ACL在筛选防治肥胖相关代谢紊乱疾病的药物中的应用.pdf

本发明公开了一种ATP柠檬酸裂合酶(ACL)的拮抗剂的用途，用于制备预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的组合物。本发明还公开了一种非常有效的ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂。本发明还公开了一种筛选预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的潜在物质的方法。

1.  一种ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的组合物。

2.  如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的糖脂代谢紊乱相关疾病选自：肥胖、2型糖尿病或脂肪肝。

3.  如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂是：特异性干扰ATP柠檬酸裂合酶表达的siRNA分子，所述的siRNA分子具有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；或具有与SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列互补的序列；或者
所述的ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂是：特异性干扰ATP柠檬酸裂合酶表达的shRNA分子，所述的shRNA分子具有以下式I结构：
Seq_正向-X-Seq_反向        式I，
式I中，Seq_正向具有选自SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的序列，或具有与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列互补的序列；
Seq_反向为与Seq_正向基本互补的核苷酸序列；
X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

4.  如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于：
抑制肝脏中的糖异生；或
抑制磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；或
抑制葡萄糖-6-磷酸酶的表达；或
抑制FAS、SCD1、Elovl6、GPAT或DGAT2的表达。

5.  一种预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的siRNA分子，其特征在于，所述的siRNA分子具有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；或与SEQID NO：6或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列互补的序列。

6.  一种预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的shRNA分子，其特征在于，所述的shRNA分子具有以下式I结构：
Seq_正向-X-Seq_反向        式I，
式I中，Seq_正向具有选自SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的序列，或具有与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列互补的序列；
Seq_反向为与Seq_正向基本互补的核苷酸序列；
X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

7.  如权利要求6所述的shRNA分子，其特征在于，所述的shRNA具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示的序列；或具有与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：4所示的序列互补的序列。

8.  一种重组腺病毒载体，其特征在于，所述的腺病毒载体中含有权利要求6或7所述的shRNA分子。

9.  一种预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的组合物，其特征在于，所述的组合物含有：
有效量的权利要求5所述的siRNA分子，或权利要求8所述的重组腺病毒载体，以及
药学上可接受的载体。

10.  一种筛选预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的潜在物质的方法，其特征在于，所述的方法包括：
(1)用候选物质处理具有表达ATP柠檬酸裂合酶的细胞；和
