说明书针对甲状腺癌的抗肿瘤剂
本申请是基于申请日为2007年5月17日，优先权日为2006年5月18日，申请号为200780017371.9(PCT/JP2007/060560)，发明名称为“针对甲状腺癌的抗肿瘤剂”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及含有抑制RET激酶活性的物质(以下也称“RET激酶抑制物质”)的、针对下述疾病的治疗剂、治疗方法、RET激酶抑制物质在所述治疗剂的制造中的用途以及用于所述治疗剂的RET激酶抑制物质，所述疾病为选自下组中的至少一种：多发性内分泌肿瘤症IIA型(multiple endocrine neoplasia，type IIA)、多发性内分泌肿瘤症IIB型(multiple endocrine neoplasia，type IIB)、家族性甲状腺髓样癌(familial medullary thyroid carcinoma)、甲状腺乳头癌(papillary thyroid carcinoma)、散发性甲状腺髓样癌(sporadic medullary thyroid carcinoma)、希尔施普龙病(Hirschsprung disease)、嗜铬细胞瘤(Pheochromocytoma)、甲状旁腺增生(parathyroid hyperplasia)以及胃肠道(消化管)粘膜神经瘤(mucosal neuromas of the gastrointestinal tract)。
此外，本发明涉及含有RET激酶抑制物质的、针对甲状腺癌(thyroid carcinoma)的治疗剂、治疗方法、RET激酶抑制物质在所述治疗剂的制造中的用途以及用于所述治疗剂的RET激酶抑制物质。
而且，本发明涉及：用于施用于包含突变型RET表达细胞的生物体的、含有RET激酶抑制物质的药物组合物、以对包含突变型RET表达细胞的生物体进行给药为特征的疾病治疗方法、RET激酶抑制物质在所述药物组合物的制造中的用途以及用于所述药物组合物的RET激酶抑制物质。
此外，本发明涉及RET激酶抑制剂。
而且，本发明涉及：以细胞中有无RET突变为指标来预测RET激酶抑制物质对于患者的效果的方法。
背景技术
RET是一种受体酪氨酸激酶，是传递细胞增殖、分化信号的细胞表面分子。
已知RET的突变与多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、散发性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、希尔施普龙病等疾病相关(1、2)。而且，提示RET激酶抑制物质可以成为针对所述疾病的有用治疗剂(1、2)。
在93％至98％的多发性内分泌肿瘤症IIA型患者中，确认了RET密码子609、611、618、620、634这5个半胱氨酸残基中的一个有突变。而且，确认RET密码子634的突变是最多的(3、4)。
另一方面，在95％的多发性内分泌肿瘤症IIB型患者中，确认了RET密码子M918T的突变(密码子918的甲硫氨酸突变为酪氨酸)(4)。
此外，在许多家族性甲状腺髓样癌患者中，确认了RET密码子609、611、618、620、634、768、790、791、804、891的一个有突变(4)。
已知这些点突变均引起配体非依赖性的RET的恒常活性化(3、4)。
这里，多发性内分泌肿瘤症IIA型是以甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤以及甲状旁腺增生为特征的综合征。另一方面，多发性内分泌肿瘤症IIB型是伴有甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤、胃肠道粘膜神经瘤症状的综合征。此外，家族性甲状腺髓样癌是以甲状腺髓样癌为主要症状的综合征(5)。
此外，在约40％的散发性甲状腺髓样癌患者中，确认了RET的体细胞点突变，这些突变基本上都发生在密码子918(6)。
而且，在甲状腺乳头癌中，确认了因染色体倒位(chromosomal inversions)或染色体易位(chromosomal translocation)引起的RET基因与其它基因的融合基因，即RET基因的重排(再構築，rearrengement)。而且，已知：由于RET基因的重排而生成的融合蛋白质引起配体非依赖性二聚化以及RET的恒常活性化(7)。
希尔施普龙病(Hirschsprung disease)是起因于大肠神经丛异常的、以新生儿肠扩张和顽固性便秘为特征的疾病。已知RET的突变是希尔施普龙病的原因之一(8)。
有报道称：RET的突变在NIH3T3细胞中引起贴壁非依赖性增殖以及致肿瘤性(2)。
此外，有报道称：RET激酶抑制物质ZD6474抑制突变型RET转化的NIH3T3细胞中的贴壁非依赖性增殖，抑制了给裸鼠注入该细胞后的肿瘤形成(2)。
而且，有报道称：在人甲状腺髓样癌细胞株(TT)皮下移植模型中，RET激酶抑制物质BAY 43-9006使肿瘤减小(9)。
这提示：RET激酶抑制物质针对突变型RET表达细胞引起细胞增殖抑制，显示出针对含有所述细胞的肿瘤的抗肿瘤效果。此外，可以认为RET激酶抑制物质对于归因于RET突变的疾病是有效的。
即，可以认为：RET激酶抑制物质对于多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生以及胃肠道粘膜神经瘤和甲状腺癌是有效的。
这里，作为血管新生抑制物质，已知4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉及其类似化合物(10-12)。然而，关于4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉及其类似化合物具有RET激酶抑制活性则没有任何报道。
参考文献
(1)Oncogene，19，5590-5597，2000.
(2)Cancer Research，15，7284-7290，2002.
(3)Cancer Research，66，1177-1180，2006.
(4)Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，88，5438-5443，2003.
(5)Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，89，4142-4145，2004.
(6)Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，89，5823-5827，2004.
(7)Endocrinology，145，5448-5451,2004.
(8)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，102，8949-8954，2005.
(9)Journal of the National Cancer Institute，98，326-334，2006.
(10)国际公开第02/32872号小册子
(11)国际公开第2004/080462号小册子
(12)国际公开第2005/063713号小册子
发明内容
鉴于上述情况，本发明所要解决的问题是：提供针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生和胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病、以及甲状腺癌的治疗剂和治疗方法，并且提供针对含有表达突变型RET的细胞的生物体发挥更好效果的药物组合物和治疗方法。而且，本发明所要解决的另一个问题是：提供RET激酶抑制剂。此外，本发明所要解决的另一个问题是：提供预测4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉及其类似化合物的效果的方法。
本发明人等为解决上述问题进行了创造性研究，结果发现：4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉具有RET激酶抑制活性。而且，还发现：4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉及其类似化合物针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生和胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病、以及甲状腺癌发挥更好的效果。此外，还发现：4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉及其类似化合物针对含有突变型RET表达细胞的生物体发挥更好的效果。而且，还发现：4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉及其类似化合物的效果可以通过以细胞中有无RET突变为指标来预测。
即，本发明涉及以下内容。
(1)含有RET激酶抑制物质、且针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗剂。
(2)含有RET激酶抑制物质且针对甲状腺癌的治疗剂。
(3)用于施用于包含突变型RET表达细胞的生物体的、且含有RET激酶抑制物质的药物组合物。
(4)以对患者施用有效量的RET激酶抑制物质为特征的、选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲 状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗方法。
(5)以对患者施用有效量的RET激酶抑制物质为特征的甲状腺癌的治疗方法。
(6)以对包含突变型RET表达细胞的生物体施用有效量的RET激酶抑制物质为特征的疾病治疗方法。
(7)RET激酶抑制物质在针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗剂的制造中的用途。
(8)RET激酶抑制物质在针对甲状腺癌的治疗剂的制造中的用途。
(9)RET激酶抑制物质在用于施用于包含突变型RET表达细胞的生物体的、且含有RET激酶抑制物质的药物组合物的制造中的用途。
(10)用于针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗剂的RET激酶抑制物质。
(11)用于针对甲状腺癌的治疗剂的RET激酶抑制物质。
(12)用于下述药物组合物的RET激酶抑制物质，所述药物组合物用于施用于包含突变型RET表达细胞的生物体且含有RET激酶抑制物质。
(13)以细胞中有无RET突变为指标来预测患者是否对RET激酶抑制物质高敏感性的方法。
(14)对细胞对于RET激酶抑制物质的敏感性进行分析的方法，该方法包括测定细胞中有无RET突变。
(15)选择对于RET激酶抑制物质显示高敏感性的细胞的方法，该方法包括测定细胞中有无RET突变。
(16)选择对于RET激酶抑制物质显示高敏感性的患者的方法，该方法包括测定细胞中有无RET突变。
(17)通过测定细胞中有无RET突变来分析对于RET激酶抑制物质的敏感性，并根据所得结果对患者进行分类的方法。
(18)选择作为RET激酶抑制物质的施用对象的患者的方法，该方法包括 测定细胞中有无RET突变，并根据所得测定结果来选择具有突变型RET表达细胞的患者。
(19)预测RET激酶抑制物质对患者的治疗效果的方法，该方法包括测定细胞中有无RET突变。
(20)测定患者来源的细胞中有无RET突变的方法，该方法用于预测该患者对于RET激酶抑制物质的敏感性程度；其中，
所述RET激酶抑制物质可以列举出用下面的通式(I)表示的化合物、或该化合物的药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物：
通式(I)
通式(I)中，
R1为用式-V1-V2-V3(该式中，V1表示任选具有取代基的C1-6亚烷基；V2表示单键、氧原子、硫原子、羰基、亚磺酰基、磺酰基，或者用式-CONR6-表示的基团、用式-SO2NR6-表示的基团、用式-NR6SO2-表示的基团、用式-NR6CO-表示的基团或用式-NR6-表示的基团(式中，R6表示氢原子、任选具有取代基的C1-6烷基或任选具有取代基的C3-8环烷基)；V3表示氢原子、任选具有取代基的C1-6烷基、任选具有取代基的C2-6烯基、任选具有取代基的C2-6炔基、任选具有取代基的C3-8环烷基、任选具有取代基的C6-10芳基、任选具有取代基的5～10员杂芳基或任选具有取代基的3～10员非芳香族杂环基)表示的基团；
R2为氰基、任选具有取代基的C1-6烷氧基、羧基、任选具有取代基的C2-7烷氧基羰基或用式-CONVa11Va12(该式中、Va11表示氢原子、任选具有取代基的C1-6烷基、任选具有取代基的C2-6烯基、任选具有取代基的C2-6炔基、任选具有取代基的C3-8环烷基、任选具有取代基的C6-10芳基、任选具有取代基的5～10员杂芳基或任选具有取代基的3～10员非芳香族杂环基；Va12表示氢原子、任选具有取代基的C1-6烷基、任选具有取代基的C2-6烯基、任选具有取代基的C2-6炔基、任选具有取代基的C3-8环烷基、任选具有取代基的C6-10芳基、任选具有取代基的5～10员杂芳基、任选具有取代基的3～10员非 芳香族杂环基、羟基、任选具有取代基的C1-6烷氧基或任选具有取代基的C3-8环烷氧基)表示的基团；
Y1为用式
