预防猪感染猪繁殖与呼吸综合征的减毒活疫苗 【技术领域】
本发明涉及一种预防猪感染猪繁殖与呼吸综合征的减毒活疫苗。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由PRRSV(Porcine Reproductive and RespiratorySyndromeVirus，PRRSV)引起的一种猪传染病。临床症状以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难为特征。发病初期均表现为发热、嗜睡、食欲不振、倦怠、呼吸困难、咳嗽等。该病最早发现于在美国的北卡罗来纳州(1987年)，此后相继在加拿大(1998)、德国(1990)、英国(1991)发现此病。1992年国际兽疫局(OIE)将此病命名为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。我国于1996年也报道了此病的流行。PRRSV共分为两种基因型：美洲型和欧洲型。并且抗原分型与基因分型基本一致。两型之间存在比较大的抗原差异。
PRRS的流行给世界养猪业造成了巨大的经济损失。因此预防PRRS越来越得到各国从业者的重视。其中疫苗预防已经取得了一定的进展。灭活疫苗是较早研制的疫苗，其不存在散毒和毒力返强的危险.但是对于以细胞免疫为主的PRRSV预防效果不是很理想。
美国Boehringer Ingleheim公司于1995年首次推出减毒活疫苗RespPRRS/ReproTM，并获准用于3-18周的健康青年母猪、经产母猪、哺乳仔猪和生长育肥猪，免疫期4个月以上。Schering-Plough动物保健公司生产的弱毒疫苗Prime PacRPRRS，用于母猪或后备母猪配种前3-6周的预防接种，取得了较好的预防效果。但是，PRRSV极易发生变异，导致减毒疫苗在临床上的预防效果不甚理想，也是猪场复发PRRS的主要原因。
2006年我国爆发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征，引起该次疫病爆发的病原为发生了变异的PRRSV，与以往流行PRRS毒株相比存在较大程度变异，因此，需要研发出针对导致我国PRRS流行的毒株的减毒活疫苗，以有效地防止我国PRRS的流行。
【发明内容】
基于现有技术存在的技术缺点，本发明的目的在于提供能有效预防PRRS在中国流行地区的发生。为达到本发明的目的，发明人从一株分离于天津某猪场的猪繁殖与呼吸综合征病毒的PRRSV TJ株出发，并进行减毒培养，从而获得了符合本发明要求的减毒疫苗株，从而本发明提供了：
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒活疫苗株TJM，其微生物保藏号为CGMCC No.3121；分类命名：猪繁殖与呼吸综合征病毒；保藏地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2009年6月15日；
本发明还提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒减毒活疫苗株，其特征在于，其Nsp2核苷酸序列全长为2490bp，与PRRSV TJ株(GenBank登录号为EU860248)Nsp2核苷酸序列相比连续缺失第598-717位氨基酸，共缺失120个氨基酸；与VR-2332毒株Nsp2核苷酸序列相比，缺失第481位、第537-565位和628-747位氨基酸，共缺失150个氨基酸，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明进一步提供了一种制备上述疫苗株的方法，所述方法包括将微生物保藏号为CGMCC NO.2129的PRRSV TJ株在细胞中传代，每10代进行噬斑克隆纯化，使所述毒株的毒力致弱得到致弱毒株，而得到所述疫苗株。
在本发明的一个优选实施方案中，在上述制备疫苗株的方法中，所述细胞为Marc-145细胞或相关可用于PRRSV生长的细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，所述Marc-145细胞或相关可用于PRRSV生长的细胞按照以下任意一种方法培养得到：
(1)在转瓶中培养Marc-145细胞或相关可用于PRRSV生长的细胞，使细胞密度达到5-10×107/ml；
(2)在生物反应器中添加附着载体的悬浮培养或无载体的悬浮培养，使Marc-145细胞或相关可用于PRRSV生长的细胞密度达到5-10×107/ml--5-10×108/ml。
本发明还提供了一种含有上述减毒疫苗株的制剂。
在本发明的一个优选实施方案中，上述制剂含有耐热冻干保护剂。
本发明进一步提供了上述制剂的制备方法，其包括：
(1)培养PRRSV TJM株(微生物保藏号为CGMCC No.3121)；
(2)收获步骤(1)获得的病毒液；
(3)配制耐热冻干保护剂；