(2)检测所述细胞中ATP柠檬酸裂合酶的表达或活性；
其中，若所述候选物质可降低ATP柠檬酸裂合酶的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的潜在物质。

ACL在筛选防治肥胖相关代谢紊乱疾病的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，更具体地，本发明涉及ACL在筛选防治肥胖相关代谢紊乱疾病的药物中的应用。
背景技术
近年来随着我国工业化、城市化和生活现代化的推进，肥胖、2型糖尿病和心血管疾病等慢性代谢疾病呈现急剧高发态势，严重威胁国民的健康和生活质量。而目前临床药物大多疗效差、副作用大。在国际范围内，针对肥胖与2型糖尿病本身的特异性药物靶点是各国医药工业苦苦探寻的研发目标。
由于脂肪合成与糖脂代谢紊乱有密切的关系，因此以脂肪合成信号通路或其相关蛋白作为筛选防治肥胖或糖尿病的药物是一种可行的药物筛选策略。然而，在复杂的脂肪合成信号网络调控系统中，影响一个分子，往往会带来大量未知的后果，造成大量的副作用。因此，在基于脂肪合成途径筛选药物的过程中，合适的药物靶点的选择是非常困难的。
综上，本领域迫切需要寻找合适的糖脂代谢紊乱防治药物的靶点，从而为药物筛选和研发提供有效的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ATP柠檬酸裂合酶(ACL)的拮抗剂及其用途，用于制备预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的组合物。
本发明的另一目的在于提供一种筛选预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的潜在物质的方法。
在本发明的第一方面，提供一种ATP柠檬酸裂合酶(ACL)的拮抗剂的用途，用于制备预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的组合物。
在另一优选例中，所述的糖脂代谢紊乱相关疾病选自：肥胖、2型糖尿病或脂肪肝。
在另一优选例中，所述的ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂是：特异性干扰ATP柠檬酸裂合酶表达的siRNA分子，所述的siRNA分子具有SEQ ID NO：6或SEQID NO：9所示的核苷酸序列；或具有与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列互补(优选完全互补)的序列。
在另一优选例中，所述的ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂是：特异性干扰ATP柠檬酸裂合酶表达的siRNA分子或shRNA分子，所述的shRNA分子具有以下式I结构：
Seq_正向-X-Seq_反向        式I，
式I中，Seq_正向具有选自SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的序列，或具有与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列互补(优选完全互补)的序列；
Seq_反向为与Seq_正向基本互补的核苷酸序列；
X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。
在另一优选例中，所述的shRNA具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示的序列；或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示的序列互补的序列。更佳的，所述的shRNA分子具有SEQ ID NO：4所示的序列或与SEQ ID NO：4所示的序列互补的序列。
在另一优选例中，X具有3-10个核苷酸，优选的具有4-6个核苷酸。
在另一优选例中，所述的组合物还用于：
抑制肝脏中的糖异生；或
抑制磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)；或
抑制葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)的表达；或
抑制FAS、SCD1、Elovl6、GPAT或DGAT2的表达。
在本发明的第二方面，提供一种预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的siRNA分子，所述的siRNA分子具有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；或与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列互补的序列。
在本发明的第三方面，提供一种预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的shRNA分子，所述的shRNA分子具有以下式I结构：