(式中，R7和R8彼此独立，表示氢原子、卤素原子、氰基、硝基、氨基、任选具有取代基的C1-6烷基、任选具有取代基的C3-8环烷基、任选具有取代基的C1-6烷氧基、任选具有取代基的C1-6烷硫基、甲酰基、任选具有取代基的C2-7酰基、任选具有取代基的C2-7烷氧基羰基或式-CONVd1Vd2(式中，Vd1和Vd2彼此独立，表示氢原子或任选具有取代基的C1-6烷基)表示的基团；
W1和W2彼此独立，表示任选具有取代基的碳原子或氮原子)表示的基团；
R3和R4彼此独立，表示氢原子、任选具有取代基的C1-6烷基、任选具有取代基的C2-6烯基、任选具有取代基的C2-6炔基、任选具有取代基的C3-8环烷基、任选具有取代基的C2-7酰基或任选具有取代基的C2-7烷氧基羰基；
R5表示氢原子、任选具有取代基的C1-6烷基、任选具有取代基的C2-6烯基、任选具有取代基的C2-6炔基、任选具有取代基的C3-8环烷基、任选具有取代基的C6-10芳基、任选具有取代基的5～10员杂芳基、任选具有取代基的3～10员非芳香族杂环基。
此外，所述RET激酶抑制物质可以列举出：选自5-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙基氨基乙基)酰胺、N-{2-氯-4-[(6，7-二甲氧基-4-喹啉基)氧]苯基}-N’-(5-甲基-3-异噁唑)脲以及4-[(4-氟-2-甲基吲哚-5-基)氧]-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉中的至少一种化合物、或该化合物的药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物。
此外，本发明涉及以下内容。
(21)含有用所述通式(I)表示的化合物、或该化合物的药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物的RET激酶抑制剂。
(22)含有选自5-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙基氨基乙基)酰胺、N-{2-氯-4-[(6，7-二甲氧基-4-喹啉基) 氧]苯基}-N’-(5-甲基-3-异噁唑)脲以及4-[(4-氟-2-甲基吲哚-5-基)氧]-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉中的至少一种化合物、或该化合物的药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物的RET激酶抑制剂。
此外，本发明优选涉及以下内容。
(23)含有4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物的、且针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗剂。
(24)含有4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物的、且针对甲状腺癌的治疗剂。
(25)用于施用于包含突变型RET表达细胞的生物体的、且含有4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物的药物组合物。
(26)以给患者施用有效量的4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物为特征的、选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗方法。
(27)以给患者施用有效量的4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物为特征的、甲状腺癌的治疗方法。
(28)以对包含突变型RET表达细胞的生物体施用有效量的4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物为特征的、疾病的治疗方法。
(29)4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物在针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳 头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗剂的制造中的用途。
(30)4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物在针对甲状腺癌的治疗剂的制造中的用途。
(31)4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物在用于施用于包含突变型RET表达细胞的生物体的、且含有RET激酶抑制物质的药物组合物的制造中的用途。
(32)用于针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗剂的4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物。
(33)用于针对甲状腺癌的治疗剂的4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物。
(34)用于下述药物组合物的4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物，所述药物组合物用于施用于包含突变型RET表达细胞的生物体、且含有RET激酶抑制物质。
(35)一种以细胞中有无RET突变为指标来预测患者是否对4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物为高敏感性的方法。
(36)分析细胞对于4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物的敏感性的方法，该方法包括测定细胞中有无RET突变。
(37)选择对于4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物显示高敏感性的细胞的方法，该方法包括测定细胞中有无RET突变。
(38)选择对于4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲 酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物显示高敏感性的患者的方法，该方法包括测定细胞中有无RET突变。
(39)通过测定细胞中有无RET突变来分析对于4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物的敏感性、并根据所得结果对患者进行分类的方法。
(40)选择作为4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物的施用对象的患者的方法，该方法包括测定细胞中有无RET突变、并根据所得测定结果来选择具有突变型RET表达细胞的患者。
(41)预测4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物对于患者的治疗效果的方法，该方法包括测定细胞中有无RET突变。
(42)为了预测患者对于4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物的敏感性程度，而对该患者来源的细胞中有无RET突变进行测定的方法。
(43)含有4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物的RET激酶抑制剂。
根据本发明，提供了：含有RET激酶抑制物质且针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗剂、治疗方法、RET激酶抑制物质在所述治疗剂的制造中的用途以及用于所述治疗剂的RET激酶抑制物质。
此外，根据本发明，提供了：含有RET激酶抑制物质且针对甲状腺癌的治疗剂、治疗方法、RET激酶抑制物质在所述治疗剂的制造中的用途以及用于所述治疗剂的RET激酶抑制物质。
而且，根据本发明，提供了：下述药物组合物、以将该药物组合物施用于包含突变型RET表达细胞的生物体为特征的疾病治疗方法、RET激酶抑制物质在所述药物组合物的制造中的用途以及用于所述药物组合物的RET激酶抑制物质；其中，所述药物组合物用于施用于包含突变型RET表达细 胞的生物体且含有RET激酶抑制物质。
此外，根据本发明，提供了RET激酶抑制剂。
而且，根据本发明，提供了：预测RET激酶抑制物质的效果的方法。
更具体地说，RET激酶抑制物质的效果可以通过以细胞中有无RET突变为指标来预测。
根据本发明的方法，可以对效果进行预测，而无需给患者施用化合物，因此，能够选择该化合物的效果更令人期待的患者，对患者的QOL有所裨益。
附图说明
图1显示了在培养人甲状腺髓样癌细胞株(TT)的条件下，4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉对于RET激酶和Erk1/2的活性化(以磷酸化为指标)的效果。而且，最左边的泳道是未添加受试物质而对RET激酶和Erk1/2的活性化(以磷酸化为指标)进行测定。
图2显示了人甲状腺髓样癌细胞株(TT)皮下移植模型中4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉的抗肿瘤效果。
图3显示了人甲状腺髓样癌细胞株(TT)皮下移植模型中、4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉对于肿瘤组织内的RET激酶的效果。(A)显示了以各施用量(10，30或100mg/kg)口服施用受试物质2小时后对于RET磷酸化的效果，(B)显示了以100mg/kg施用受试物质2、8、12或24小时后对于RET磷酸化的效果。
发明的具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行说明。以下的实施方式仅为用于说明本发明的示例，并不意味本发明限于这些实施方式。本发明只要不脱离其要旨，可以以各种方式加以实施。
而且，本说明书中引用的文献、以及公开公报、专利公报和其它专利文献均并入本说明书作为参考。此外，本说明书中包括作为本申请优先权基础的美国临时申请60/747，570号的公开内容。
1.本发明的治疗剂、药物组合物、治疗方法
(1)RET
在本发明中，RET是指由ret原癌基因(ret proto-oncogene)编码的蛋白质，可以列举出例如：由SEQ ID NO：2(GenBank登录号：NM_020975)所表示的氨基酸序列或SEQ ID NO：4(GenBank登录号：NM_020630)所表示的氨基酸序列构成的多肽。SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列的长度为1114aa，SEQ ID NO：4所表示的氨基酸序列的长度为1072aa。
此外，ret原癌基因可以列举出例如：由SEQ ID NO：1(GenBank登录号：NM_020975)所表示的碱基序列中的第181～3522位的碱基序列构成的多核苷酸、或者由SEQ ID NO：3(GenBank登录号：NM_020630)所表示的碱基序列中的第181～3396位的碱基序列构成的多核苷酸。
在本发明中，这些RET有时也称为“野生型RET”。
(2)突变型RET
在本发明中，突变型RET可以列举出下述多肽：所述多肽包含因在野生型RET的氨基酸序列例如SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、一个或数个氨基酸发生欠失、取代或增加、或者这些情况的组合而突变成的氨基酸序列，且所述多肽具有RET激酶活性。此外，突变型RET可以优选列举出下述多肽：所述多肽包含在野生型RET的氨基酸序列例如SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、一个氨基酸被取代而成的氨基酸序列，且所述多肽具有RET激酶活性。
这里，“RET激酶活性”是指RET磷酸化自身或其它蛋白质的酪氨酸残基的活性。
突变型RET可以列举出例如：包含下述(i)～(xix)所表示的序列的多肽。
(i)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第321位的甘氨酸被其它氨基酸优选精氨酸取代而成的氨基酸序列(Journal of Endocrinology Investigation，28，905-909，2005.)，
(ii)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第533位的甘氨酸被其它氨基酸优选半胱氨酸取代而成的氨基酸序列(Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，88，5438-5443，2003.)，
(iii)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第609位的半胱氨酸被其它氨基酸优选丝氨酸取代而成的氨基酸序列(Clin Endocrinol，63，676-682,2005.)，
(iv)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第611位的半胱氨酸被 其它氨基酸优选丝氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸取代而成的氨基酸序列(European Journal of Human Genetics，11,364-368，2003.、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，86，1104-1109，2001.)，
