体细胞的血管化脂肪组织的构建方法结合了细胞微球制备技术、 生长因子 缓释技术以及脉动生物反应器体外培养技术。 微球中的天然材料为细胞提供多孔三维微环 境， 能作为维持细胞正常生命活动的物理支持和结构空间 ； 具有很高的机械强度， 能保护脂 肪细胞在基础和成形的过程中不受损伤 ； 能构建局部高浓度细胞簇， 形成仿生囊状结构， 对 细胞的空间定位进行调控， 同时能实现多种细胞的混合和复合体系， 是体外再造组织的基 础； 微球表面和微球之间的空隙为血管化提供了预留空间和血管通道。生长因子缓释系统 是调控细胞生长分化和组织发育的重要手段。脉动培养对结构体的体外培养能提供循环 的、 脉动培养系统， 促进了血管化过程。
本发明所述的血管化脂肪组织完全采用自体细胞， 在模拟天然脂肪组织成分和结 构特点的基础上， 用天然生物材料包裹细胞形成微米级小球， 利用小球间的孔隙作为血管 形成的通道， 通过复合自体平滑肌细胞和内皮细胞形成血管结构围绕的高浓度脂肪细胞团 簇， 可在体外形成具有微血管结构的类脂肪组织。 结合血管化因子缓释系统， 可构建出可注 射式的血管化脂肪组织。
本发明所述的血管化脂肪组织采用注射式的手术方式， 创伤小， 术后恢复快， 能被 患者普遍接受。 血管化因子缓释系统能在体内诱导毛细血管网生成并促进微血管系统的进 一步发育和成熟， 最终随着生物材料的降解和自体细胞与患者机体的融合， 形成能在体内 长期稳定存在的自体脂肪组织。根据本发明， 可在体外和体内得到由自体细胞和可降解生 物材料构成的血管化脂肪组织， 该人工脂肪组织具有脂肪细胞团簇和血管结构， 细胞因子 缓释微球混合在血管中， 在体内诱导毛细血管网生成并长期稳定存在。
而且， 本发明采用的细胞微球制备技术、 血管构建技术、 生长因子缓释技术和脉动 培养技术能为体外各种干细胞的生长分化和构建其他组织 ( 如肝组织、 乳腺组织等 ) 等研 究提供模型和平台。 附图说明
图 1 为血管化脂肪组织结构体构建示意图。
图 2 为实施方法流程图。
图 3 为光学显微镜下的可注射式血管化脂肪组织 ； A： 整体， 标尺 ： 50 微米 ； B： 针对 脂肪细胞的油红 O 染色， 标尺 ： 50 微米 ( 脂肪细胞呈红色 ) ； C： 微血管结构观察， 标尺 ： 10 微米； D： 生长因子缓释系统观察， 标尺 ： 100 微米。 具体实施方式
以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 如无特别指明， 实施例 中所用的生长因子和试剂均购自 Sigma 公司。
实施例 1 脂肪细胞微球的制备
采用抽脂手术获得患者的自体脂肪， 以磷酸缓冲液冲洗脂肪组织后， 然后加入 0.75g/L I 型胶原酶， 37 ℃震荡、 消化 60min， 胎牛血清终止消化。1200r/min 离心 10min， 去上清液及悬浮的残存组织， 重悬细胞， 加入 2 倍体积的红细胞裂解液 (NH4Cl 154mmol/ L+KHCO310mmol/L+EDTA 0.1mmol/L) 静置 10min， 离心、 弃上清液。用适量的 PBS 液清洗 3 次， 200 目筛网过滤， 得到脂肪组织干细胞。
将所得脂肪组织干细胞接种于 25cm2 的培养瓶， 加 5mL 含体积分数为 0.10 胎牛血 清的高糖 DMEM 培养基， 混合均匀， 置于 37℃、 体积分数为 0.05 的 CO2 饱和湿度培养箱内培 养。相差显微镜观察细胞形态特征及增殖情况， 36 ～ 48h 后首次换液， 以后每 72h 换液 1 次。待细胞融合至超过培养瓶底 80％时， 常规胰酶消化传代。常规培养增殖至足够数量。 取第四代到第十代之间生长至融合期的脂肪干细胞， 采用海藻酸钠 / 胶原体系作 为成囊材料， 用非接触式高压静电发生器制成固态脂肪干细胞微球 ：