Seq_正向-X-Seq_反向    式I，
式I中，Seq_正向具有选自SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的序列，或具有与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列互补(优选完全互补)的序列；
Seq_反向为与Seq_正向基本互补的核苷酸、序列；
X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。
在另一优选例中，所述的shRNA具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示的序列；或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示的序列互补的序列。
更佳的，所述的shRNA分子具有SEQ ID NO：4所示的序列；或与SEQ IDNO：4所示的序列互补的序列。
在本发明的第四方面，提供一种重组腺病毒载体，所述的腺病毒载体中含有所述的shRNA分子。
在本发明的第五方面，提供一种预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的组合物，所述的组合物含有：
有效量的所述的siRNA分子，或所述的重组腺病毒载体，以及
药学上可接受的载体。
在本发明的第六方面，提供一种筛选预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括：
(1)用候选物质处理具有表达ATP柠檬酸裂合酶的细胞；和
(2)检测所述细胞中ATP柠檬酸裂合酶的表达或活性；
其中，若所述候选物质可降低ATP柠檬酸裂合酶的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的潜在物质。
在另一优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达ATP柠檬酸裂合酶的细胞；和/或
步骤(2)包括：检测测试组的细胞中ATP柠檬酸裂合酶的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达ATP柠檬酸裂合酶的细胞；
如果测试组中ATP柠檬酸裂合酶的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低95％以上)对照组，就表明该候选物是预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的潜在物质。
在另一优选例中，所述方法还包括：设置另一对照组，该对照组是添加所述候选物质的且不表达ATP柠檬酸裂合酶的细胞。
在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病有用的物质。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1八周大的db/db小鼠(n＝7-8/group)用重组腺病毒Ad-shLacZ或Ad-shACL处理两周后，取出新鲜的肝脏组织。
(a)左：蛋白免疫印迹方法检测肝脏及白色脂肪组织(WAT)中ACL的表达。右：酶动力法检测肝脏中ACL的活性。
(b，c)液相层析及二级质谱联用法检测肝脏中Acetyl-CoA(b)和Malonyl-CoA(c)的浓度。其中，与Ad-shLacZ处理组小鼠相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01。
图2(a)肝脏重量(左)，肝脏中甘油三脂(TG)含量(中)及肝脏中胆固醇浓度(CHO，右)。
(b)肝脏石蜡切片的HE染色。
(c)常规的荧光实时定量PCR技术研究肝脏中基因的表达：氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)(左)；脂肪酸和成酶(FAS)，乙酰辅酶A羧化酶(ACC)1，ELOVL家族成员6，长链脂肪酸延长酶(Elovl)-6和硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)-1(中)；甘油-3-磷酸乙酰转移酶(GPAT)，乙酰A：二乙酰甘油乙酰转移酶(DGAT)1和2(右)。其中，与Ad-shLacZ处理组小鼠相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01。
图3感染了腺病毒Ad-shLacZ或Ad-shACL的db/db小鼠体重(左)及全身脂肪含量(右)。
图4a db/db小鼠在Ad-shLacZ或Ad-shACL处理后，不同时间点的饥饿血糖。
图4b葡萄糖耐受实验。其中，与Ad-shLacZ处理组小鼠相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01。
图4c为由b计算出的曲线下面积，更为直观地表达出了变化。