(v)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第618位的半胱氨酸被其它氨基酸优选精氨酸、丝氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸取代而成的氨基酸序列(American Journal of Pathology，168，1262-1275，2006.、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，86，1104-1109，2001.)，
(vi)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第620位的半胱氨酸被其它氨基酸优选精氨酸或丝氨酸取代而成的氨基酸序列(American Journal of Pathology，168，1262-1275，2006.、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，86，1104-1109，2001.)、
(vii)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第630位的半胱氨酸被其它氨基酸优选精氨酸或酪氨酸取代而成的氨基酸序列(Thyroid，15，668-671,2005.、Biochemical and Biophysical Research Communications，255，587-590，1999.)，
(viii)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第631位的天冬氨酸被其它氨基酸优选酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺或丙氨酸取代而成的氨基酸序列(Biochemical and Biophysical Research Communications，255，587-590，1999.)，
(ix)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第634位的半胱氨酸被其它氨基酸优选精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或色氨酸取代而成的氨基酸序列(Biochemical and Biophysical Research Communications，255，587-590，1999.、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，86，1104-1109，2001.、Biochemical and Biophysical Research Communications，207，1022-1028，1995.)、
(x)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第691位的甘氨酸被其它氨基酸优选丝氨酸取代而成的氨基酸序列(Cancer Research，66，1177-1180，2006.)，
(xi)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第768位的谷氨酸被其它氨基酸优选天冬氨酸取代而成的氨基酸序列(Clinical Chemistry，50，522-529，2004.、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，86， 1104-1109，2001.)，
(xii)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第790位的亮氨酸被其它氨基酸优选苯丙氨酸取代而成的氨基酸序列(Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，83，770-774，1998.、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，86，1104-1109，2001.)，
(xiii)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第791位的酪氨酸被其它氨基酸优选苯丙氨酸取代而成的氨基酸序列(Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，83，770-774，1998.)，
(xiv)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第804位的缬氨酸被其它氨基酸优选甲硫氨酸取代而成的氨基酸序列(Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，86，1104-1109，2001.)，
(xv)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第806位的酪氨酸被其它氨基酸优选半胱氨酸取代而成的氨基酸序列(Japanese Journal of Cancer Research，90，1-5，1999.)、
(xvi)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第844位的精氨酸被其它氨基酸优选亮氨酸取代而成的氨基酸序列(Exp Clin Endocrinol Diabetes，108，128-132,2000.)，
(xvii)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第883位的丙氨酸被其它氨基酸优选苯丙氨酸或酪氨酸取代而成的氨基酸序列(European Journal of Endocrinology，142，573-575，2000.、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，89，5823-5827，2004.)，
(xviii)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第891位的丝氨酸被其它氨基酸优选丙氨酸取代而成的氨基酸序列(Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，89，4142-4145，2004.)，
(xix)SEQ ID NO：2或4所表示的氨基酸序列中、第918位的甲硫氨酸被其它氨基酸优选苏氨酸取代而成的氨基酸序列(Clinical Cancer Research，8，457-463，2002.)。
此外，突变型RET可以列举出下述多肽，所述多肽在SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列中包含至少一种上述(i)～(xix)所示的取代，即包含密码子321、533、609、611、618、620、630、631、634、691、768、790、791、804、806、844、883、891及918的氨基酸中的至少一种氨基酸被取代成其 它氨基酸而成的突变部位。例如：包含下述氨基酸序列的多肽包含在突变型RET中，所述氨基酸序列含有SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列中第804位的缬氨酸被其它氨基酸取代而成的突变部位、以及第806位的酪氨酸被其它氨基酸取代而成的突变部位。这里，对于突变型RET中所包含的上述(i)～(xix)所示取代的个数以及组合没有特殊限制。
在本发明中，突变型RET优选为包含上述(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(ix)、(xi)、(xii)、(xiii)、(xiv)、(xviii)或(xix)所表示的序列的多肽，更优选为包含(ix)或(xix)所表示的序列的多肽。
而且，本说明书中，有些情况下，氨基酸的字母符号通常采用三字母或单字母。此外，有些情况下，示于数字前的字母表示取代前的氨基酸的单文字符号，示于数字后的字母表示取代后的氨基酸的单字母符号，数字表示该氨基酸在氨基酸序列中的存在位置。例如，如上述(xix)所示，有些情况下，当第918位的甲硫氨酸被苏氨酸取代时，表示为“M918T”。
此外，有些情况下，紧跟密码子的数字表示氨基酸在氨基酸序列中的存在位置。例如，“密码子918的氨基酸”表示氨基酸序列中第918位的氨基酸。
此外，在本发明中，突变型RET可以列举出由下述基因编码、且具有RET激酶活性的多肽，所述基因是编码野生型RET的基因(以下，也称“RET基因”)与其它基因之间发生重排而得的基因。此外，在本发明中，突变型RET可以列举出例如：由下述多核苷酸编码、且具有RET激酶活性的多肽，所述多核苷酸是在由SEQ ID NO：1或3的碱基序列构成的多核苷酸中、一部分多核苷酸与其它基因之间发生重排而得的多核苷酸。而且，在本发明中，突变型RET可以列举出例如：由下述多核苷酸编码、且具有RET激酶活性的多肽，所述多核苷酸是由SEQ ID NO：1的第181～3522位碱基序列构成的多核苷酸、或者由SEQID NO：3的181～3396位碱基序列构成的多核苷酸与其它基因之间发生重排而得的多核苷酸。
这里，“基因重排”是指基因之间发生重组，其结果是产生新基因。
突变型RET可以列举出例如下述(i)～(xi)的多肽。下述(i)～(xi)的多肽中基因重排的方式记载于括号内的各文献中。
(i)由RET基因与H4(也称CCDC6(coiled-coil domain containing 6)或D10S170，GenBank登录号：NM_005436)基因重排而成的基因(也称“RET/PTC1”)编码的多肽(European Journal of Cancer，41，816-821,2005.、Cell， 60，557-563，1990.)，
(ii)由RET基因与RIα(也称PRKAR1A(cAMP-dependent regulatory type I alpha)，GenBank登录号：NM_212471)基因重排而成的基因(也称“RET/PTC2”)编码的多肽(Eur J Endocrinology，147，741-745，2002.)，
(iii)由RET基因与ELE1(也称NCOA4(nuclear receptor coactivator 4)或RFG，GenBank登录号：NM_005437)基因重排而成的基因(也称“RET/PTC3”)编码的多肽(European Journal of Cancer，41，816-821,2005.)，
(iv)由RET基因与ELE1(也称NCOA4(nuclear receptor coactivator 4)或RFG，GenBank登录号：NM_005437)基因重排而成的基因(也称“RET/PTC4”)编码的多肽(Oncogene，13，1093-1097，1996.)，
(v)由RET基因与RFG5(也称GOLGA5、golgin-84，GenBank登录号：NM_005113)基因重排而成的基因(“RET/PTC5”)编码的多肽(Cancer Research，58，198-203，1998.)，
(vi)由RET基因与hTIF(也称TRIM24(tripartite motif-containing 24)或PTC6，GenBank登录号：NM_003852)基因重排而成的基因(也称“RET/PTC6”)编码的多肽(Oncogene，18，4388-4393，1999.)、
(vii)由RET基因与RFG7(也称TRIM33(tripartite motif-containing 33)、PTC7，GenBank登录号：NM_033020)基因重排而成的基因(也称“RET/PTC7”)编码的多肽(Cancer Research，60，2786-2789，2000.)，
(viii)由RET基因与起动蛋白(kinectin)(也称KTN1(kinectin 1)，GenBank登录号：NM_182926)基因重排而成的基因(也称“RET/PTC8”)编码的多肽(Cancer Research，60，7028-7032,2000.、Cancer Research，60，2786-2789，2000.)，
(ix)由RET基因与ELKS(也称RAB6IP2或RAB6 interacting protein 2，GenBank登录号：NM_178037)基因重排而成的基因(也称“RET/ELKS”)编码的多肽(Genes Chromosomes Cancer，25，97-103，1999.)，
(x)由RET基因与PCM-1(也称PCM1或pericentriolar material 1，GenBank登录号：NM_006197)基因重排而成的基因(也称“RET/PCM-1”)编码的多肽(Oncogene，19，4236-4242,2000.)。
(xi)由RET基因与RFP(也称ret finger protein，GenBank登录号：NM_006510)基因重排而成的基因(也称“RFP-RET”)编码的多肽 (Endocrinology，145，5448-5451,2004.)。