1. 用磷酸缓冲液溶解海藻酸钠， 用 2％的乙酸溶解胶原制成溶液。将两者混合为 海藻酸钠和胶原最终浓度分别为 3％ (w/w) 和 0.1mg/ml 溶液并 1mM 的 NaOH 溶液调整 PH 值 至 7.2 左右。
2. 将脂肪干细胞以 106 个 /ml 的密度与载体材料溶液均匀混合后装入容积为 10ml 的一次性针管。
3. 连接非接触式高压静电微囊发生器， 高压静电发生装置采用 SA167-Y( 天津 ) 高 压电场发生器， 输出电压 10kV ； 成囊液推进装置采用 LongerPump 公司 TS2-60 型注射泵， 推 进速度 10ml/h， 采用 10mL 注射器， 针尖与铜片间距离为 30mm， 推进速度为 10ml/h， 采用内径 为 250μm 的针头， 收集器为直径 60mm 的一次性塑料培养皿， 固化液为 200mmol/L 氯化钙溶 液。
4. 在 5 分钟内收集细胞微球， 用生理盐水洗涤两次后观察记录， 细胞微球形状圆 整光滑， 平均粒径约为 230μm。
用成脂培养液 ( 高糖 DMEM， 1％青链霉素原液， 10％胎牛血清， 0.5mmol/L 异丁基甲 基黄嘌呤 (IBMX)， 1μmol/L 地塞米松， 10μmol/L 胰岛素， 200μmoL/L 吲哚美辛 ) 在 37℃， 体积分数为 0.05 的 CO2 饱和湿度培养箱内培养脂肪干细胞微球约 10 天， 得到海藻酸钠 / 胶 原包裹的高浓度脂肪细胞团簇。
实施例 2 体外血管结构的构建
脂肪干细胞进行成平滑肌细胞诱导 ： 取第四代到第十代之间常规培养的脂肪干细 胞， 用成平滑肌培养液 ( 含 5ng/mL TGF-β1 和 50ng/mLPDGF-BB 的 M-199 培养基 ) 于 37℃、 体积分数为 0.05 的 CO2 饱和湿度培养箱内培养 10 天。收集 108 个平滑肌细胞， 离心沉淀后 备用。
将胶原原液用成平滑肌培养液稀释至略大于 1mg/ml 后用 1mMNaOH 中和并最终定
容至 1mg/ml。将 108 个平滑肌细胞加入胶原溶液并均匀混合后作为涂覆材料。
将 1ml 涂覆材料与 1ml 脂肪细胞微球均匀混合后装入离心管， 此时细胞微球由于 密度较大沉于底部。800r/min 的转速离心 5min， 使得涂覆材料充分与底部的脂肪细胞微球 接触。去上清， 加入新鲜的成平滑肌培养液， 在离心管中静置培养 72 小时， 使得涂覆材料均 匀分布在微球表面并通过自组装作用将局部微球连接成整体， 同时形成局部通道作为构建 微血管的空间， 此时可观察到平滑肌细胞在微球表面铺展。
脂肪干细胞进行成内皮细胞诱导 ： 取第四代到第十代之间常规培养的脂肪干细 胞， 用成内皮培养液 ( 含 2 ％胎牛血清， 2 ％马血清， 10ng/mL VEGF， 2ng/mL bFGF， 1×ITS， 0.61g/L 尼 克 酰 胺， 0.1μmol/L 地 塞 米 松， 2g/L BSA， 0.1g/L 鸟 氨 酸， 0.03g/L 脯 氨 酸， 0.73g/L 谷氨酰胺， 1g/L 葡萄糖， 2g/L 半乳糖及适量微量元素 ( 氯化锌、 硫酸锌和氯化锰 等 ) 的低糖 DMEM 培养基 ) 于 37℃、 体积分数为 0.05 的 CO2 饱和湿度培养箱内培养 10 天。 7 收集 10 个内皮细胞， 离心沉淀后备用。