图5小鼠的新陈代谢速率以及机体的生理活性。其中，a为昼夜呼吸耗氧量(VO₂)；b为昼夜呼吸熵(RER)；c为昼夜运动量(Activity)。
图6定量RT-PCR分析肝脏mRNA水平的糖异生分子PEPCK，G6Pase和PGC-1的表达。在db/db小鼠感染腺病毒Ad-shLacZ或Ad-shACL15天后正常喂食状态，以及感染23天后饥饿状态的不同表达。其中，与Ad-shLacZ处理组小鼠相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01。
图7在MEF细胞中不同的针对ACL的shRNA(1#～4#)抑制ACL表达的效率，以Ad-shLacZ和Ad-GFP作为对照。以β-肌动蛋白的mRNA表达作为表达阳性参照。
图8在野生型(WT)和db/db肥胖小鼠肝脏和白色脂肪(WAT)组织中分别检测ACL的表达量，其中，
图8A ACL mRNA水平的检测结果；
图8B ACL蛋白水平的检测结果；
图8C ACL活性的检测结果。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，发现抑制ATP柠檬酸裂合酶(ACL)的表达(特别是抑制ACL在肥胖糖尿病个体中的过表达)可良好地降低哺乳动物的脂代谢紊乱或糖代谢紊乱的发生，且给予ATP柠檬酸裂合酶的拮抗分子对于哺乳动物不产生显著的副作用，也即不影响哺乳动物体内的其它蛋白或信号通路。因此ATP柠檬酸裂合酶可作为糖脂代谢紊乱相关疾病(特别是脂肪肝或2型糖尿病)防治药物研发中良好的药物筛选靶点。
此外，本发明人经过反复试验比较，提供了一组对于抑制ACL的表达(特别是ACL在肥胖糖尿病个体中过表达)非常有用的siRNA和shRNA，其具有非常高的抑制效率(高于95％)。
如本文所用，术语“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由  构成”、“基本上由  构成”、和“由  构成”。
ACL作为分子靶点的有效性
本发明人利用高脂膳食诱导的肥胖小鼠模型，发现了ATP-柠檬酸裂合酶(ACL)受到不同营养状况的精细调节。ACL是柠檬酸循环中一个成员，是许多组织中负责生成胞质乙酰辅酶A的主要酶。
本发明人的研究发现，瘦素对ACL具有负调控作用，而ACL在糖脂代谢平衡与瘦素介导的代谢调控中扮演非常重要的角色。在瘦素信号传导失效的db/db肥胖与糖尿病小鼠模型中，ACL的表达显著失控，大大高于野生型小鼠。在此db/db小鼠模型中，本发明人进一步研究结果发现，ACL不仅在脂代谢平衡和脂代谢紊乱中发挥重要功能，而且在葡萄糖代谢平衡中也很重要，证明ACL能够作为治疗和预防与肥胖相关的代谢紊乱疾病-特别是糖尿病和脂肪肝的新的药物靶点，医学应用价值非常大。
在本发明的实施例中，通过基因沉寂的方法，在db/db小鼠的肝脏中特异抑制ACL的表达后，小鼠的肥胖程度有明显的改观，特别是在ACL抑制15天后，db/db小鼠的脂肪肝现象几乎完全消失，血糖下降到与野生型相当。葡萄糖耐受实验表明，db/db小鼠机体的葡萄糖耐受能力得到了明显的改善，几乎表现出完全正常的清糖能力。这些表型变化之明显及快速，无疑为临床提供了一个新的治疗肝脏脂肪多度沉积、尤其是降血糖的靶点。
ACL作为分子靶点的特异性、安全性和可行性
糖脂代谢是一个复杂的过程，涉及到许多蛋白以及多种信号通路的影响。尽管许多蛋白参与到糖脂代谢的过程中，然而多数蛋白无法作为调控糖脂代谢的有效靶点，也即对一些蛋白进行调控无法达到控制糖脂代谢的目的。并且，目前的实践中还发现，对于一些相关蛋白的抑制还会造成副作用，无法应用于实际。
本发明人在经过广泛的研究后，最终发现ACL可作为调控糖脂代谢的有效靶点，对其进行调控可非常有效地调控糖代谢紊乱或脂代谢紊乱，且不影响体内其它蛋白的表达或其它信号通路的正常运行。
并且，本发明人发现，以代谢酶作为分子靶点，与其它蛋白如基因转录因子或细胞膜蛋白作为药物靶点相比，更具有良好的可调节性，从而作用结果更加特异，也因此更有安全性和可塑性。如果用信号通路上的其它一些分子作为靶点，可能治疗肥胖和降糖的效果相当，但是由于信号分子往往位于复杂的信号网络调控系统中，影响一个分子，会带来大量未知的后果，造成大量的副作用。
ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂及其用途
基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种ATP柠檬酸裂合酶的用途，其可用于筛选预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的物质。也即，筛选通过抑制ATP柠檬酸裂合酶的表达或活性，进而预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的物质。
本发明还提供了一种ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂的用途，用于制备预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的组合物。抑制ATP柠檬酸裂合酶对于肥胖、2型糖尿病或脂肪肝等的抑制是特别有效的。