RET突变的有无，可以通过分析RET基因序列或RET基因的转录产物即mRNA的序列来考察。序列的分析方法可以列举出例如：双脱氧核苷酸链终止法(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463)等。可以利用合适的DNA测序仪对序列进行分析。
此外，RET突变的有无可以采用例如原位(in situ)杂交、Northern杂交分析、DNA微阵列、RT-PCR、SSCP-PCR(Single-Strand Conformation Polymorphism-PCR)等方法来分析。这些方法可以按照常规进行(Clinical Cancer Research，8，457-463，2002.)。
而且，RET突变的有无可以采用例如免疫化学方法(例如、免疫组织化学方法、免疫沉淀法、western印迹、流式细胞术、ELISA、RIA等)来分析。这些方法可以按照常规进行。
为了采用PCR来分析突变型RET的有无，可以按照常规来设计引物序列。引物序列例如可以使用Primer Expression(Perkin-Elmer Applied Biosystems)来设计。
此外，为了采用PCR分析突变型RET的有无，可以使用例如表1中的引物。例如，为了对RET/PTC1进行分析，可以将由SEQ ID NO：5及6的序列构成的多核苷酸作为引物。
表1
作为分析对象的突变型RET引物1引物2
RET/PTC1SEQ ID NO：5SEQ ID NO：6
RET/PTC2SEQ ID NO：7SEQ ID NO：6
RET/PTC3SEQ ID NO：8SEQ ID NO：9
RET/PTC4SEQ ID NO：10SEQ ID NO：11
RET/PTC5SEQ ID NO：12SEQ ID NO：13
RET/PTC6SEQ ID NO：12SEQ ID NO：14
RET/PTC7SEQ ID NO：12SEQ ID NO：15
RET/PTC8SEQ ID NO：12SEQ ID NO：16
RET/ELKSSEQ ID NO：17SEQ ID NO：18
RET/PCM-1SEQ ID NO：19SEQ ID NO：20
表1示出了针对作为分析对象的突变型RET的引物的例子。
以下示出SEQ ID NO：5～20的碱基序列。
SEQ ID NO：5 ATT GTC ATC TCG CCG TTC
SEQ ID NO：6 TGC TTC AGG ACG TTG AAC
SEQ ID NO：7 TAT CGC AGG AGA GAC TGT GAT
SEQ ID NO：8 TGG AGA AGA GAG GCT GTA TC
SEQ ID NO：9 CGT TGC CTT GAC TTT TC
SEQ ID NO：10 TGC CCC TTC AGT GTT CCT ACT
SEQ ID NO：11 CTT GAT AAC ACT GGC AGG TT
SEQ ID NO：12 GAG GCG TTC TCT TTC AGC AT
SEQ ID NO：13 TGG AAG AAC TTC GGC ATG AG
SEQ ID NO：14 GAA TTC ACA GCC ACC AAG TG
SEQ ID NO：15 CTA CTT AGC TTT CCA AGT GG
SEQ ID NO：16 GGG ACA GAC ACC TTT GGA AAT A
SEQ ID NO：17 GTTGAAGGAGTCCTTGACTG
SEQ ID NO：18 CTTTCAGCATCTTCACGG
SEQ ID NO：19 AGTGAAGTTTCTACCATCC
SEQ ID NO：20 GGCGTTCTCTTTCAGCATCT
(3)表达突变型RET的细胞(突变型RET表达细胞)
在本发明中，突变型RET表达细胞优选为多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤的细胞。此外，在本发明中，突变型RET表达细胞优选为甲状腺癌的细胞。
(4)本发明的RET激酶抑制物质
在本说明书中，“卤素原子”指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
作为“卤素原子”的优选例子，可以列举出氟原子、氯原子。
在本说明书中、“C1-6烷基”是指碳原子数为1～6个的直链状或支链状烷基，作为具体的例子，可以列举出：甲基、乙基、1-丙基(正丙基)、2-丙基(异丙基)、2-甲基-1-丙基(异丁基)、2-甲基-2-丙基(叔丁基)、1-丁基(正丁基)、2-丁基(仲丁基)、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2- 甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2-甲基-3-戊基、3-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2,2-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、2,3-二甲基-2-丁基等。
作为“C1-6烷基”的优选例，可以列举出甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、1-丁基、2-丁基。
在本说明书中，“C1-6亚烷基”是指在上述定义的“C1-6烷基”中再去掉任意1个氢原子而衍生出的二价基团，作为具体的例子，可以列举出：亚甲基、1,2-亚乙基、1,1-亚乙基、1,3-亚丙基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基等。
在本说明书中，“C2-6烯基”是指具有1个双键的、碳原子数为2～6个的直链状或支链状烯基，作为具体的例子，可以列举出：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、戊烯基、己烯基等。
在本说明书中，“C2-6炔基”是指具有1个三键的、碳原子数为2～6个的直链状或支链状炔基，作为具体的例子，可以列举出：乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、戊炔基、己炔基等。
在本说明书中，“C3-8环烷基”是指碳原子数为3～8个的单环或二环饱和脂肪族烃基，作为具体的例子，可以列举出：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、双环[2.1.0]戊基、双环[3.1.0]己基、双环[2.1.1]己基、双环[4.1.0]庚基、双环[2.2.1]庚基(降冰片烷基)、双环[3.3.0]辛基、双环[3.2.1]辛基、双环[2.2.2]辛基等。
作为“C3-8环烷基”的优选例，可以列举出环丙基、环丁基、环戊基。
在本说明书中，“C6-10芳基”是指碳原子数为6～10个的芳香性环烃基，作为具体的例子，可以列举出：苯基、1-萘基、2-萘基、茚基、薁基等。
作为“C6-10芳基”的优选例，可以列举出苯基。
在本说明书中，“杂原子”是指氮原子、氧原子或硫原子。
在本说明书中，“5～10员杂芳基”是指成环原子数为5～10个、且成环原子中包含1～5个杂原子的芳香性环基，作为具体的例子，可以列举出：呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、三唑基、四唑基、噻唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、异噻唑基、呋咱基、噻二唑基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、嘌呤基、蝶啶基、喹啉基、异喹啉基、萘啶基、喹 喔啉基、口普啉基、喹唑啉基、酞嗪基、咪唑并吡啶基、咪唑噻唑基、咪唑噁唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、吡咯并吡啶基、噻吩并吡啶基、呋喃并吡啶基、苯并噻二唑基、苯并噁二唑基、吡啶并嘧啶基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、噻吩并呋喃基等。
作为“5～10员杂芳基”的优选例，可以列举出：呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、异噻唑基、吡啶基、嘧啶基。
在本说明书中、“3～10员非芳香族杂环基”是指满足下述条件的非芳香性环基：
(a)成环原子数为3～10个
(b)成环原子中包含1～2个杂原子
(c)环中任选包含1～2个双键
(d)环中任选包含1～3个羰基、亚磺酰基或磺酰基
(e)单环或二环，
当成环原子中含有氮原子时，氮原子上也可以有半键(結合手)。
作为具体的例子，可以列举出：氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、氮杂环庚烷基、氮杂环辛烷基、哌嗪基、二氮杂环庚烷基、二氮杂环辛烷基、二氮杂双环[2.2.1]庚基、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧代硫代吗啉基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、二氧杂环戊烷基、四氢吡喃基、二氧杂环己烷基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、噁唑烷基、噻唑烷基等。
作为“3～10员非芳香族杂环基”优选例，可以列举出：氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、氮杂环庚烷基、哌嗪基、二氮杂环庚烷基、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧代硫代吗啉基、四氢呋喃基、四氢吡喃基。
在本说明书中，“C1-6烷氧基”是指在上述定义的“C1-6烷基”的末端键合氧原子后所成的基团，作为具体的例子，可以列举出：甲氧基、乙氧基、1-丙氧基(正丙氧基)、2-丙氧基(异丙氧基)、2-甲基-1-丙氧基(异丁氧基)、2-甲基-2-丙氧基(叔丁氧基)、1-丁氧基(正丁氧基)、2-丁氧基(仲丁氧基)、1-戊基氧基、2-戊基氧基、3-戊基氧基、2-甲基-1-丁氧基、3-甲基-1-丁氧基、2-甲基-2-丁氧基、3-甲基-2-丁氧基、2,2-二甲基-1-丙氧基、1-己基氧基、2-己基氧基、3-己基氧基、2-甲基-1-戊基氧基、3-甲基-1-戊基氧基、4-甲基-1-戊基氧基、2-甲基-2-戊基氧基、3-甲基-2-戊基氧基、4-甲基-2-戊基氧基、2-甲基-3- 戊基氧基、3-甲基-3-戊基氧基、2,3-二甲基-1-丁氧基、3,3-二甲基-1-丁氧基、2,2-二甲基-1-丁氧基、2-乙基-1-丁氧基、3,3-二甲基-2-丁氧基、2,3-二甲基-2-丁氧基等。
作为“C1-6烷氧基”的优选例，可以列举出：甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、2-甲基-1-丙氧基、2-甲基-2-丙氧基、1-丁氧基、2-丁氧基。
在本说明书中，“C1-6烷硫基”是指在上述定义的“C1-6烷基”的末端键合硫原子后所成的基团，作为具体的例子，可以列举出：甲基硫基、乙基硫基、1-丙基硫基(正丙基硫基)、2-丙基硫基(异丙基硫基)、2-甲基-1-丙基硫基(异丁基硫基)、2-甲基-2-丙基硫基(叔丁基硫基)、1-丁基硫基(正丁基硫基)、2-丁基硫基(仲丁基硫基)、1-戊基硫基、2-戊基硫基、3-戊基硫基、2-甲基-1-丁基硫基、3-甲基-1-丁基硫基、2-甲基-2-丁基硫基、3-甲基-2-丁基硫基、2,2-二甲基-1-丙基硫基、1-己基硫基、2-己基硫基、3-己基硫基、2-甲基-1-戊基硫基、3-甲基-1-戊基硫基、4-甲基-1-戊基硫基、2-甲基-2-戊基硫基、3-甲基-2-戊基硫基、4-甲基-2-戊基硫基、2-甲基-3-戊基硫基、3-甲基-3-戊基硫基、2,3-二甲基-1-丁基硫基、3,3-二甲基-1-丁基硫基、2,2-二甲基-1-丁基硫基、2-乙基-1-丁基硫基、3,3-二甲基-2-丁基硫基、2,3-二甲基-2-丁基硫基等。
作为“C1-6烷硫基”的优选例，可以列举出：甲基硫基、乙基硫基、1-丙基硫基(正丙基硫基)、2-丙基硫基(异丙基硫基)、2-甲基-1-丙基硫基(异丁基硫基)、2-甲基-2-丙基硫基(叔丁基硫基)、1-丁基硫基(正丁基硫基)、2-丁基硫基(仲丁基硫基)。
在本说明书中，“C3-8环烷氧基”是指在上述定义的“C3-8环烷基”的末端键合氧原子后所成的基团，作为具体的例子，可以列举出：环丙氧基、环丁氧基、环戊基氧基、环己基氧基、环庚基氧基、环辛基氧基、双环[2.1.0]戊基氧基、双环[3.1.0]己基氧基、双环[2.1.1]己基氧基、双环[4.1.0]庚基氧基、双环[2.2.1]庚基氧基(降冰片烷基氧基)、双环[3.3.0]辛基氧基、双环[3.2.1]辛基氧基、双环[2.2.2]辛基氧基等。
作为“C3-8环烷氧基”的优选例，可以列举出环丙氧基、环丁氧基、环戊基氧基。
在本说明书中，“单C1-6烷基氨基”是指将氨基中的1个氢原子用上述定义的“C1-6烷基”取代后而成的基团，作为具体的例子，可以列举出：甲基氨基、乙基氨基、1-丙基氨基(正丙基氨基)、2-丙基氨基(异丙基氨基)、2-甲基 -1-丙基氨基(异丁基氨基)、2-甲基-2-丙基氨基(叔丁基氨基)、1-丁基氨基(正丁基氨基)、2-丁基氨基(仲丁基氨基)、1-戊基氨基、2-戊基氨基、3-戊基氨基、2-甲基-1-丁基氨基、3-甲基-1-丁基氨基、2-甲基-2-丁基氨基、3-甲基-2-丁基氨基、2,2-二甲基-1-丙基氨基、1-己基氨基、2-己基氨基、3-己基氨基、2-甲基-1-戊基氨基、3-甲基-1-戊基氨基、4-甲基-1-戊基氨基、2-甲基-2-戊基氨基、3-甲基-2-戊基氨基、4-甲基-2-戊基氨基、2-甲基-3-戊基氨基、3-甲基-3-戊基氨基、2,3-二甲基-1-丁基氨基、3,3-二甲基-1-丁基氨基、2,2-二甲基-1-丁基氨基、2-乙基-1-丁基氨基、3,3-二甲基-2-丁基氨基、2,3-二甲基-2-丁基氨基等。