(4)将所述病毒液与耐热冻干保护剂混合均匀后定量分装置安瓶内，加盖后置于冻干机内，经预冻、干燥过程冻干疫苗。
在本发明的一个优选实施方案中，在上述的制备方法中，将PRRSV TJM株以感染剂量0.01-0.5接种到Marc-145细胞或相关可用于PRRSV生长的细胞上进行大规模培养，培养3-5天，当细胞病变达到70％时收获病毒液。
在本发明的一个优选实施方案中，在上述的制备方法中，所述步骤(3)按如下方法配置耐热冻干保护剂，10-30％质量体积比的蔗糖、0.01-5％质量体积比L-谷氨酸钠、0.1-10％质量体积比N-Z、10-30％质量体积比的水解乳白蛋白、0.1-10％质量体积比的明胶混合溶解后经高压灭菌后获得所述耐热冻干保护剂。
在本发明的一个优选实施方案中，在上述的制备方法中，在步骤(4)中将体积比6-8份的病毒液和体积比2-4份的干保护剂混合均匀制备所述制剂。
本发明进一步提供了核苷酸序列分子，其序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明进一步提供了上述核苷酸分子在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗鉴别及诊断试剂中的应用。
本发明所提供的减毒疫苗株以及相关制剂在预防猪繁殖与呼吸综合征方面显示了显著的技术效果，该减毒疫苗株接种试验动物后5代未发生毒力返强，很好地解决了毒力返强地问题；安全性试验显示，疫苗单剂量、单剂量重复和10倍剂量接种猪后，体温正常，无任何临床症状，剖检观察肺脏无肉样变，证明猪繁殖与呼吸综合征活疫苗对猪安全；疫苗效力试验显示，本发明疫苗对于强毒的攻击可产生较好的保护作用，可有效预防猪繁殖与呼吸综合征；疫苗免疫持续期试验显示，免疫持续期为4个月，可确保免疫期内对猪提供有效保护；疫苗保存期试验显示，疫苗在2～8℃保存期为24个月。
说明书附图
图1为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗2～8℃保存期试验；
图2为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗37℃耐老化试验。
【具体实施方式】
以下结合附图对本发明进行进一步的描述，但是这些描述并不构成对本发明的限制，本发明的保护范围以权利要求书为准。
实施例1PRRSV TJ毒株的传代致弱
从天津一发生高热的猪场病死猪所采病料中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，将其命名为PRRSV TJ株，该毒株GenBank登录号为EU860248。将该毒株提交保藏，其微生物保藏号是：CGMCC NO.2129。PRRSVTJ株基因组全长为15324bp(包括PolyA尾)，将其Nsp2序列同美洲标准毒株VR-2332相比，TJ株Nsp2序列缺失第481位和第532-560位氨基酸，二者核苷酸同源性为83.7％，其编码的氨基酸同源性为77.9％。本次试验结果表明，该分离株为发生了变异的PRRSV，对猪具有高致病性。将PRRSV TJ株经Marc-145细胞连续传代，每10代进行一次噬斑克隆纯化，传至F92代时，对其进行全基因序列扩增和致病性研究，证明传至F92的PRRSV TJ株，对试验动物安全，将其命名为PRRSV TJM株用于活疫苗研究。
实施例2PRRSV TJM株毒力返强试验
PRRSV TJM株由流行高热病毒(PRRSV TJ株)致弱并鉴定保存，本研究进一步检验该疫苗毒是否存在毒力返强。第1次毒力返强使用PRRSV TJM株病毒接种4周龄健康PRRS阴性仔猪，颈部肌肉注射，2ml/头猪，105.7TCID50/ml，同时设不接种阴性对照猪。第2次至第5次毒力返强试验将前1次动物呈PRRSV阳性血清混合，作为下一次动物接种物接种猪。均采用颈部肌肉注射方式接种，每次设不接种猪作为阴性对照。每次接种病毒后连续14天定点测定试验动物直肠温度，临床观察14天，隔天采血检测血清病毒用于下次毒力返强传代接种物。第五次毒力返强试验观察至病毒接种后21天。从第2次试验开始，病毒接种物不能由体外培养传代放大。连续5次试验动物接种病毒后体温正常，未表现出任何临床发病。结果表明，猪繁殖与呼吸综合征病毒TJM株回归易感动物，经5次返强试验均未引起试验动物发病，说明该毒株接种试验动物后5代未发生毒力返强，可用于疫苗研究。
实施例3PRRSV TJM株遗传变异分析
将PRRSV TJ株经Marc-145细胞连续传代致弱得到PRRSV TJM株，对PRRSV TJM株Nsp2基因进行序列测定，并将其与PRRSV TJ株和经典美洲型VR-2332株进行基因序列比较，结果表明：PRRSV TJM株Nsp2序列全长2490bp，与PRRSV TJ株和美洲型标准毒株VR-2332核苷酸序列同源性分别为98.6％和82.9％，氨基酸序列同源性分别为97.6％和75.8％，与PRRSV TJ株相比连续缺失第598-717位氨基酸，共缺失120个氨基酸；与VR-2332毒株相比，缺失第481位、第537-565位和628-747位氨基酸，共缺失150个氨基酸。PRRSV TJM株Nsp2核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例4猪繁殖与呼吸综合征活疫苗制备