如本文所用，所述的拮抗剂包括了抑制剂、下调剂、阻断剂等。
任何可特异性抑制ATP柠檬酸裂合酶的活性，降低ATP柠檬酸裂合酶的稳定性，抑制ATP柠檬酸裂合酶的表达，或抑制ATP柠檬酸裂合酶的转录或翻译的物质均可用于本发明，作为防治糖脂代谢紊乱相关疾病的有效物质。
作为本发明的一种方式，所述的ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂是一种ATP柠檬酸裂合酶特异性的干扰分子(例如包括siRNA，shRNA，或反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides))。
作为本发明的一种优选方式，所述的干扰分子是小干扰RNA。其中“小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)”是指一种短片段双链分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA。所述的小干扰RNA具有SEQID NO：6或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；或与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列互补的序列。更优选的，所述的siRNA具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列或具有与该序列互补的序列。
作为本发明的特别优选的方式，所述的干扰分子是小发夹RNA。所述的“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”是指能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，其能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。shRNA包含一条反义链和一条正义链，通过一个间隔序列相连。所述的shRNA有互补结构区，在杂交条件下形成“发夹”构象，在其中互补的正义链和反义链相连接。所述的shRNA在真核细胞内，可通过DICER酶的作用，形成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。
在筛选有效的shRNA序列时，还需进行比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人起初设计合成了多种shRNA序列，并将它们分别组装入腺病毒载体进行验证，结果发现四对shRNA干扰效果相对较好，它们分别具有SEQ IDNO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列。进一步地在细胞、动物水平实验后，结果证明具有SEQ ID NO：4序列的shRNA最为有效，对于体内试验而言抑制效率非常高，且副作用低。
因此，本发明提供一种特异性干扰ATP柠檬酸裂合酶表达的shRNA分子，所述的shRNA分子具有以下式I结构：
Seq_正向-X-Seq_反向  式I，
式I中，Seq_正向具有选自SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的序列，或具有与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列互补的序列；
Seq_反向为与Seq_正向基本互补的核苷酸序列；
X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。
并且，式I所示的结构在转入细胞后，可形成式II所示的二级结构：
式II，
式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，
||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的氢键。
在另一优选例中，所述的shRNA具有选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示的序列。更佳的，所述的shRNA分子具有SEQ ID NO：4所示的序列。
所述的“基本互补”或“基本上互补”指的是一条核苷酸序列对于另一条特定的核苷酸序列有至少80％，较佳的90％，更佳的95％，最佳的100％的互补性。
本发明的shRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。
在获得所述的可有效抑制ACL表达的shRNA后，需要通过特定的方法来将所述的shRNA特异性递送到细胞内或体内。这种特异性递送可通过多种不同的递送方法来完成。本发明人在研究中找到了一种特别有效的递送方法，以腺病毒作为载体，将所述的shRNA递送到靶细胞中。腺病毒可通过受体介导的细胞内摄途径进入细胞，核内体酸化后破裂，胞浆内病毒DNA于溶酶体降解之前释出，然后进入细胞核而变成附着体状态。更佳的，所述的腺病毒载体是Invitrogen公司的BLOCK-iT腺病毒表达载体系统。