在本说明书中，“二C1-6烷基氨基”是指将氨基中的2个氢原子分别用相同或不同的上述定义的“C1-6烷基”取代后而成的基团，作为具体的例子，可以列举出：N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、N，N-二-正丙基氨基、N，N-二-异丙基氨基、N，N-二-正丁基氨基、N，N-二-异丁基氨基、N，N-二-仲丁基氨基、N，N-二-叔丁基氨基、N-乙基-N-甲基氨基、N-正丙基-N-甲基氨基、N-异丙基-N-甲基氨基、N-正丁基-N-甲基氨基、N-异丁基-N-甲基氨基、N-仲丁基-N-甲基氨基、N-叔丁基-N-甲基氨基等。
在本说明书中，“C2-7酰基”是指键合有上述定义的“C1-6烷基”的羰基，作为具体的例子，可以列举出例如：乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、三甲基乙酰基等。
在本说明书中，“C2-7烷氧基羰基”是指键合有上述定义的“C1-6烷氧基”的羰基，作为具体的例子，可以列举出例如：甲氧基羰基、乙氧基羰基、1-丙基氧羰基、2-丙基氧羰基、2-甲基-2-丙氧基羰基等。
在本说明书中，“任选具有取代基的”是指“任选在可取代的部位上以任意组合的形式具有1个或数个取代基”，作为取代基的具体例子，可以列举出例如：卤素原子、羟基、巯基、硝基、氰基、甲酰基、羧基、氨基、甲硅烷基、甲磺酰基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、C6-10芳基、5～10员杂芳基、3～10员非芳香族杂环基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、C3-8环烷氧基、单C1-6烷基氨基、二C1-6烷基氨基、C2-7酰基或C2-7烷氧基羰基等。这里，C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、C6-10芳基、5～10员杂芳基、3～10员非芳香族杂环基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、C3-8环烷氧基、单C1-6烷基氨基、二C1-6烷基氨基、C2-7酰基以及C2-7烷氧基羰基彼此独立，任 选具有选自下述取代基群中的1～3个基团。
<取代基群>
卤素原子、羟基、巯基、硝基、氰基、C1-6烷基、C3-8环烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、5～10员杂芳基、3～10员非芳香族杂环基、C1-6烷氧基以及C1-6烷硫基。
在本发明中，RET激酶抑制物质可以列举出例如下面的通式(I)所表示的化合物
通式(I)
(i)R1
R1为用式-V1-V2-V3(式中，V1表示任选具有取代基的C1-6亚烷基；V2表示单键、氧原子、硫原子、羰基、亚磺酰基、磺酰基、式-CONR6-表示的基团、式-SO2NR6-表示的基团、式-NR6SO2-表示的基团、式-NR6CO-表示的基团或式-NR6-表示的基团(式中，R6表示氢原子、任选具有取代基的C1-6烷基或任选具有取代基的C3-8环烷基)；V3表示氢原子、任选具有取代基的C1-6烷基、任选具有取代基的C2-6烯基、任选具有取代基的C2-6炔基、任选具有取代基的C3-8环烷基、任选具有取代基的C6-10芳基、任选具有取代基的5～10员杂芳基或任选具有取代基的3～10员非芳香族杂环基)表示的基团。
作为R1的优选例，可以列举出C1-6烷基。而且，该情况下，R1任选具有选自任选具有C1-6烷基的3～10员非芳香族杂环基、羟基、C1-6烷氧基、氨基、单C1-6烷基氨基及二C1-6烷基氨基中的取代基。
作为R1的更优选例，可以列举出：甲基或式
(式中，Ra3表示甲基；Ra1表示氢原子或羟基；Ra2表示甲氧基、乙氧基、1-吡咯烷基、1-哌啶基、4-吗啉基、二甲基氨基或二乙基氨基)中的任何一个所表示的基团。
作为R1的更优选例，可以列举出：甲基或2-甲氧基乙基。
(ii)R2
R2为氰基、任选具有取代基的C1-6烷氧基、羧基、任选具有取代基的C2-7烷氧基羰基或式-CONVa11Va12(式中，Va11表示氢原子、任选具有取代基的C1-6烷基、任选具有取代基的C2-6烯基、任选具有取代基的C2-6炔基、任选具有取代基的C3-8环烷基、任选具有取代基的C6-10芳基、任选具有取代基的5～10员杂芳基或任选具有取代基的3～10员非芳香族杂环基；Va12表示氢原子、任选具有取代基的C1-6烷基、任选具有取代基的C2-6烯基、任选具有取代基的C2-6炔基、任选具有取代基的C3-8环烷基、任选具有取代基的C6-10芳基、任选具有取代基的5～10员杂芳基、任选具有取代基的3～10员非芳香族杂环基、羟基、任选具有取代基的C1-6烷氧基或任选具有取代基的C3-8环烷氧基)表示的基团。
作为R2的优选例，可以列举出：氰基或式-CONVa11Va12(式中，Va11以和Va12同前述定义)表示的基团。
作为R2的更优选例，可以列举出：氰基或式-CONHVa16(式中，Va16表示氢原子、C1-6烷基、C3-8环烷基、C1-6烷氧基或C3-8环烷氧基，而且Va16任选具有选自卤素原子、氰基、羟基及C1-6烷氧基中的取代基)表示的基团。
作为R2的更优选例，可以列举出式-CONHVa17(式中，Va17表示氢原子、C1-6烷基或C1-6烷氧基)表示的基团。
作为R2的最优选例，可以列举出式-CONHVa18(式中，Va18表示氢原子、甲基或甲氧基)表示的基团。
(iii)Y1
Y1为式
(式中，R7和R8彼此独立，表示氢原子、卤素原子、氰基、硝基、氨基、任选具有取代基的C1-6烷基、任选具有取代基的C3-8环烷基、任选具有取代基的C1-6烷氧基、任选具有取代基的C1-6烷硫基、甲酰基、任选具有取代基的C2-7酰基、任选具有取代基的C2-7烷氧基羰基或式-CONVd1Vd2(式中，Vd1和Vd2彼此独立，表示氢原子或任选具有取代基的C1-6烷基)表示的基团；
W1和W2彼此独立，表示任选具有取代基的碳原子或氮原子)表示的基 团。
作为Y1的优选例，可以列举出式
(式中，R71表示氢原子或卤素原子)表示的基团。
(iv)R3和R4
R3和R4彼此独立，表示氢原子、任选具有取代基的C1-6烷基、任选具有取代基的C2-6烯基、任选具有取代基的C2-6炔基、任选具有取代基的C3-8环烷基、任选具有取代基的C2-7酰基或任选具有取代基的C2-7烷氧基羰基。
作为R3和R4的优选例，可以列举出氢原子。
(v)R5
R5表示氢原子、任选具有取代基的C1-6烷基、任选具有取代基的C2-6烯基、任选具有取代基的C2-6炔基、任选具有取代基的C3-8环烷基、任选具有取代基的C6-10芳基、任选具有取代基的5～10员杂芳基、任选具有取代基的3～10员非芳香族杂环基。
作为R5的优选例，可以列举出：氢原子、任选具有取代基的C1-6烷基、任选具有取代基的C2-6烯基、任选具有取代基的C2-6炔基、任选具有取代基的C3-8环烷基、任选具有取代基的C6-10芳基、任选具有取代基的3～10员非芳香族杂环基。
作为R5的更优选例，可以列举出：氢原子、C1-6烷基、C3-8环烷基或C6-10芳基(而且，R5任选具有选自卤素原子和甲磺酰基中的至少一种取代基)。
作为R5的更优选例，可以列举出甲基、乙基或环丙基。
此外，作为通式(I)所表示的化合物的优选例，可以列举出：
N-(4-(6-氰基-7-(2-甲氧基乙氧基)-4-喹啉基)氧-2-氟苯基)-N’-(4-氟苯基)脲、
N-(2-氯-4-((6-氰基-7-((1-甲基-4-哌啶ル)甲氧基)-4-喹啉基)氧)苯基)-N’-环丙基脲、
N-(4-((6-氰基-7-(((2R)-3-(二乙基氨基)-2-羟基丙基)氧)-4-喹啉基)氧)苯基)-N’-(4-氟苯基)脲、
N-(4-((6-氰基-7-(((2R)-2-羟基-3-(1-吡咯烷基)丙基)氧)-4-喹啉基)氧)苯 基)-N’-(4-氟苯基)脲、
4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-(2-甲氧基乙氧基)-6-氨甲酰喹啉、
N6-环丙基-4-(3-氯-4-(((环丙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
N6-(2-甲氧基乙基)-4-(3-氯-4-(((环丙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
N6-(2-氟乙基)-4-(3-氯-4-(((环丙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
N6-甲氧基-4-(3-氯-4-(((环丙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
N6-甲基-4-(3-氯-4-(((环丙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
N6-乙基-4-(3-氯-4-(((环丙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氟-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-(2-甲氧基乙氧基)-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-(2-羟基乙氧基)-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-((2S)-2,3-二羟基丙基)氧-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氯-4-(甲基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氯-4-(乙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
N6-甲氧基-4-(3-氯-4-(((乙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-(2-乙氧基乙氧基)-6-氨甲酰喹啉、
4-(4-((环丙基氨基)羰基)氨基苯氧基)-7-(2-甲氧基乙氧基)-6-氨甲酰喹啉、
N-(2-氟-4-((6-氨基甲酰基-7-甲氧基-4-喹啉基)氧)苯基)-N’-环丙基脲、
N6-(2-羟基乙基)-4-(3-氯-4-(((环丙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氯-4-(1-丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氯-4-(cis-2-氟-环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
N6-甲基-4-(3-氯-4-(((环丙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-(2-甲氧基乙氧基)-6-氨甲酰喹啉、
N6-甲基-4-(3-氯-4-(((乙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-(2-(4-吗啉基)乙氧基)-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氯-4-(2-氟乙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
N6-((2R)四氢-2-呋喃基甲基)-4-(3-氯-4-(((甲基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氟-4-(乙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氯-4-(((环丙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-((2R)-2-羟基-3-(1-吡咯烷基)丙氧基)-6-氨甲酰喹啉、
N6-甲基-4-(3-氯-4-(((甲基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-((2R)-3-二乙基氨基-2-羟基丙氧基)-6-氨甲酰喹啉、
N6-甲基-4-(3-氯-4-(((乙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-((2R)-3-二乙基氨基-2-羟基丙氧基)-6-氨甲酰喹啉、
N6-甲基-4-(3-氯-4-(((甲基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-((2R)-2-羟基-3-(1-吡咯烷基)丙氧基)-6-氨甲酰喹啉、
N6-甲基-4-(3-氯-4-(((乙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-((2R)-2-羟基-3-(1-吡咯烷基)丙氧基)-6-氨甲酰喹啉、