吸收离心管中的上层培养液后加入 107 个内皮细胞， 混合均匀后脉动培养或普通 培养是内皮细胞与涂覆材料和通道表面结合， 继续脉动培养或普通培养复合了血管成分细 胞的脂肪细胞微球使得临近微球表面的内皮细胞连接起来。 实施例 3
采用非接触式高压静电发生器制备血管化生长因子 (bFGF 和 VEGF) 缓释微球。
1. 将海藻酸钠用 PBS 缓冲溶液配置成 1.5％ (w/w) 的溶液。
2. 将 bFGF 和 VEGF 以 2ng/ml 和 10ng/ml 的浓度与成囊溶液均匀混合后装入容积 为 10ml 的一次性针管。
3. 连接非接触式高压静电微囊发生器， 工作电压 7kV， 针尖与铜片间距离为 20mm， 推进速度为 30ml/h， 采用内径为 191μm 的针头， 收集器为直径 60mm 的一次性塑料培养皿， 固化液为 100mmol/L 氯化钡溶液。
4. 在 5 分钟内收集生长因子微球， 用生理盐水洗涤两次后观察记录， 细胞因子缓 释微球的形状圆整光滑， 粒径为 30μm。
5. 注意在整个过程中尽量保持低温。
实施例 4
将复合了血管成分的脂肪细胞微球体系与生长因子微球以 1 ∶ 1 的体积比均匀混 合后装入 1ml 注射器中， 即可用常规自体脂肪颗粒注射的手术方式注入患者体内。最终形 成的移植物如图 3 所示。
实施例 5
取常规培养的脂肪干细胞采用海藻酸钠 / 明胶体系作为成囊材料， 用非接触式高 压静电发生器制成固态细胞微球 ：
1. 将海藻酸钠的溶液和明胶溶液 ( 溶剂 PBS 缓冲溶液 ) 混合为最终浓度分别为 1.8％ (w/w) 和 3％ (w/w) 的溶液。
2. 将脂肪干细胞以 106 个 /ml 的密度与成囊溶液均匀混合后装入容积为 10ml 的 一次性针管。
3. 连接非接触式高压静电微囊发生器， 高压静电发生装置采用 SAl67-Y( 天津 ) 高 压电场发生器， 输出电压 10kV ； 成囊液推进装置可采用 LongerPump 公司 TS2-60 型注射泵，
采用 5mL 注射器， 针尖与铜片间距离为 10mm， 推进速度为 10ml/h， 采用内径为 191μm 的针 头， 收集器为直径 60mm 的一次性塑料培养皿， 固化液为 200mmol/L 氯化钙溶液。
4. 在 5 分钟内收集细胞微球， 用生理盐水洗涤两次后观察记录， 细胞微球形状圆 整光滑， 粒径为 300μm。
采用成脂培养液 ( 高糖 DMEM， 10 ％胎牛血清， 0.5mmol/L IBMX， 1μmol/L 地塞米 松， 10μmol/L 胰岛素， 1％青链霉素原液 ) 于 37℃、 体积分数为 0.05 的 CO2 饱和湿度培养 箱内培养干细胞微球约 10 天， 得到海藻酸钠 / 明胶包裹的高浓度脂肪细胞团簇。
实施例 6
脂肪干细胞进行成平滑肌细胞诱导 ： 取第四代到第十代之间常规培养的脂肪干细 胞， 用成平滑肌培养液 ( 含 5ng/mL TGF-β1 和 50ng/mLPDGF-BB 的 M-199 培养基 ) 于 37℃、 体积分数为 0.05 的 CO2 饱和湿度培养箱内培养 10 天。收集 108 个平滑肌细胞， 离心沉淀后 备用。
将固态纤维蛋白原用成平滑肌培养液稀释至 10mg/ml 后将 108 个平滑肌细胞加入 胶原溶液并均匀混合后作为涂覆材料。