筛选预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的物质的方法
在得知了所述的ATP柠檬酸裂合酶与糖脂代谢的相关性后，可以基于该机制筛选预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的潜在物质。可从所述的潜在物质中找到对于预防或治疗神经退行性疾病有用的物质。
因此，本发明提供了一种筛选预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括：
(1)用候选物质处理具有表达ATP柠檬酸裂合酶的细胞；和
(2)检测所述细胞中ATP柠檬酸裂合酶的表达或活性；
其中，若所述候选物质可降低ATP柠檬酸裂合酶的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的潜在物质。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到ATP柠檬酸裂合酶的表达或活性变化，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达ATP柠檬酸裂合酶的体系。
对于所用的细胞没有特别的限制，只要其中表达ATP柠檬酸裂合酶；通常，所述的细胞是一种真核细胞。作为本发明的优选方式，所述的细胞选自小鼠MEF，C2C12，或3T3-L1细胞。
这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制ATP柠檬酸裂合酶，从而预防或治疗糖脂代谢紊乱疾病有用的物质。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于防治糖脂代谢紊乱相关疾病有用的物质。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的防治糖脂代谢紊乱相关疾病的潜在物质。
组合物
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％)的所述的ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂，以及药学上或食品学上可接受的载体。
在得知了所述ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。
优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA)递送到靶点上，并使之表达活性ATP柠檬酸裂合酶的拮抗剂，具体情况需视所述的拮抗剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。
作为本发明的一种优选方式，提供了一种用于抑制淀粉样蛋白产生的组合物，所述的组合物含有有效量的本发明所述的ATP柠檬酸裂合酶特异性的siRNA分子或携带所述shRNA分子的腺病毒载体(如0.000001-50wt％)，以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体是在本质上对于人和/或动物无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质，并在本质上与所述的shRNA分子、任何所用到的靶向元件以及其它成分无作用。合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
本发明所述的siRNA分子或携带所述shRNA分子的腺病毒载体的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的siRNA分子或携带所述shRNA分子的腺病毒载体的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，所述干扰分子是重组腺病毒制剂时，每天以约0.0005-1pfu/g动物体重，较佳地0.005-0.5pfu/g动物体重，最佳地0.02-0.1pfu/g动物体重的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明的主要优点在于：
(1)首次发现抑制ATP柠檬酸裂合酶的表达可良好地降低哺乳动物的脂代谢紊乱或糖代谢紊乱的发生，且给予ATP柠檬酸裂合酶的拮抗分子对于哺乳动物不产生显著的副作用，也即不影响哺乳动物体内的其它蛋白或信号通路。因此ATP柠檬酸裂合酶可作为糖脂代谢紊乱相关疾病(特别是脂肪肝或2型糖尿病)防治药物研发中良好的药物筛选靶点。