N6-甲基-4-(3-氯-4-(((甲基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-((1-甲基-4-哌啶ル)甲氧基)-6-氨甲酰喹啉、
N6-甲基-4-(3-氯-4-(((乙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-((1-甲基-4-哌啶ル)甲氧基)-6-氨甲酰喹啉、
N-(4-(6-氰基-7-(2-甲氧基乙氧基)-4-喹啉基)氧-2-氟苯基)-N’-环丙基脲、
N-(4-(6-氰基-7-(3-(4-吗啉基)丙氧基)-4-喹啉基)氧苯基)-N’-(3-(甲基磺酰 基)苯基)脲、
4-(4-((环丙基氨基)羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氟-4-((2-氟乙基氨基)羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
N6-(2-乙氧基乙基)-4-(3-氯-4-(((甲基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
4-(4-(3-乙基脲基)-3-氟-苯氧基)-7-甲氧基喹啉-6-羧酸(2-氰基乙基)酰胺
以及
N-(4-(6-(2-氰基乙基)氨基甲酰基-7-甲氧基-4-喹啉基)氧-2-氟苯基)-N’-环丙基脲。
而且，作为通式(I)所表示的化合物的更优选例，可以列举出：
4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氯-4-(乙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
N6-甲氧基-4-(3-氯-4-(((环丙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、
4-(3-氯-4-(甲基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉
以及
N6-甲氧基-4-(3-氯-4-(((乙基氨基)羰基)氨基)苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉。
此外，作为通式(I)所表示的化合物的更优选例，可以列举出：4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉(参见式(II))。
作为RET激酶抑制物质的最优选例，可以列举出4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉的甲磺酸盐。
通式(I)所表示的化合物可以采用已知方法制造，例如可以根据国际公开第02/32872号小册子(WO02/32872)以及国际公开第2005/063713号小册子(WO2005/063713)中描述的方法来制造。
此外，在本发明中，RET激酶抑制物质可以列举出例如：
5-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙基氨基乙基)酰胺(以下也称“SU11248”，Clinical Cancer Research，9，327-337，2003、Journal of Medicinal Chemistry.，46：1116-9，2003.、WO01/060814)(参见式(III))、
N-{2-氯-4-[(6，7-二甲氧基-4-喹啉基)氧]苯基}-N’-(5-甲基-3-异噁唑)脲(以下也称“KRN951”，WO02/088110)(参见式(IV))、
4-[(4-氟-2-甲基吲哚-5-基)氧]-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉(以下，也称“AZD2171”，Cancer Research.65：4389-400，2005、WO00/47212)(参见式(V))、
等等。
SU11248、KRN951和AZD2171可以采用已知方法制造，例如可以根据上述每个文献中描述的方法来制造。
在本发明中，有些情况下，RET激酶抑制物质与酸或碱形成药理学可接受的盐。本发明的上述RET激酶抑制物质还包含这些药理学可接受的盐。作为与酸形成的盐可以列举出例如：与盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐等形成的无机酸盐以及与甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、安息香酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸酸、三氟乙酸等形成的有机酸盐等。此外，作为与碱形成的盐，可以列举出：钠盐、 钾盐等碱金属盐，钙盐、镁盐等碱土金属盐，三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、二环己基胺、N，N’-二苄基亚乙基二胺、精氨酸、赖氨酸等有机碱盐，氨盐等。
此外，在本发明中，当存在这些化合物的溶剂合物及光学异性体时，RET激酶抑制物质包括它们的溶剂合物及光学异性体。溶剂合物可以列举出例如水合物、非水合物等，优选可以列举出水合物。溶剂可以列举出例如：水、醇(例如、甲醇、乙醇、正丙醇)、二甲基甲酰胺等。
而且，在本发明中，RET激酶抑制物质可以是晶体也可以是非晶体，此外，当存在晶体同质多晶时，可以是它们之中任意一种晶形的单一物纯品，也可以是这些晶形的混合物。
此外，在本发明中，RET激酶抑制物质还包括在生物体内受到氧化、还原、水解、结合(抱合)等代谢的RET激酶抑制物质。此外，在本发明中，RET激酶抑制物质还包括在生物体内受到氧化、还原、水解等代谢、生成RET激酶抑制物质的化合物。
而且，本发明的RET激酶抑制物质具有抑制RET激酶活性的活性(也称“RET激酶抑制活性)。本发明的RET激酶抑制物质只要具有抑制RET的激酶活性的作用即可，对其抑制程度没有限制。RET激酶抑制物质的RET激酶抑制活性的测定方法可以列举出例如：无细胞(Cell free)激酶试验、western印迹、细胞增殖试验、生存试验等。细胞增殖试验可以列举出例如：氚胸苷(トリチウムチミジン)摄入法、MTT法、XTT法(cell counting kit-8(同仁化学公司))、阿拉玛蓝(アラマーブルー)法、中性红法、BrdU法、Ki67染色法、PCNA染色法等。生存试验可以列举出例如：TUNNEL染色法、Caspase-3切割检测法、PARP切割检测法等。这些方法可以按常规进行(Blood.2005，105，2941-2948.，Molecular Cancer Therapeutics.2005，4，787-798.)。
以下，描述RET激酶抑制活性测定方法的一个例子。
RET激酶抑制活性可以通过无细胞激酶试验来测定。
RET可以按常规通过基因工程方法来制备。例如，采用杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression System)方法，可以使昆虫细胞(草地夜蛾(Spondoptea frugiperda)9(Sf9))以人重组体GST融合蛋白质、人重组体组氨酸标签融合蛋白质等的形式来表达。此外，表达出的重组体蛋白质可以采用亲合柱层析(例如、GSH-琼脂糖(SIGMA公司制)或Ni-NTH-琼脂糖(QIAGEN 公司制)等)进行纯化。蛋白质的纯度以及鉴定可以采用SDS-PAGE、银染色以及使用针对RET的特异抗体的western印迹来确认。
无细胞激酶试验可以如下述地进行。
首先，可以在板(例如、96孔、384孔等)的各孔中依次添加标准反应液20μl、ATP溶液5μl、受试物质5μl、含RET重组体蛋白质50ng的溶液10μl以及含生物素化修饰Poly(Glu，Tyr)4：1125ng的溶液10μl的混合溶液。
该激酶反应液50μl中可以含有60mM HEPES-NaOH(pH7.5)、3mM MgCl2、3mM MnCl2、3μM原矾酸钠、1.2mM DTT、50μg/ml PEG20000、1μM ATP等。此时，ATP可以使用[γ-32P]-ATP、[γ-33P]-ATP等放射性同位素标记的ATP。
将反应液温育一定时间后，可以添加2％(v/v)H3PO4溶液50μl来终止反应。
可以适宜地对各孔进行清洗操作。
通过测定ATP摄入量，可以评价RET激酶抑制活性。当使用上述放射性同位素标记ATP时，ATP的摄入量可以通过用闪烁计数器测定板上捕捉的放射活性来评价。
通过上述方法，可以评价化合物的RET激酶抑制活性。
(5)治疗剂、药物组合物、治疗方法
本发明的治疗剂是含有RET激酶抑制物质、且针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗剂。此外，本发明的治疗剂是含有RET激酶抑制物质、且针对甲状腺癌的治疗剂。本发明的治疗剂优选用于包含突变型RET表达细胞的疾病。
本发明的治疗剂可以施用于有必要进行上述疾病治疗的生物体，即哺乳动物(例如人、大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴等)。
此外，本发明的药物组合物是用于施用于包含突变型RET表达细胞的生物体的、含有RET激酶抑制物质的药物组合物。
本发明的药物组合物可以作为针对以表达突变型RET为特征的疾病的治疗剂使用。作为以表达突变型RET为特征的疾病，可以列举出例如：多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样 癌、甲状腺癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生、胃肠道粘膜神经瘤等。
本发明的药物组合物可以施用于生物体，即哺乳动物(例如人、大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴等)。在本发明中，该生物体为包含突变型RET表达细胞的生物体。
在本发明中，治疗剂包括预后改善剂以及复发预防剂等。当为癌或肿瘤的治疗剂时，治疗剂还包括抗肿瘤剂以及癌转移移抑制剂等。
治疗的效果可以通过放射线照片、CT等的观察结果、活检的病理组织诊断来确认，或者通过疾病标志物的值来确认。
当使用本发明的治疗剂或药物组合物时，RET激酶抑制物质的施用量因症状程度、患者年龄、性别、体重、敏感性差异、施用方法、施用时期、施用间隔、药物制剂的性质、调剂、种类、有效成分的种类等而异，并非特殊限制，但通常成人(体重60Kg)每日为0.1～1000mg、优选0.5～100mg、更优选1～30mg，这些通常1日分1～3次施用。
含有本发明的RET激酶抑制物质作为有效成分的治疗剂或药物组合物可以直接使用，通常，可以使用混合了适当添加剂的制剂化后的制品。
作为上述添加剂，可以列举出一般在药物中使用的赋形剂、粘合剂、滑润剂、崩解剂、着色剂、矫味剂、乳化剂、表面活性剂、增溶剂、悬助剂、等渗剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、吸收促进剂等，根据需要，它们可以适宜地组合使用。以下举出上述添加剂的例子。
赋形剂：乳糖、白糖、葡萄糖、玉米淀粉、甘露醇、山梨醇、淀粉、α化淀粉、糊精、结晶纤维素、轻质无水硅酸、硅酸铝、硅酸钙、偏硅酸铝酸镁、磷酸氢钙
粘合剂：例如聚乙烯醇、甲基纤维素、乙基纤维素、阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、紫胶、羟基丙基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇
滑润剂：硬脂酸镁、硬脂酸钙、富马酸硬脂基钠、滑石、聚乙二醇、胶体二氧化硅
崩解剂：结晶纤维素、琼脂、明胶、碳酸钙、碳酸氢钠、柠檬酸钙、糊精、果胶、低取代度羟基丙基纤维素、羧基甲基纤维素、羧基甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、羧基甲基淀粉、羧基甲基淀粉钠
着色剂：氧化铁、黄色氧化铁、肌苷、焦糖、β-胡萝卜素、氧化钛、滑石、磷酸核黄素钠、黄色铝色淀等允许在药品中添加的着色剂
矫味剂：可可粉、薄荷脑、芳香粉、薄荷油、龙脑、桂皮粉
乳化剂或表面活性剂：硬脂酰三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、十二烷基氨基丙酸、卵磷脂、单硬脂酸甘油、蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯
增溶剂：聚乙二醇、丙二醇、苯甲酸苯甲酯、乙醇、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠、聚山梨酯80、烟酰胺
悬助剂：除所述表面活性剂之外，例如聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、甲基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素等亲水性高分子
等渗剂：葡萄糖、氯化钠、甘露醇、山梨醇
缓冲剂：磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等的缓冲液
防腐剂：尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、三氯叔丁醇、苄醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸
抗氧化剂：硫酸盐、抗坏血酸、α-生育酚
稳定剂：一般用于药物的
吸收促进剂：一般用于药物的
