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1、(10)申请公布号 CN 104306729 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104306729 A (21)申请号 201410638794.4 (22)申请日 2014.11.13 A61K 36/898(2006.01) A61K 9/20(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61J 3/10(2006.01) (71)申请人 山东中大药业有限公司 地址 250062 山东省济南市历下区经十路 16369 号 (72)发明人 权栋栋 朱立平 陈云 李加美 王丽丽 (54) 发明名称 一种九味獐牙菜片的制备方。
2、法及其在制备抑 制肺癌细胞 LLC 细胞增殖药物中的应用 (57) 摘要 本发明属于中药技术领域， 具体涉及一种九 味獐牙菜片的制备方法及应用。本发明的九味 獐牙菜片的制备方法， 由獐牙菜 53.6g、 金腰草 17.9g、 榜嘎 35.7g、 木香 35.7g、 兔耳草 35.7g、 苦 荬菜 42.9g、 角茴香 35.7g、 小檗皮 28.6g、 波棱瓜 子 14.2g 作为原料药制成， 采用超临界萃取、 微波 萃取和大孔树脂吸附制备而成， 使得盐酸小檗碱 含量有很大提高。本发明还提供了九味獐牙菜片 在制备抑制小鼠肺癌细胞 LLC 细胞增殖药物中的 应用。 (51)Int.Cl. 权利要。
3、求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 104306729 A CN 104306729 A 1/1 页 2 1. 一种九味獐牙菜片的制备方法， 由獐牙菜 53.6g、 金腰草 17.9g、 榜嘎 35.7g、 木香 35.7g、 兔耳草 35.7g、 苦荬菜 42.9g、 角茴香 35.7g、 小檗皮 28.6g、 波棱瓜子 14.2g 作为原料 药制成， 其特征在于， 所述的制备方法由下列步骤组成 ： 取木香、 角茴香， 粉碎成细粉， 加入 到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 。
4、夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 4-6%， 萃取 压力 20-30MPa， 温度 30-50， CO2流量 l-3ml/g 生药 min， 萃取时间 130-170min， 得超临界 萃取物， 备用 ； 萃取后的木香、 角茴香残渣与其他七味药材， 粉碎， 加入 2L 的 60% 乙醇， 投入 微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率600-800W， 萃取2次， 每次5-10分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上， 60%乙醇洗脱， 收集5倍量柱体积洗脱液， 减压 回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 将超临界萃取物、 微波提取物混合加入淀粉， 60% 。
5、乙 醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 200 片， 每片重 0.3g。 2.根据权利要求l所述的九味獐牙菜片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取 中夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 5%。 3.根据权利要求l所述的九味獐牙菜片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取 中萃取压力为 25MPa。 4.根据权利要求l所述的九味獐牙菜片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取 中萃取温度为 60。 5.根据权利要求l所述的九味獐牙菜片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取 中 CO2流量 2ml/g 生药min。 6.据权利要求l所述的九味獐牙菜片的制备方法， 。
6、其特征在于， 所述CO2超临界萃取中 萃取时间为 150min。 7. 根据权利要求 l 所述的九味獐牙菜片的制备方法， 其特征在于， 所述微波萃取功率 为 700W。 8. 根据权利要求 l 所述的九味獐牙菜片的制备方法， 其特征在于， 所述微波萃取每次 萃取时间为 8 分钟。 9. 权利要求 l 所述的九味獐牙菜片在制备抑制小鼠肺癌细胞 LLC 细胞增殖药物中的 应用。 权 利 要 求 书 CN 104306729 A 2 1/5 页 3 一种九味獐牙菜片的制备方法及其在制备抑制肺癌细胞 LLC 细胞增殖药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于中药技术领域， 具体涉及一种九味獐牙菜片的。
7、制备方法及其在制备抑 制小鼠肺癌细胞 LLC 细胞增殖药物中的应用。 背景技术 0002 九味獐牙菜胶囊标准号 WS-11182（ZD-1182） -2002， 记载于国家中成药标准汇编 内科肝胆分册。 由獐牙菜53.6g、 金腰草17.9g、 榜嘎35.7g、 木香35.7g、 兔耳草35.7g、 苦荬 菜42.9g、 角茴香35.7g、 小檗皮28.6g、 波棱瓜子14.2g作为原料药制成， 具有清热， 消炎， 止 痛的功效。用于胆囊炎， 急性黄疸型肝炎。 0003 现有技术中， 尚未有九味獐牙菜胶囊在提取制备方面采用 CO2超临界萃取、 微波技 术和大孔树脂吸附技术提取的报道， 而中药直。