(2)首次开发出对于抑制ATP柠檬酸裂合酶的表达特别有效的一类siRNA或shRNA分子。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明人的实验围绕肝脏中ACL在肥胖发生中具有的功能作用展开，以验证ACL是否可作为有效的治疗糖脂代谢紊乱的靶点。瘦素信号调控失效的db/db小鼠是国际上通用的研究肥胖、脂代谢异常及早期2型糖尿病的动物模型。db/db小鼠的表型为身体在性成熟后发胖，并伴随胰岛素抵抗血糖浓度升高。本发明人构建了特异针对ACL和LacZ(对照)的表达shRNA的重组腺病毒载体，而由于腺病毒主要定位于小鼠肝脏中，从而得以研究ACL在db/db小鼠肝脏中表达抑制后所带来的糖脂代谢变化。
实施例1.干扰RNA表达的试剂的制备
siRNA靶序列的选择
基于鼠ACL的序列，设定多个siRNA靶序列，排除与鼠ACL以外的其他基因序列互补的siRNA靶点。
经过反复的试验和筛选，结果确定4条针对鼠ACL的siRNA序列，分别如下：
5-GCUGAAUACCGAGGACAUUAA-3(SEQ ID NO：6)；
5-GCUUCAUCUCUGGUCUAUUCA-3(SEQ ID NO：7)；
5-GCAUGAGGUCACCAUCUUUGU-3(SEQ ID NO：8)；
5-GCAUUAAGCCUGGAUGCUUUA-3(SEQ ID NO：9)。
腺病毒载体的构建
使用Invitrogen BLOCK-iT Adenovira’l RNAi Expression System，具体方法可参见说明书。
设计如下shRNA：
1#(SEQ ID NO：1)：
5-CACCGCTGAATACCGAGGACATTAACGAATTAATGTCCTCGGTATTCAGC-3；
2#(SEQ ID NO：2)：
5-CACCGCTTCATCTCTGGTCTATTCACGAATGAATAGACCAGAGATGAAGC-3；
3#(SEQ ID NO：3)：
5-CACCGCATGAGGTCACCATCTTTGTCGAAACAAAGATGGTGACCTCATGC-3；
4#(SEQ ID NO：4)：
5-CACCGCATTAAGCCTGGATGCTTTACGAATAAAGCATCCAGGCTTAATGC-3。
携带shRNA的腺病毒的构建：化学合成上述序列的单链shRNA，将它们分别粘合成双链，然后分别构建到Invitrogen BLOCK-iT腺病毒表达载体上的多克隆位点内，在细胞水平测试表达载体的基因沉寂效率。选择相对有效的表达载体与腺病毒载体重组后，线性化载体，转入293A细胞(购自Invitrogen)中进行扩增，数天后收获病毒。
Ad-shLacZ的构建，设计shLacZ的序列为(SEQ ID NO：5)：
5-CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3
根据与前述构建Ad-shACL相同的方法，将shLacZ的序列转入腺病毒载体中，获得Ad-shLacZ，用于后续试验，作为对照。
本发明人分别利用小鼠MEF，C2C12及3T3-L1细胞测试了含有不同shRNA的腺病毒的基因沉寂效率。其中，将上述构建的含有相应shRNA的重组腺病毒载体转入小鼠MEF细胞后，检测细胞内ACL的表达抑制情况，获得的结果见图7。由该结果可见，细胞水平上，载有SEQ ID NO：1～4所示序列的腺病毒具有较好的基因沉寂效率。
在另外两种细胞C2C12及3T3-L1中的检测结果也显示，转入SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4所示序列的腺病毒具有优异的基因沉寂效率。
进一步进行动物试验，比较载有SEQ ID NO：1～4所示序列的腺病毒在尾静脉注射小鼠后，对于肝脏内ACL表达的影响。结果发现，当转入动物后，载有SEQ ID NO：2～3所示序列的腺病毒对于ACL表达的干扰效果不理想(低于20％)，而载有SEQ ID NO：1和4所示序列的腺病毒对于ACL表达的干扰效果非常高(高于95％)。对于给予载有SEQ ID NO：1和4所示序列的腺病毒的小鼠检测肝脏的谷丙转氨酶值，结果发现给予载有SEQ ID NO：1所示序列的腺病毒的小鼠的转氨酶值为121U/L(活性/每升血清)，高于正常值(通常为0-50U/L)，估计诱导了肝脏的炎症反应；而含有载有SEQ ID NO：4所示序列的腺病毒的小鼠的转氨酶值正常。因此可见载有SEQ ID NO：4所示序列的腺病毒效果最为优异，对动物产生的副作用低。
综上，对转入SEQ ID NO：4所示序列的腺病毒进行大规模扩增和纯化，将其称为Ad-shACL，用于后续试验。
含有SEQ ID NO：9所述siRNA的组合物的配制：采用20mM siRNA(溶于DEPC处理过的蒸馏水)；转染细胞时终浓度：10-30nM。
除非另外说明，在后续的实施例中，处理小鼠时，腺病毒的使用剂量是1×10⁹pfu Ad-shACL或Ad-shLacZ/小鼠，给药方式为尾静脉注射。
实施例2.ACL在肥胖动物肝脏中高表达
利用野生型(WT)和db/db肥胖小鼠，本发明人在小鼠肝脏和白色脂肪组织中分别检测了ACL的表达量。
实验结果发现，无论从mRNA水平(图8A)、蛋白水平(图8B)，还是活性水平(图8C)，ACL在db/db肥胖小鼠的肝脏中均明显上调，而在白色脂肪组织中，ACL的表达并没有明显变化。