1)制苗用病毒液制备：将PRRSV TJM株以MOI：0.01-0.5接种于长满良好单层的Marc-145细胞，加入维持液，置37℃转瓶机内进行培养，当CPE达70％以上时收获病毒液，冻融2次，测定病毒含量(TCID50)，同时抽样进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验。
将检验合格的病毒液作为制苗用抗原液，备用；
2)耐热冻干保护剂制备：10-30％蔗糖(质量体积比)、0.01-5％L-谷氨酸钠(质量体积比)、0.1-10％N-Z(质量体积比)、10-30％水解乳白蛋白(质量体积比)、0.1-10％明胶(质量体积比)混合溶解后经高压灭菌备用。
3)将5-8份(体积比)病毒液和2-5份(体积比)冻干保护剂混合均匀后定量分装置安瓶内，加盖后置于冻干机内，经预冻、干燥过程冻干疫苗。疫苗冻干后进行无菌检验、安全性检验和效力检验。
实施例5猪繁殖与呼吸综合征活疫苗安全性试验
对实验室制备的3批疫苗进行安全性试验，具体如下：
取实验室制备的3批猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，经颈部肌肉注射4-5周龄PRRS阴性猪，分别进行单剂量，单剂量重复接种和10倍超剂量接种，105.0TCID50/ml/剂量，15头猪/组，同时设5头不接种疫苗猪作为对照。疫苗接种后，连续14天每天定点测定试验动物直肠温度，观察临床症状，疫苗接种后21天将试验动物剖检观察肺脏有无病变。试验结果表明，疫苗单剂量、单剂量重复和10倍剂量接种猪后，体温正常，无任何临床症状，剖检观察肺脏无肉样变。证明猪繁殖与呼吸综合征活疫苗对猪安全。
实施例6猪繁殖与呼吸综合征活疫苗效力试验
取实验室制备的3批猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，分别接种3-5周龄健康PRRS阴性断乳仔猪，试验分为4组，每组5只动物。
第一组至第三组(免疫组)分别免疫接种3批实验室制备的PRRS活疫苗，剂量为1头份/头猪，105.0TCID50/头份/ml，颈部肌肉注射；
第四组为对照组，接种1ml Marc-145对照细胞培养液。
免疫后观察动物临床反应及疫苗副作用，每周采血、分离血清、用于血清抗体检测；每周测量体重。
免疫后4周四组动物使用50倍稀释的PRRSV TJ株检验用强毒(效价为105.8TCID50/ml)攻击，攻击剂量为2ml病毒液/头猪，鼻内接种，1ml/鼻孔。动物接种强毒后，每天观察临床症状，包括食欲、精神状态等；每天测定直肠体温；每2天采血分离血清，用于病毒分离测定；试验于攻毒后21天结束。
试验结果：
1、疫苗接种后试验动物体温正常，未见任何临床症状，疫苗接种组和对照组试验动物增重无明显差异；
2、攻毒后，疫苗接种组保护率可达4/5，对照组5/5头猪发病，2/5头猪死亡。
试验结果说明，本发明疫苗对于强毒的攻击可产生较好的保护作用，可有效预防猪繁殖与呼吸综合征病毒。
实施例7猪繁殖与呼吸综合征活疫苗免疫持续期试验
将实验室3批制品用PBS稀释成105.0TCID50/ml。分别颈部肌肉接种4～5周龄健康PRRS阴性断乳仔猪，1ml/头猪，进行免疫期的测定，疫苗免疫后2个月、4个月和6个月分别抽取免疫组和对照组试验动物进行攻毒试验。结果表明：疫苗免疫后2个月攻毒，3批疫苗接种组试验动物均无死亡，保护率可达4/5。4个月攻毒，3批疫苗接种组试验动物均无死亡，保护率可达4/5。6个月攻毒，3批疫苗接种组试验动物均无死亡，保护率可达3/5以上。因此将免疫持续期定为4个月，可确保免疫期内对猪提供有效保护。
实施例8猪繁殖与呼吸综合征活疫苗保存期试验
将3批(〔080106、080125和080201〕实验室制品(抗原含量分别为105.8TCID50/ml/头份、105.7TCID50/ml/头份、105.8TCID50/ml/头份)于2～8℃保存3、6、9、12、18、24、30和40个月分别取样进行性状、真空度、水分含量、效力试验(图1)以及37℃耐老化试验(图2)。结果：3批制品在2～8℃保存24个月性状仍为白色疏松团块，加入稀释液后迅速溶解；平均剩余水分在要求范围内；真空度检测为白色或紫色辉光；抗原含量分别为105.2TCID50/ml/头份、105.2TCID50/ml/头份、105.3TCID50/ml/头份；37℃放置14日抗原含量分别为105.2TCID50/ml/头份、105.2TCID50/ml/头份、105.1TCID50/ml/头份，仍高于冻干疫苗要求(105.0TCID50/ml/头份)，因此疫苗在2～8℃保存期为24个月。