8、接打粉取的方法， 工艺粗糙、 落后， 杂质多， 导 致患者用量过大， 不方便服用， 严重影响了本品在临床上应用。 发明内容 0004 为了解决上述的技术问题， 本发明提供了一种九味獐牙菜片的制备方法。 0005 本发明的另一个目的在于提供一种九味獐牙菜片在制备抑制小鼠肺癌细胞 LLC 细胞增殖药物中的应用。 0006 本发明的目的是通过如下的方案实现的 ： 一种九味獐牙菜片的制备方法， 由獐牙菜 53.6g、 金腰草 17.9g、 榜嘎 35.7g、 木香 35.7g、 兔耳草 35.7g、 苦荬菜 42.9g、 角茴香 35.7g、 小檗皮 28.6g、 波棱瓜子 14.2g 作为原 料药制。
9、成， 所述的制备方法由下列步骤组成 ： 取木香、 角茴香， 粉碎成细粉， 加入到 CO2 超 临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 4-6%， 萃取压力 20-30MPa， 温度 30-50， CO2流量 l-3ml/g 生药 min， 萃取时间 130-170min， 得超临界萃取 物， 备用 ； 萃取后的木香、 角茴香残渣与其他七味药材， 粉碎， 加入 2L 的 60% 乙醇， 投入微波 萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率 600-800W， 萃取 2 次， 每次 5-10 分钟， 合并萃取液， 浓 缩， 加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上， 60%。
10、乙醇洗脱， 收集5倍量柱体积洗脱液， 减压回 收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 将超临界萃取物、 微波提取物混合加入淀粉， 60% 乙醇 制颗粒， 干燥， 压片， 制成 200 片， 每片重 0.3g。 0007 上述的九味獐牙菜片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中夹带剂占总萃取溶剂 的体积百分比为 5%。 0008 上述的九味獐牙菜片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中萃取压力为 25 MPa。 0009 上述的九味獐牙菜片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中萃取温度为 60。 0010 上述的九味獐牙菜片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中 CO2流量 2ml/g 。
11、生 药min。 0011 上述的九味獐牙菜片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中萃取时间为 150min。 说 明 书 CN 104306729 A 3 2/5 页 4 0012 上述的九味獐牙菜片的制备方法中， 所述微波萃取功率为 700W。 0013 上述的九味獐牙菜片的制备方法中， 所述微波萃取每次萃取时间为 8 分钟。 0014 上述的九味獐牙菜片在制备抑制小鼠肺癌细胞 LLC 细胞增殖药物中的应用。 0015 现有技术中， 九味獐牙菜胶囊口服， 一次 4-5 粒， 一日 2-3 次。九味獐牙菜胶囊服 药量大。采用本发明方法制备成的九味獐牙菜片每片重 0.3g， 每次仅需 2 片，。
12、 一日服用 2-3 次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。 0016 试验一、 不同方法制备的九味獐牙菜片中盐酸小檗碱含量的比较 l、 仪器及试药本发明九味獐牙菜片 ： 按实施例 1 方法制备， 使用 300g 原料药， 经提取 制成 200 片， 每片重 0.3g。原九味獐牙菜胶囊， 按照 WS-11182（ZD-1182） -2002 标准方法 制备， 作为对照。Agilent1200 高效液相色谱仪 ； AE240 电子分析天平 ； 盐酸小檗碱对照品 （中国药品生物制品检定所） 。 0017 2、 方法 照高效液相色谱法 （中国药典 2010 年版一。
13、部附录 D） 测定。 0018 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ； 乙 腈 -0.05mol/L 磷酸二氢钠溶液 （用磷酸调节 pH 值至 3） （22:78）为流动相 ； 检测波长为 347nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于 5000。 0019 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品适量， 加甲醇制成每 1ml 含盐酸 小檗碱 28g 的溶液， 即得。 0020 本发明产品供试品溶液的制备 取本发明的九味獐牙菜片， 研细， 取 0.1g， 精密称 定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入甲醇 50ml， 称定重量， 超声处理 50 分钟， 放冷， 再称定重量， 。
