一种蛹虫草菌种选育方法 【技术领域】
本发明涉及一种蛹虫草菌种选育方法。
背景技术
现有的蛹虫草菌种选育时，获取孢子后，一般通过平板划线和涂布的方法，以将孢子稀释到合适的程度，待菌落形成后，作进一步的挑选。这种选育方法虽然操作简单，但是由于技术本身的限制，难以获得单孢生长形成的菌落，获得的菌落需要进行进一步的分离和挑选。这一方法需要进行大量的重复性劳动，分离效率低，选育耗时长，难以满足生产的需要。
也有部分采用梯度稀释法将孢子到一定程度，然后在培养基中涂布培养以获得单孢生长形成的菌落。这一方法能够获得纯种菌种，但是因为单孢的数量巨大，生长形成的菌落同样也是很多的，仍需要进行大量的筛选工作，挑选部分发到性状优良的菌落进行后续的培养，总的工作量也没有减少多少，效率依然不高。
【发明内容】
为了解决上述问题，本发明提供一种简单高效获取具有优良性状纯种蛹虫草单孢的方法。
本发明采取的技术方案是：
一种蛹虫草菌种选育方法，包括以下步骤：
1)从蛹虫草菌苔表面刮取孢子，加入到装有无菌水的容器中，充分振荡摇匀，稀释至所需倍数，制得蛹虫草孢子悬浮液；
2)配制缺乏营养的基本培养基，高温灭菌后，保温使其处于液态；
3)配制营养丰富的加富培养基，高温灭菌后，保温使其处于液态，备用；
4)在培养皿中倒入基本培养基，在培养基还处于液态时，吸取蛹虫草孢子悬浮液加入培养皿中，摇动培养皿使孢子悬浮液和基本培养基混合均匀；待培养皿中基本培养基凝固后，再倒入一层基本培养基，第二次倒入的培养基凝固后，在培养皿中倒入一层加富培养基。
5)培养皿中的加富培养基凝固后，将培养皿置于20～25℃恒温培养箱中倒置培养。
6)观察培养过程中各菌落的生长情况，选取生成快，扩张快，菌丝浓密的菌落进行后续试验。
本发明的有益效果是：基本培养基上营养有限，性状优良、活力高的蛹虫草孢子能够较快的萌发，利用其中有限的营养进行菌丝生长；性状差、活性低的孢子萌发后，由于缺乏营养，难以继续生长。
性状越优良、活力越高的蛹虫草孢子产生的菌丝生长越快，能够较早的进入下一个基本培养基层，抢先利用其中有限有营养，进而抑制其他蛹虫草孢子产生的菌丝的生长。
性状越优良、活力越高的蛹虫草孢子产生的菌丝生长越快，能够较早的进入加富培养基层，优先利用加富培养基的丰富营养，快速生长形成菌落；性状较次、活力较低的蛹虫草孢子，其菌丝生长到加富培养基所用的时间更长，此时培养基中的营养已大量被其他性状更为优良的蛹虫草菌丝利用，难以形成可观的菌落。
这样培养时，通过培养基的层层筛选，大量性状差、活力低的蛹虫草孢子被淘汰掉，剩下的为性状优良、活力高的蛹虫草纯种，大大减少了筛选的工作量，便于后续实验中挑选性状优良的菌落，有效提高了筛选效率。
【具体实施方式】
下面结合实例，进一步说明本发明。
一种蛹虫草菌种选育方法，包含以下步骤：
1)从蛹虫草菌苔表面刮取孢子，加入到装含有无菌水和蛹虫草孢子分散剂吐温-80的三角瓶中，三角瓶中加入玻璃珠，使用回旋振荡器充分振荡摇匀，然后稀释至所需倍数，制得蛹虫草孢子悬浮液；
2)配制缺乏营养的基本培养基：PDA基本培养基，其配方为：