此外，根据需要，还可以配合维生素类、氨基酸等成分。
此外，作为上述制剂，可以列举出：片剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、胶囊剂、糖浆剂、含片剂、吸入剂等口服剂；栓剂、软膏剂、眼软膏剂、带剂(テ一プ剂)、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂、罨剂、洗剂等外用剂或注射剂。
上述口服剂可以与上述添加剂适宜组合而制剂化。而且，视需要，可以对它们的表面进行包衣。
上述外用剂可以与上述添加剂中的、特别是赋形剂、粘合剂、矫味矫臭剂、乳化剂、表面活性剂、增溶剂、悬助剂、等渗剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂或吸收促进剂适宜组合而制剂化。
上述注射剂可以与上述添加剂中的、特别是乳化剂、表面活性剂、增溶剂、悬助剂、等渗剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂或吸收促进剂适宜组合而制剂化。注射剂可以以点滴、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射等方法使用。
本发明包括以将有效量的RET激酶抑制物质施用于患者为特征的、选 自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗方法。此外，本发明包括以将有效量的RET激酶抑制物质施用于患者为特征的针对甲状腺癌的治疗方法。
而且，本发明包括以对包含突变型RET表达细胞的生物体施用有效量的RET激酶抑制物质为特征的疾病治疗方法。在本发明中，上述疾病优选为选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病。
在本发明的治疗方法中，对于RET激酶抑制物质的施用途径和施用方法没有特别限制，可以参照上述关于本发明的治疗剂或药物组合物的描述。
本发明包括RET激酶抑制物质在制造针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗剂中的用途。此外，本发明包括RET激酶抑制物质在制造针对甲状腺癌的治疗剂中的用途。
而且，还包括RET激酶抑制物质在制造用于施用于包含突变型RET表达细胞的生物体的、含有RET激酶抑制物质的药物组合物的制造中的用途。在本发明的应用中，上述药物组合物作为针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗剂是有用的。
本发明包括用于针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗剂的RET激酶抑制物质。此外，本发明包括用于针对甲状腺癌的治疗剂的RET激酶抑制物质。
而且，包括用于下述药物组合物的RET激酶抑制物质，所述药物组合物用于施用于包含突变型RET表达细胞的生物体且含有RET激酶抑制物质。在本发明中，上述药物组合物作为针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、 多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗剂是有用的。
此外，本发明提供含有用通式(I)表示的化合物、或其药理学可接受的盐、或者它们的溶剂合物的RET激酶抑制剂。
用通式(I)表示的化合物如上述，其中，好选4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉。
而且，本发明提供含有选自5-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙基氨基乙基)酰胺(SU11248)、
N-{2-氯-4-[(6，7-二甲氧基-4-喹啉基)氧]苯基}-N’-(5-甲基-3-异噁唑)脲(KRN951)
以及
4-[(4-氟-2-甲基吲哚-5-基)氧]-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉(AZD2171)
中的至少一种化合物、或其药理学可接受的盐、或者它们的溶剂合物的RET激酶抑制剂。
本发明的RET激酶抑制剂所具有的RET激酶抑制活性可以如前述地进行测定。
本发明的RET激酶抑制剂可以以化合物状态直接使用，也可以使用与所述的适当添加剂混和而制剂化的制品。
本发明RET激酶抑制剂的用法、用量可以参照上述对治疗剂或药物组合物的描述。
此外，本发明还包括选自用通式(I)表示的化合物、SU11248、KRN951以及AZD2171中的至少一种化合物、或其药理学可接受的盐、或者它们的溶剂合物在制造RET激酶抑制剂中的用途。
而且，本发明还包括通过选自用通式(I)表示的化合物、SU11248、KRN951以及AZD2171中的至少一种化合物、或其药理学可接受的盐、或者它们的溶剂合物的RET激酶抑制方法。本发明的方法中，对于该化合物等的用法、用量没有特殊限制，可以参照上述的关于治疗剂或药物组合物的描述。
2.预测敏感性的方法
本发明提供以细胞中有无RET突变为指标，来预测患者对本发明的RET激酶抑制物质是否高敏感性的方法。对RET激酶抑制物质敏感性高的患者是使用该物质的治疗效果更令人期待的患者。
在本发明的方法中，患者优选为选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的患者。
(1)测定细胞中有无RET突变的步骤
在本步骤中，细胞优选为取自患者的细胞。而且，例如，细胞可以通过采用外科的处置(例如，活组织检查等)从患者取出而得到。此外，在多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺癌、甲状腺乳头癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤等起因于遗传学突变的疾病中，细胞优选使用血液细胞。
RET突变的有无可以采用前述方法测定。
(2)预测患者对RET激酶抑制物质是否高敏感性的步骤
本步骤中，可以优选以(1)中测定的细胞中有无RET突变为指标，来预测患者对RET激酶抑制物质是否为高敏感性。即，当测定的细胞中表达突变型RET时，可以判定患者对RET激酶抑制物质为高敏感性。
作为本发明的其它实施方式，可以列举出：以(1)的测定结果为指标，来分析细胞对RET激酶抑制物质的敏感性的方法。即，根据(1)的测定结果，当细胞表达突变型RET时，判定为：与不表达突变型RET的细胞相比，该细胞对RET激酶抑制物质显示高敏感性。
此外，作为本发明的其它实施方式，可以列举出：将(1)测定结果用作指标，来选择对于RET激酶抑制物质显示高敏感性的细胞或患者的方法。即，根据(1)的测定结果，当细胞表达突变型RET时，判定为：该细胞或具有该细胞的患者对RET激酶抑制物质显示高敏感性。因此，可以选择这样的细胞或患者作为对RET激酶抑制物质显示高敏感性的细胞或患者。
此外，作为本发明的其它实施方式，可以列举出：以(1)的测定结果为指标来分析对于RET激酶抑制物质的敏感性，并根据分析结果对患者进行分类的方法。即，在本发明的方法中，可以根据(1)的测定结果，如上述地分析对于RET激酶抑制物质的敏感性，并基于该分析结果，对包含指定细胞的 患者进行分类。例如，可以将患者分成：包含突变型RET表达细胞的组和包含不表达细胞的组。或者，可以将患者分成：对于RET激酶抑制物质显示高敏感性的组和其它组。
此外，作为本发明的其它实施方式，可以列举出：选择作为RET激酶抑制物质的施用对象的患者的方法，该方法包括根据(1)的测定结果，选择具有突变型RET表达细胞的患者。具有突变型RET表达细胞的患者是RET激酶抑制物质的施用对象。
此外，作为本发明的其它实施方式，可以列举出：根据(1)的测定结果，来预测RET激酶抑制物质对患者的治疗效果的方法。在本发明的方法中，当(1)的测定结果为细胞表达突变型RET时，可以判定对RET激酶抑制物质显示高敏感性，因此，可以预测：该细胞或具有该细胞的患者中的该物质的治疗效果好。
此外，本发明包括：为预测患者对RET激酶抑制物质的敏感性程度而测定该患者来源的细胞中有无RET突变的方法。该测定方法如上述(1)所示。
通过测定RET突变的有无，可以预测患者对RET激酶抑制物质的敏感性程度。
在本步骤中，RET激酶抑制物质如前述，优选4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉、或其药理学可接受的盐、或者以上两者的溶剂合物。
本发明的方法可以用于在给患者施用RET激酶抑制物质前、对该患者中RET激酶抑制物质的有效性程度进行预测。而且，可以选择RET激酶抑制物质具有的效果更令人期待的患者，来进行疾病的治疗。因此，本发明在临床上是非常有价值的。
本发明提供：用于本发明的方法的、用于测定RET突变的有无的检查用试剂盒。本发明的检查用试剂盒含有在测定中使用的上述试剂。采用本发明的检查用试剂盒，可以预测患者对RET激酶抑制物质是否为高敏感性。
此外，本发明还包括上述用于预测的该检查用试剂盒的用途。
以下举出具体的例子来说明本发明，但本发明并不受它们的限制。
[实施例1]RET激酶抑制物质的RET激酶抑制活性的测定
受试物质的RET激酶抑制活性委托ProQinase公司(Freiburg，德国、GmbH)实施。具体地，RET激酶抑制活性是如下述地测定的。
1.RET的表达和纯化
采用Baculovirus Expression System方法，在昆虫细胞(Spondoptea frugiperda 9(Sf9))中以人重组体GST融合蛋白质的形式表达了RET(以下也称“RET重组体蛋白质”)。表达的RET重组体蛋白质通过使用GSH-琼脂糖(SIGMA公司制)或Ni-NTH-琼脂糖(QIAGEN公司制)的亲合柱层析进行了纯化。蛋白质的纯度及鉴定，通过SDS-PAGE银染色以及使用针对RET的特异抗体的western印迹进行了确认。
2.对RET激酶活性的抑制活性的测定
首先，在链霉亲和素包被的96孔FlashPlate(Perkin Elmer/NEM公司制)的各孔中依次添加：标准反应液20μL、ATP溶液(用H2O稀释)5μL、受试物质5μL(10％二甲基亚砜水溶液)、以及下述混合溶液，所述混合溶液由含RET重组体蛋白质50ng的溶液10μL与含生物素化修饰Poly(Glu，Tyr)4：1125ng的溶液10μL混合而成。该激酶反应液50μL中包含：60mM HEPES-NaOH(pH7.5)、3mM MgCl2、3mM MnCl2、3μM原矾酸钠、1.2mM DTT、50μg/ml PEG20000、1μM[γ-33P]-ATP。
作为受试物质使用了4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉(甲磺酸盐)、6-[2-(甲基氨基甲酰基)苯基对氨基苯磺酰基(スルファニル)]-3-E-[2-(吡啶-2-基)乙烯基]吲唑(以下也称“AG013736”)、SU11248、KRN951或AZD2171。
而且，4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉是基于国际公开第02/32872号小册子(WO02/32872)以及国际公开第2005/063713号小册子(WO2005/063713)的描述制造的。
此外，AG013736是基于国际公开第01/002369号小册子(WO01/002369)的描述制造的。而且，SU11248是基于国际公开第01/060814号小册子(WO01/060814)的描述制造的。此外，KRN951是基于国际公开第02/088110号小册子(WO02/088110)的描述制造的。AZD2171是基于国际公开第00/47212号小册子(WO00/47212)的描述制造的。
接着，将反应液在30℃温育80分钟，然后添加2％(v/v)H3PO4溶液50μl终止了反应。
对96孔板的各孔进行2次清洗和吸取，每次使用0.9％(w/v)的NaCl溶液200μl。
通过用微板闪烁计数器(Microbeta，Wallac制)测定在板上捕捉到的放射活性，评价了33Pi的摄入量。
该操作通过BeckmanCoulter/Sagian robotic system进行。
利用各浓度(10μM～0.0003μM，10个点)下的33P比放射活性，使用Prism3.03(Windows，Graphpad，San Diego，California，USA)计算出了抑制50％的RET激酶活性所必需的受试物质浓度(IC50)。
此时，将仅加入不含RET重组体蛋白质的底物Poly(Glu，Tyr)4：1时的值设定为0％值，将未加入受试物质但加入了RET重组体蛋白质和底物Poly(Glu，Tyr)4：1时的值设定为100％值。
通过如下计算算出各浓度的受试物质存在下的激酶活性：计算出从各放射活性的值中减去0％值后的值相当于从100％值中减去0％值后的值的百分之多少。通过该比率(％)计算出了抑制50％的RET激酶活性所必需的受试物质的浓度(IC50)。
结果表明：4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉具有RET激酶抑制活性(IC50＝35nM)。此外，可知：SU11248、KRN951、AZD2171具有RET激酶抑制活性(各IC50＝64，92，75nM)。AG013736的IC50＝5600nM。而且，可知：各受试物质的RET激酶抑制活性存在程度上的差别。
[实施例2]RET激酶抑制物质对人甲状腺髓样癌细胞株(TT)中配体非依赖性RET磷酸化的效果
1.细胞提取液的制备