14、用甲醇补足减失的重量， 摇匀， 取上清液， 用微孔滤膜 （0.45m） 滤过， 取续滤液， 即得。 0021 对照品供试品溶液的制备 取本对照的九味獐牙菜胶囊， 研细， 取 0.5g， 精密称 定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入甲醇 50ml， 称定重量， 超声处理 50 分钟， 放冷， 再称定重量， 用甲醇补足减失的重量， 摇匀， 取上清液， 用微孔滤膜 （0.45m） 滤过， 取续滤液， 即得。 0022 测定法 分别精密吸取对照品溶液、 本发明产品供试品溶液与对照品供试品溶液 各 5l， 注入液相色谱仪， 测定， 即得。 0023 3、 结果 结果表明， 本发明九味獐牙菜片中盐酸小檗碱的含。
15、量为 3.6-7mg/ 片 ； 而原九味獐牙菜 胶囊中盐酸小檗碱的含量为 0.71mg/ 粒， 每片盐酸小檗碱含量相当于原胶囊剂含量的 5-10 倍， 在服用量减少的情况下， 盐酸小檗碱含量有很大提高。 0024 上述研究表明， 采用本发明制备方法制备的九味獐牙菜片， 有效成分含量远远高 于 WS-11182（ZD-1182） -2002 标准记载的方法制备的九味獐牙菜胶囊。 具体实施方式 0025 下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明， 以便本领域的技术人员更了解 本发明， 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例， 凡基于本发明上述 内容所实现的技术均属于本发明的范围。 。
16、0026 实施例 1 取獐牙菜 53.6g、 金腰草 17.9g、 榜嘎 35.7g、 木香 35.7g、 兔耳草 35.7g、 苦荬菜 42.9g、 说 明 书 CN 104306729 A 4 3/5 页 5 角茴香35.7g、 小檗皮28.6g、 波棱瓜子14.2g ： 取木香、 角茴香， 粉碎成细粉， 加入到CO2超临 界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 5%， 萃取压力 25MPa， 温度 40， CO2流量 2ml/g 生药 min， 萃取时间 150min， 得超临界萃取物， 备用 ； 萃取后的木 香、 角茴香残渣与其他七味药材， 粉碎， 加入 2L。
17、 的 60% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波 萃取， 萃取功率 700W， 萃取 2 次， 每次 8 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 Diaion HP-10 大孔吸 附树脂柱上， 60% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波 提取物， 将超临界萃取物、 微波提取物混合加入淀粉， 60% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 200 片， 每片重 0.3g。 0027 经检测， 成品中盐酸小檗碱的含量为 7.05mg/ 片。 0028 实施例 2 取獐牙菜 53.6g、 金腰草 17.9g、 榜嘎 35.7g、 木香 35.7g、 兔耳草 35.。
18、7g、 苦荬菜 42.9g、 角茴香35.7g、 小檗皮28.6g、 波棱瓜子14.2g ： 取木香、 角茴香， 粉碎成细粉， 加入到CO2超临 界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 4%， 萃取压力 30MPa， 温度 50， CO2流量 3ml/g 生药 min， 萃取时间 130min， 得超临界萃取物， 备用 ； 萃取后的木 香、 角茴香残渣与其他七味药材， 粉碎， 加入 2L 的 60% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波 萃取， 萃取功率 600W， 萃取 2 次， 每次 8 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 Diaion HP-10 大孔吸 附树脂柱。
19、上， 60% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波 提取物， 将超临界萃取物、 微波提取物混合加入淀粉， 60% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 200 片， 每片重 0.3g。 0029 经检测， 成品中盐酸小檗碱的含量为 3.60mg/ 片。 0030 实施例 3 取獐牙菜 53.6g、 金腰草 17.9g、 榜嘎 35.7g、 木香 35.7g、 兔耳草 35.7g、 苦荬菜 42.9g、 角茴香35.7g、 小檗皮28.6g、 波棱瓜子14.2g ： 取木香、 角茴香， 粉碎成细粉， 加入到CO2超临 界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂。
20、占总萃取溶剂的体积百分比为 6%， 萃取压力 20MPa， 温度 30， CO2流量 1ml/g 生药min， 萃取时间 170min， 得超临界萃取物， 备用 ； 萃取后的 木香、 角茴香残渣与其他七味药材， 粉碎， 加入 2L 的 60% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微 波萃取， 萃取功率 800W， 萃取 2 次， 每次 10 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 Diaion HP-10 大 孔吸附树脂柱上， 60% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得 微波提取物， 将超临界萃取物、 微波提取物混合加入淀粉， 60% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片，。