水：600-800ml 马铃薯：80-100g 葡萄糖：15-18g 琼脂：15-18g高温灭菌后，45高温灭菌后，45℃保温使其处于液态，临用前每1升培养基中加入无菌的12-16ml浓度为2％去氧胆酸钠溶液和1.8-2ml浓度为10000-15000u/ml的链霉素溶液，混合均匀，制得PDA基本选择培养基；
3)配制营养丰富的加富培养基：加富PDA培养基，其配方为：
水：600-800ml 马铃薯：80-100g 葡萄糖：15-18g 琼脂：15-18g 磷酸氢二钾：1.5-1.8g硫酸镁：0.7-0.9g 蛋白胨：2-2.5g
蚕蛹粉：2-2.5g，高温灭菌后，保温使其处于液态，备用；
4)在培养皿中倒入PDA基本选择培养基，当培养基还处于液态时，吸取蛹虫草孢子悬浮液加入培养皿中，摇动培养皿使孢子悬浮液和PDA基本选择培养基混合均匀；待培养皿中PDA基本选择培养基凝固后，再倒入一层PDA基本选择培养基，第二次倒入的培养基凝固后，在培养皿中倒入一层加富PDA培养基；三层培养基的厚度基本相同，均为1～2mm；
5)培养皿中的加富PDA培养基凝固后，将培养皿置于20～25℃恒温培养箱中倒置培养；
6)观察培养过程中各菌落的生长情况，选取生成快，扩张快，菌丝浓密的菌落进行后续试验。
使用分散剂之后，孢子分散更均匀，且不易沉降，保证了孢子悬浮液地均匀性，有利于实验的进行；加入玻璃珠，更容易将刮取的孢子打散，使用回旋振荡器振荡，振荡均匀迅速，有效提高实验效率。除了吐温-80，也可以使用其他对孢子无毒害作用的分散剂，如维生素E、吐温-60等。
培养基优选的保温温度为45～60℃，既便于操作，也不会因为过热对孢子造成不良影响。
PDA基本培养基也可以使用其他培养基代替，只要能保证蛹虫草孢子萌发后有基本的生长营养即可，本领域的技术人员可以很容易根据实际情况选择不同的配方。
加富PDA培养基也可以使用其他培养基代替，只要营养丰富、适宜蛹虫草菌丝生长即可，本领域的技术人员可以很容易根据实际情况选择不同的配方。
除了去氧胆酸钠、链霉素，微生物抑制剂也可以是一般的活性抗生素，如四环素、氯霉素、青霉素，但不能使用对蛹虫草孢子抑制作用太强化学杀菌剂，如人工合成的酰基化抗生素。
基本培养基上营养有限，性状优良、活力高的蛹虫草孢子能够较快的萌发，利用其中有限的营养进行菌丝生长；性状差、活性低的孢子萌发后，由于缺乏营养，难以继续生长；培养基中加入了微生物抑制剂，能够抑制培养基中细菌的霉菌的生长，避免杂菌感染，影响试验结果；同时微生物抑制剂对蛹虫草孢子的萌发也有一定的抑制作用，这样活力低、性状差的孢子就难以萌发。
性状越优良、活力越高的蛹虫草孢子产生的菌丝生长越快，能够较早的进入下一个基本培养基层，抢先利用其中有限有营养，进而抑制其他蛹虫草孢子产生的菌丝的生长。
性状越优良、活力越高的蛹虫草孢子产生的菌丝生长越快，能够较早的进入加富培养基层，优先利用加富培养基的丰富营养，快速生长形成菌落；性状较次、活力较低的蛹虫草孢子，其菌丝生长到加富培养基所用的时间更长，此时培养基中的营养已大量被其他性状更为优良的蛹虫草菌丝利用，难以形成可观的菌落。
这样培养时，通过培养基的层层筛选，大量性状差、活力低的蛹虫草孢子被淘汰掉，剩下的为性状优良、活力高的蛹虫草纯种，大大减少了筛选的工作量，便于后续实验中挑选性状优良的菌落，有效提高了筛选效率。