实施例3.抑制肝脏中ACL可以大量减少脂肪酸合成的前体
利用前述构建的小干扰分子，通过RNA干涉(RNAi技术)的方法使ACL的表达受到抑制，来调查ACL在db/db小鼠肝脏中的对代谢的影响。
本发明人把瘦素信号调控失效的db/db小鼠(肥胖小鼠)(购自南京模式动物中心，由于是基因缺陷，为天生瘦素信号调控失效，断奶后出现明显肥胖)平均分为两组，分别用纯化后的腺病毒Ad-shLacZ(作为对照)或Ad-shACL处理(尾静脉注射)。两周后，发现Ad-shACL处理后，ACL在肝脏中基因沉寂的效率很高，无论从蛋白表达还是活性来看，都接近95％，见图1a，左图为蛋白免疫印迹方法检测肝脏及白色脂肪组织(WAT)中ACL的表达；右图为酶动力法检测肝脏中ACL的活性。
从小鼠的谷丙转氨酶水平作为评价，腺病毒感染8天后没有造成明显的功能损伤或炎症，见表1、图3。
感染病毒后小鼠的新陈代谢速率以及机体的生理活性见图5。其中，a为昼夜呼吸耗氧量(VO₂)；b为昼夜呼吸熵(RER)；c为昼夜运动量(Activity)。
表1：感染病毒后测得的生理学数据以及血样处理后的数据

代谢小分子的质谱分析发现，Ad-shACL组小鼠肝脏中的乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)和丙二酰辅酶A(Malonyl-CoA)分别下降了52％和71％(图1b，c)。在15天感染后，Ad-shACL能够几乎完全抑制ACL在肝脏中的表达，但对db/db小鼠的白色脂肪并没有影响。
Acetyl-CoA是ACL催化的直接产物，Malonyl-CoA则是Acetyl-CoA进一步被催化后生成的脂肪酸合成的前体。这些结果意味着，ACL催化的途径是肝脏中胞质Acetyl-CoA的主要来源；在肝脏中抑制ACL的表达，可以直接影响Malonyl-CoA的浓度，从而影响脂肪酸合成。
实施例4.抑制肝脏中ACL可以抑制肝脏中的脂肪合成，并逆转db/db小鼠的脂肪肝发生
进一步的实验结果表明，Ad-shACL处理的db/db肥胖小鼠肝脏重量下降了27％，肝脏中甘油三脂含量下降了52％，见图2a。
肝脏石蜡切片的HE染色结果发现，Ad-shACL处理的db/db肥胖小鼠肝脏中大量的脂滴几乎消失，见图2b。
荧光实时定量PCR的结果表明，Ad-shACL处理抑制ACL的表达后，肝脏中调控脂肪合成代谢的转录因子PPARγ明显下降。同时，肝脏中负责脂肪酸合成及甘油三脂合成的酶，如FAS、SCD1、Elovl6、GPAT及DGAT2均有明显下调，见图2c。
以上结果表明，仅在db/db小鼠肝脏中特异抑制ACL，就可以大大降低脂肪合成，从而逆转脂肪肝的生成。
实施例5.抑制肝脏中ACL可以降低db/db小鼠的基础血糖，并显著恢复系统清糖能力
另外，肝脏中的ACL沉寂可以明显降低瘦素信号调控失效的db/db小鼠的空腹血糖。在Ad-shACL处理16天后，小鼠的饥饿血糖和正常小鼠相当(91mg/dL)，与对照组(即Ad-shLacZ处理的瘦素信号调控失效的db/db小鼠)相比，降低了将近58％，见图4a。
葡萄糖耐受实验表明，Ad-shACL处理的db/db小鼠表现出了良好的清糖能力，见图4b，c。
这些数据说明，肝脏中的ACL跟db/db小鼠的高血糖及葡萄糖不耐受有强烈的因果关系。只要抑制肝脏ACL的表达，就可以使小鼠机体恢复糖代谢平衡。
实施例6.肝脏中ACL的缺失对db/db小鼠血糖的改善部分通过抑制肝脏中糖异生的活性实现
为了确定ACL是否能够调节全身经肝糖异生的葡萄糖代谢，本发明人通过常规的定量RT-PCR方法测定了糖异生的关键分子表达。糖异生途径在饥饿状况下激活，其中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)及葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)都是糖异生通路中关键的酶。
有趣的是，Ad-shACL组小鼠在饥饿条件下，PEPCK及G6Pase分别下降40％和75％。这些酶类的变化，是通过降低转录因子PGC-1α的表达实现的，见图6。因此，肝脏中ACL的缺失对db/db小鼠血糖的改善，部分是通过抑制了肝脏中糖异生的活性。
实施例7.筛选方法
利用小鼠MEF细胞进行筛选，将小鼠MEF细胞分为两组，一组为对照组，一组为测试组。
对照组：不给予候选物质；
测试组：给予候选物质(如携带shRNA的腺病毒等)。
检测对照组和测试组细胞中ACL的表达情况，如果ACL表达显著降低50％以上，则该候选物质是潜在的对于防治糖脂代谢紊乱疾病有用的药物。
将前述设计的携带1#～4#shRNA的腺病毒处理所述测试组，结果发现，它们的降低ACL表达均高于50％；其中携带1#和4#shRNA的腺病毒效果最优。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>ACL在筛选防治肥胖相关代谢紊乱疾病的药物中的应用
<130>082050
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