21、 制成 200 片， 每片重 0.3g。 0031 经检测， 成品中盐酸小檗碱的含量为 4.88mg/ 片。 0032 实施例 4 ： 九味獐牙菜片抑制小鼠肺癌细胞 LLC 细胞增殖的实验研究资料 1实验材料 1.1 实验用细胞株 小鼠肺癌细胞 LLC 细胞， 山东大学实验室细胞库， DMEM+10%FBS 常规培养。 0033 1.2 实验药物 研究药物 ： 本发明九味獐牙菜片 ： 按实施例 1 方法制备。 0034 药液储液 ： 称取 100mg 九味獐牙菜片， 溶于 5ml 无水乙醇中， 0.2m 滤器过滤， 500ldoff 管分装， -20存储， 同时 0.2m 滤器过滤无水乙醇以备。
22、对照组之用。 说 明 书 CN 104306729 A 5 4/5 页 6 0035 1.3 实验试剂 DMEM( GIBCO公司Cat.No.12100-061 Lot.No.758137) ； 胎牛血清 （浙江天杭生物科技 有限公司 Lot.No.100419） ； NaHC03( 上海久亿化学试剂有限公司 Cat.No.11810-033 Lot. No. 1088387) ； Trypsin （AMRESCO 公司） ； EDTA （AMRESCO 公司） ； Penicillin G Sodium Salt （AMRESCO 公司 1） ； Streptomycin Sulfate(。
23、AMRESCO) ； 无水乙醇 （淄博亚杜兰经贸有限公 司） ； MTT (Biosharp 批号 ： 0793) ： PBS（实验室自配） ； 1.4 实验器材 莱卡倒置显微镜 （德国 Leica 型号 ： DMIL） ； 可见 - 紫外光微孔板检测仪 （美国 MD 公司型 号 ： SPECTRAMAX 190） ； C02培养箱 （FORMA型号 ： 3111） ； 超净台 （苏净集团安泰公司制造型号 ： SW-CJ-ZFD） ； 纯水仪 （美国 Sprlng 公司型号 ： S/N 020579） ； 精密移液器 （法国吉尔森公司型 号 ： P2） ； 电子天平 （德国赛多利斯有限公司型号。
24、 ： BT323S） ； 全自动高压灭菌锅 （日本 SANYO 公司型号 ： MLS-3020） ； 台式电热鼓风干燥箱 ( 上海精密实验设备公司型号 ： DHG9123A) ； 冰 箱 ( 西门子公司型号 ： KG18V21TI) ； 液氮罐 （CBS 型号 ： 2001） ； 低速离心机 （上海安亭科学仪 器厂型号 ： KA-1000） ； 0.2m 滤器 （MILLIPORE 型号 ： SLGP033RB） ； 1cm 培养皿 (NEST 公司 )、 96 孔培养板 （NEST 公司） ； 细胞计数板 ； 离心管、 移液管、 Tips 若干。 0036 2实验方法 1)LLC 细胞用 D。
25、MEM+10%FBS 于 37、 5%C02进行常规培养 （10cm 培养皿） ， 当细胞生长 至对数期时， 收集细胞， 弃去培养液， PBS 轻洗 3 遍， 加入 3ml 0.25% 胰蛋白酶 -0.04%EDTA， 37消化 2min 后， 向其中加入 5ml 完全培养基中和反应， 吹打细胞后将其转入离心管中， 1000rpm 离心 5min， 调整细胞悬液浓度 3104个 /ml。 0037 2) 将细胞种入 96 孔培养板中， 每孔加入细胞悬液 180l， 培养板放入细胞培养箱 中 (37， 5%C02) 常规培养。 0038 3) 根据细胞生长情况， 一般长至 50%-70%， 加入。
26、九味獐牙菜片溶液， 继续培养 24h。 0039 4)24h 后加入 20l MTT 溶液 （5mg/ml， 即 0.5%MTT） ， 继续培养 4h。 0040 5)4h 后扣板法倒去上清， 用吸水纸轻轻拍干， 每孔如入 200l 二甲基亚砜， 置摇床 上低速振荡 10min， 使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 490nm 处测量各孔的吸光值。 0041 6) 同时设置本底 （不加细胞， 只加培养液） ， 对照孔 （细胞、 相同浓度的药物溶解介 质、 培养液、 MTT、 二甲基亚砜） ， 每组设定 6 个复孔。 0042 7) 结果以药物对细胞的抑制率表示 ： 细胞增值抑制率 (%)=（对。
27、照孔 OD 值 - 给药 孔 OD 值） 、 对照孔 OD 值 100%。实验重复 3 次。 0043 3统计处理 采用 Microsoft Excel 2007 软件中的相关分析和 Student t 检验， 数据以 meanSD 表示。 0044 4实验结果 MTT法实验后统计结果显示， 与对照组比较， 当剂量达到5mg/ml时， 对LLC 细胞增殖抑 制有差异 (P0.05)， 剂量在 10mg/ml 时该差异具有显著性 (P0.01)， 当剂量达到 15-20mg/ ml 时有极显著性差异 (P0.001)。 0045 表 1 九味獐牙菜片对 LLC 细胞增殖抑制影响研究 (XSD) 组别药物浓度 （mg/ml）抑制率 （%） 说 明 书 CN 104306729 A 6 5/5 页 7 对照组 00 1510.695.26 21019.659.54* 31530.6213.27* 42041.2917.25* 注 ： 与对照组比较， *PO.01 ； *P0.001。 0046 5实验结论 九味獐牙菜片可以抑制 LLC 细胞增殖， 减少 LLC 细胞的细胞生长数目， 该作用呈剂量 依赖性。 说 明 书 CN 104306729 A 7 。