将 1ml 涂覆材料与 1ml 脂肪细胞微球均匀混合后装入离心管， 此时细胞微球由于 密度较大沉于底部。1000r/min 的转速离心 4min， 使得涂覆材料充分与底部的脂肪细胞微 球接触。去上清， 加入新鲜的成平滑肌培养液， 在离心管中静置培养 48 ～ 72 小时， 使得涂 覆材料均匀分布在微球表面并通过自组装作用将局部微球连接成整体， 同时形成局部通道 作为构建微血管的空间， 此时可观察到平滑肌细胞在微球表面铺展。 脂肪干细胞进行成内皮细胞诱导 ： 取第四代到第十代之间常规培养的脂肪干细 胞， 用成内皮培养液 ( 含 2 ％胎牛血清， 2 ％马血清， 10ng/mL VEGF， 2ng/mL bFGF， 1×ITS， 0.61g/L 尼 克 酰 胺， 0.1μmol/L 地 塞 米 松， 2g/L BSA， 0.1g/L 鸟 氨 酸， 0.03g/L 脯 氨 酸， 0.73g/L 谷氨酰胺， 1g/L 葡萄糖， 2g/L 半乳糖及适量微量元素 ( 氯化锌、 硫酸锌和氯化锰 等 ) 的低糖 DMEM 培养基 ) 于 37℃、 体积分数为 0.05 的 CO2 饱和湿度培养箱内培养 10 天。 7 收集 10 个内皮细胞， 离心沉淀后备用。
吸收离心管中的上层培养液后加入 107 个内皮细胞， 混合均匀后脉动培养或普通 培养是内皮细胞与涂覆材料和通道表面结合， 继续脉动培养或普通培养复合了血管成分细 胞的脂肪细胞微球使得临近微球表面的内皮细胞连接起来。
实施例 7 脉动体外培养过程
脉动生物反应器见本发明的参考文献中国专利申请 200910079726.8。
采用产自崇州市崇阳众诚不锈钢配件服务部的蠕动泵 JD-200 来提供相应的循环 动力， 设定其工作电压为 12V， 流速为 60ml/min ； 直流电机选用产自北京艾克斯公司的电 机 ZGB37RH52i， 设定其工作电压为 12V、 转速为 100r/min ； 采用 100ml 的注射器 ； 将自制导 杆和滑块导轨， 以及各部件， 如直流电机、 导杆、 滑块导轨、 注射器用自制的支架固定在底板 上， 连接各部件。
培养液循环部分由培养液瓶、 蠕动泵和培养盒构成， 各部分由硅胶管连接， 培养液 经硅胶管由蠕动泵从培养液瓶泵入培养盒 ( 内置人造脂肪组织 )， 然后经硅胶管流回培养 液瓶 ； 导轨滑块、 注射器和直流电机构成脉动部分， 直流电机与导轨滑块连接推动注射器活 塞往复运动， 注射器与蠕动泵的出液端连接后和培养盒连接， 由此形成脉动流 ； 压力表设置
在培养盒上， 检测置于培养盒内的脂肪组织内的培养液压力。
在进行体外培养以前， 先拆卸脉动生物反应器的连接管、 注射器， 利用高温高压灭 菌。 然后接通脉动生物反应器， 蠕动泵和直流电机接通， 首先在培养液瓶中加入少量 75％的 酒精， 利用酒精在脉动循环系统中流动灭菌 ； 倒掉酒精然后在培养液瓶中加入一定量已灭 菌的 PBS 溶液， 利用该溶液冲洗残余酒精。
关掉电源， 然后在培养液瓶中加入待培养需使用的培养液， 用灭菌好的镊子夹住 实施例 4 制备的人工脂肪组织接到培养盒的接头上。为使人工组织牢固地接在接头上， 用 已灭菌的细线固定人造组织的两头。 待脉动生物反应器系统完全连接好后， 接通电源， 调整 蠕动泵的电压为 12V， 调节人造组织处所受压力到 0.1Mpa， 然后就可以持续运行脉动生物 反应器对人造组织进行脉动培养了。
在培养过程中保持上述电压和脂肪组织的压力， 使线性控制脉动培养过程中脉动 频率在 100 次 /min。
直流电机运行平稳后， 带动滑块在导轨上推动注射器活塞往复运动， 活塞拉出的 时候从培养液瓶中吸取培养液， 挤出时把吸入的培养液注入蠕动泵形成的循环系统中流经 培养盒中的人造组织流回培养液瓶。通过调节注射器每次吸入、 挤出的培养液的量可调节 培养人造组织处的压力。 由此， 蠕动泵和直流电机持续运动， 脉动生物反应器就提供了一个 脉动循环的培养液流实现了对人造组织的脉动培养。