将人甲状腺髓样癌细胞株(TT，购自ATCC)悬浮于含15％FBS的RPMI1640培养基(购自Sigma公司)。而且，TT是表达在野生型RET的氨基酸序列中、密码子634的半胱氨酸突变成色氨酸后的RET的细胞(Biochemical and Biophysical Research Communications，207，1022-1028，1995.)。将该细胞悬浮液(4×105个/mL)以2mL/孔的量添加到细胞培养用6孔板(购自FALCON公司)，在5％CO2培养箱中(37℃)培养一夜。培养后，从各孔中去除上清，添加1.8mL的含15％FBS的RPMI1640培养基。再向其中 添加溶解于二甲基亚砜的受试物质4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉(甲磺酸盐)(用含15％FBS的RPMI1640培养基稀释)0.2mL，在5％CO2培养箱中(37℃)培养1小时。从各孔中除去上清，将各孔用PBS 400μL清洗，再向其中添加可溶化缓冲液(50mM Hepes(pH7.4)，150mM NaCl，10％(v/v)甘油、1％Triton X-100，1.5mM MgCl2，1mM EDTA(pH8.0)，100mM NaF，1mM PMSF，10μg/mL抑肽酶，50μg/mL亮抑酶肽，1μg/mL胃蛋白酶抑制剂A，1mM Na3VO4)100μL。用刮器(scraper)回收包含该溶液的细胞，4℃、15,000rpm处理15分钟，向上清中加入SDS缓冲液，然后94℃、处理5分钟，从而使蛋白质可溶化，将其制备成20μg/10μL，作为细胞提取液。
2.电泳及Western印迹
用4-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶(购自第一化学药品公司)对所述细胞提取液20μg/10μL进行电泳。电泳后，按常规方法转印至PVDF膜(购自Amersham pharmacia biotech公司)。而且，对于转印后的膜，使用抗RET抗体(anti-RET，购自Cell Signaling公司)、抗磷酸化RET抗体(购自anti-phospho RET(Tyr905)，Cell Signaling公司)、抗Erk1/2抗体(anti-Erk1/2，购自Cell Signaling公司)或抗磷酸化Erk1/2抗体(anti-phospho-Erk1/2，购自Cell Signaling公司)作为第一抗体、使用辣根过氧化物酶标记抗兔IgG抗体(anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody(购自Cell Signaling公司))作为第二抗体进行了免疫印迹。对膜进行清洗后，使用Super Signal(购自PIERCE公司)进行了显色。
以添加未加入受试物质的细胞提取液的孔的吸光度为100％的RET自磷酸化活性，求出了各泳道的RET自磷酸化活性(％)。分数个等级改变受试物质的浓度，求出各情况下的RET自磷酸化活性(％)，计算出受试物质抑制50％的RET自磷酸化活性所必需的受试物质浓度(IC50)。
其结果，4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉浓度依赖性地抑制了RET的磷酸化(IC50＝27nM)(图1)。此外，可知：对于与细胞增殖信号相关的Erk1/2(RET的下游分子之一)的磷酸化，4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉以与RET激酶等同的浓度对其进行了抑制(图1)。
[实施例3]RET激酶抑制物质对于人甲状腺髓样癌细胞株(TT)的细胞增殖的效果
将人甲状腺髓样癌细胞株(TT，购自ATCC)悬浮于含15％FBS的RPMI1640培养基(购自Sigma公司)。将细胞悬浮液(3×104个/mL)以0.1mL/孔添加到细胞培养用96孔板(购自NUNC公司)，在5％CO2培养箱中(37℃)培养一夜。培养后，向各孔中添加用含15％FBS的RPMI1640培养基稀释的受试物质4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉(甲磺酸盐)0.1mL，再于5％CO2培养箱中(37℃)培养10日。培养后，向各孔中添加Cell Counting Kit-1(购自DOJINDO公司)10μL，在5％CO2培养箱中(37℃)显色，然后，以415nm为测定波长、以660nm为对照波长，使用读板器MTP-500(KORONA电气公司制)对各孔的吸光度进行了测定。求出相对于未加受试物质的孔的吸光度的、添加了受试物质的各孔的吸光度的比率(％)，由该比率计算出抑制50％的细胞增殖所必需的受试物质浓度(IC50)。
结果表明：对于人甲状腺髓样癌细胞株(TT)的增殖，4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉具有IC50＝78nM的抑制活性。
[实施例4]人甲状腺髓样癌细胞株(TT)皮下移植模型中RET激酶抑制物质的抗肿瘤效果
将人甲状腺髓样癌细胞株(TT，购自ATCC)在37℃、5％二氧化碳培养箱内用RPMI1640(含15％FBS)培养至铺满约80％，按常规方法使用胰蛋白酶-EDTA回收了细胞。将细胞悬浮于磷酸缓冲液，制备了1×108细胞/mL的悬浮液。而且，将所得细胞悬浮液以每只0.1mL的量移植到了裸鼠(购自CHARLES RIVER公司)体侧皮下。
移植后，当肿瘤体积为约100～200mm3时，按下述方案口服施用了受试物质4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉(甲磺酸盐)：一次施用10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg，1日1次，施用4周。使用数字式测径仪(デジマチックキャリパ)(Mitsutoyo)测定肿瘤长径和短径，用下式计算出肿瘤体积。
肿瘤体积(TV)＝肿瘤长径(mm)×肿瘤短径2(mm2)/2
结果表明：在人甲状腺髓样癌细胞株(TT)皮下移植模型中，4-(3-氯-4-(环 丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉具有用量依赖性的抗肿瘤效果(图2)。
[实施例5]人甲状腺髓样癌细胞株(TT)皮下移植模型中RET激酶抑制物质对于RET的磷酸化的效果
将人甲状腺髓样癌细胞株(TT，购自ATCC)在37℃、5％二氧化碳培养箱内用RPMI1640(含15％FBS)培养至铺满约80％，按常规方法使用胰蛋白酶-EDTA回收了细胞。将细胞悬浮于磷酸缓冲液，制备了1×108细胞/mL的悬浮液。而且，将所得细胞悬浮液以每只0.1mL的量移植到了裸鼠(CHARLES RIVER公司购自)体侧皮下。
移植后，在肿瘤体积为约100～200mm3时，以10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg的量口服施用了受试物质4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉(甲磺酸盐)。施用后，在第2、8、12或24小时摘取肿瘤，向摘取的肿瘤加入可溶化缓冲液(50mM Hepes(pH7.4)，150mM NaCl，10％(v/v)甘油、1％Triton X-100，1.5mM MgCl2，1mM EDTA(pH8.0)，100mM NaF，1mMPMSF，10μg/mL抑肽酶，50μg/mL亮抑酶肽，1μg/mL胃蛋白酶抑制剂A，1mMNa3VO4)、25mMβ-磷酸甘油，磷酸酶抑制剂鸡尾酒II(SIGMA))，进行了匀浆。4℃、15,000rpm处理15分钟，向上清添加SDS缓冲液，然后94℃处理5分钟，从而使蛋白质可溶化，将其制备成20μg/10μL，作为细胞提取液。采用与实施例2相同的方法，用所述细胞提取液进行了电泳和免疫印迹。
结果表明：在人甲状腺髓样癌细胞株(TT)皮下移植模型中，确认具有抗肿瘤效果的施用量的4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉具有RET自磷酸化抑制活性(图3)。
这些结果显示：对于包含突变型RET表达细胞的生物体，本发明的RET激酶抑制物质可以期待更有效的效果。而且，显示：本发明的RET激酶抑制物质作为针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病以及甲状腺癌的治疗剂是有用的。
[参考例]
以下，作为参考例，说明RET激酶抑制物质之一即4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉的制剂的制造方法。
(药物组合物的制造)
(1)1mg片
将4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-氨甲酰喹啉甲磺酸盐的晶体(C)(以下也称“晶体(C)”，而且晶体(C)是按照WO2005/063713的实施例7中记载的方法制造的)24g与无水轻质硅酸(防凝胶化剂、商品名AEROSIL(注册商标)200、日本AEROSIL公司)192g在20L的超级混合器混合，然后再添加D-甘露醇(赋形剂，东和化成工业公司)1236g、结晶纤维素(赋形剂，商品名AVICEL PH101，旭化成工业公司)720g、羟基丙基纤维素(粘合剂，商品名HPC-L，日本曹达公司)72g并混合。其后，添加适量的无水乙醇，得到了含有晶体(C)的制粒物(造粒物)。将该制粒物用架式(架式)干燥机(60℃)干燥，然后，使用动力磨(パワーミル)进行整粒，得到了颗粒。将该颗粒与交联羧甲基纤维素钠(崩解剂、商品名Ac-Di-Sol、FMC International Inc.)120g、富马酸硬脂基钠(滑润剂、JRS Pharma LP)36g一起装入20L的转鼓混合机并进行混合，然后用制片机进行制片，得到了每1片总质量为100mg的片剂。然后，使用片剂包衣机，用作为包衣液的10％欧巴代YELLOW(オパドライイエロー)(OPADRY 03F42069 YELLOW、日本COLORCON公司)水溶液对片剂进行包衣，得到了每1片总质量为105mg的包衣片。
(2)10mg片
晶体(C)60g和无水轻质硅酸(防凝胶化剂，商品名AEROSIL(注册商标)200、日本AEROSIL公司)192g在20L的超级混合器中混合，然后再添加D-甘露醇(赋形剂，东和化成工业公司)1200g、结晶纤维素(赋形剂，商品名AVICEL PH101、旭化成工业公司)720g、羟基丙基纤维素(粘合剂，商品名HPC-L，日本曹达公司)72g并混合。其后，添加适量的无水乙醇，得到了含有晶体(C)的制粒物。将该制粒物用架式干燥机(60℃)干燥，然后使用动力磨进行整粒，得到了颗粒。将该颗粒与交联羧甲基纤维素钠(崩解剂，商品名Ac-Di-Sol，FMCInternational Inc.)120g、富马酸硬脂基钠(滑润剂，JRS Pharma LP)36g一起在20L的转鼓混合机中混合，然后用制片机制片，得到 了每1片总质量为400mg的片剂。然后，使用片剂包衣机，用作为包衣液的10％欧巴代YELLOW(OPADRY 03F42069 YELLOW、日本COLORCON公司)水溶液对片剂进行包衣，得到了每1片总质量为411mg的包衣片。
(3)100mg片
将晶体(C)31.4g与无水轻质硅酸(防凝胶化剂、商品名AEROSIL(注册商标)200、日本AEROSIL公司)4g在1L的超级混合器中混合，然后，再添加无水磷酸氢钙(赋形剂，协和化学工业公司)40.1g，低取代度羟基丙基纤维素(粘合剂，商品名L-HPC(LH-21)，信越化学工业公司)10g、羟基丙基纤维素(粘合剂，商品名HPC-L，日本曹达公司)3g并混合。其后，添加适量的无水乙醇，得到了含有晶体(C)的制粒物。将该制粒物用架式干燥机(60℃)干燥后，使用动力磨进行整粒，得到了颗粒。将该颗粒与交联羧甲基纤维素钠(崩解剂，商品名Ac-Di-Sol，FMC International Inc.)10g、富马酸硬脂基钠(滑润剂、JRS Pharma LP)1.5g一起混合，然后，用制片机制片，得到了每1片总质量为400mg的片剂。
工业实用性
本发明提供：含有RET激酶抑制物质、且针对选自多发性内分泌肿瘤症IIA型、多发性内分泌肿瘤症IIB型、家族性甲状腺髓样癌、甲状腺乳头癌、散发性甲状腺髓样癌、希尔施普龙病、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生及胃肠道粘膜神经瘤中的至少一种疾病的治疗剂、治疗方法、RET激酶抑制物质在制造所述治疗剂中的用途以及用于所述治疗剂的RET激酶抑制物质。
此外，本发明提供：含有RET激酶抑制物质的、针对甲状腺癌的治疗剂、治疗方法、RET激酶抑制物质在制造所述治疗剂中的用途以及用于所述治疗剂的RET激酶抑制物质。
而且，本发明提供：用于施用于包含突变型RET表达细胞的生物体的、含有RET激酶抑制物质的药物组合物，以施用于包含突变型RET表达细胞的生物体为特征的疾病治疗方法、RET激酶抑制物质在制造所述药物组合物中的用途以及用于所述药物组合物的RET激酶抑制物质。
此外，本发明提供RET激酶抑制剂。
而且，本发明提供：预测RET激酶抑制物质的效果的方法。
更具体地，通过以细胞中有无RET突变为指标，可以预测RET激酶抑制物质的效果。
通过本发明的方法可以对效果进行预测，而无需给患者施用化合物，因此，能够选择该化合物的效果更令人期待的患者，对患者的QOL做出贡献。序列表单独文本(フリーテキスト)
SEQ ID NO：5～20引物。