鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RTPCR检测试剂盒.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201410606300.4

申请日:

2014.10.30

公开号:

CN104313186A

公开日:

2015.01.28

当前法律状态:

驳回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12Q 1/70申请公布日:20150128|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/70申请日:20141030|||公开

IPC分类号:

C12Q1/70; C12Q1/68; C12N15/11; C12R1/93(2006.01)N

主分类号:

C12Q1/70

申请人:

广西壮族自治区兽医研究所

发明人:

谢芝勋; 曾婷婷; 谢丽基; 邓显文; 谢志勤; 罗思思; 刘加波; 黄莉; 黄娇玲

地址:

530001 广西壮族自治区南宁市西乡塘区友爱北路51号

优先权:

专利代理机构:

广西南宁公平专利事务所有限责任公司 45104

代理人:

杨立华

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内容摘要

本发明公开了一种鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒,包括引物组和探针组;引物组有引物1至4,它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列;探针组有探针A和探针B,它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。实验证明,本发明具有检测时间短、检测敏感性高且特异性强的优点,可实现同时检测和鉴别鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒两种病原体,并对其相应病原含量进行定量,因而可用于鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒疫苗和药物疗效的评估,以及其致病机理等方面的研究,因此本发明对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的防治有重要意义。

权利要求书

权利要求书
1.  鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测引物组,其特征在于包括两对特异性引物,分别是引物1和2、引物3和4,它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列。

2.  一种鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒,其特征在于包括引物组和探针组;引物组有引物1至4,它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列;探针组有探针A和探针B,它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。

3.  根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒,其特征在于:所述探针A的5’端标记有报告荧光染料ROX,3’端标记有淬灭荧光染料BHQ2;所述探针B的5’端标记有报告荧光染料FAM,3’端标记有淬灭荧光染料BHQ1。

4.  根据权利要求2所述的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒,其特征在于:所述引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为1:1:1:1:1:1。

5.  根据权利要求3所述的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒,其特征在于该试剂盒含有以下试剂:
A液:PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B;
B液:DTMUV+NDV模板,作为阳性对照;
C液:ddH2O,作为阴性对照。

6.  根据权利要求5所述的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒,其特征在于:所述A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0.2μmol/L,引物3、引物4、探针B终浓度均为0.2μmol/L。

说明书

说明书鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒
技术领域
本发明属于RT-PCR检测试剂盒技术领域,尤其涉及一种鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
背景技术
鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)是危害病原。该病主要侵害产蛋鸭和雏鸭,引起产蛋鸭产蛋急剧下降和少量死亡,导致产蛋鸭高淘汰率,自2010年爆发以来严重危害养鸭业。鸭源新城疫病毒(Newcaslte Disease Virus,NDV),同样引起产蛋鸭的产蛋下降。鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒感染产蛋鸭后,引起相似的症状即产蛋下降,因此迫切需要建立一种快速敏感的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒检测方法,以便在感染早期就能检测出这些病毒,从而为这些病的控制争取宝贵的时间。目前,这两种病毒的传统检测方法有病毒分离、琼脂扩散试验等,但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点,在实际应用中具有一定的局限性。
荧光定量PCR技术实现了对模板的定量,而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点。在实际应用中,当样品量非常大时,单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势,迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板,克服了单重荧光PCR的不足。但是,建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多,其对试剂和引物的要求更高,同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰,使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道。目前,还未见有应用多重荧光定量PCR技术对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒进行检测和诊断的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒,以实现同时检测并定量鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒两种病原体。
为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测引物组,包括两对特异性引物,分别是引物1和2、引物3和4,它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列。
鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒,包括引物组和探 针组;引物组有引物1至4,它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列;探针组有探针A和探针B,它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。
探针A的5’端标记有报告荧光染料ROX,3’端标记有淬灭荧光染料BHQ2;探针B的5’端标记有报告荧光染料FAM,3’端标记有淬灭荧光染料BHQ1。
引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为1:1:1:1:1:1。
该试剂盒含有以下试剂:
A液:PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B;
B液:DTMUV+NDV模板,作为阳性对照;
C液:ddH2O,作为阴性对照。
A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0.2μmol/L,引物3、引物4、探针B终浓度均为0.2μmol/L。
针对目前缺乏对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒同时进行检测和诊断的有效可靠的技术,发明人研究筛选了两套特异性的探针和引物,并通过进行不同浓度的配比,获得最佳引物和探针的浓度组合,据此建立了鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的二重荧光定量RT-PCR的检测方法,并制备了相应的检测试剂盒。实验证明,本发明具有如下优点:
1)检测时间短
应用本发明可实现一管二检的目的,并且反转录和PCR一步完成,仅需约30分钟,并且反应结果可以直接通过电脑观察,而常规的RT-PCR方法起码需要3.5小时来完成扩增反应,然后还得花1小时进行凝胶电泳来观察结果;
2)检测敏感性高且特异性强
当鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒同时存在时,本发明对其检测的CT值与单个病毒检测的CT值比较,结果基本一样,并未影响对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的检出及检出的敏感性。另外,利用本发明还可对样品中相应病原含量进行定量,并且检测敏感性非常高,均能检测到100个拷贝的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒,比常规PCR方法敏感性高10倍,因而可用于鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒疫苗和药物疗效的评估,以及其致病机理等方面的研究,因此本发明对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的防治有重要意义。
附图说明
图1是荧光定量RT-PCR检测鸭坦布苏病毒的敏感性(ROX通道)结果图,图中:1~9分别为1×1010~1×102拷贝/μl,10空白对照(为DEPC水)。
图2是荧光定量RT-PCR检测鸭坦布苏病毒的敏感性(ROX通道)的标准曲线。
图3是荧光定量RT-PCR检测鸭源新城疫病毒的敏感性(FAM通道)结果图,图中:1~9分别为1×1010~1×102拷贝/μl,10空白对照(为DEPC水)。
图4是荧光定量RT-PCR检测鸭源新城疫病毒的敏感性(FAM通道)的标准曲线。
图5是荧光定量RT-PCR检测鸭坦布苏病毒的特异性(ROX通道)结果图,图中:1鸭坦布苏病毒,2鸭坦布苏病毒+鸭源新城疫病毒,3番鸭细小病毒,4鸭圆环病毒,5减蛋综合症病毒,6鸭瘟病毒,7H9亚型禽流感,8ddH2O。
图6是荧光定量RT-PCR检测鸭源新城疫病毒的特异性(FAM通道)结果图,图中:其中1鸭源新城疫病毒,2鸭坦布苏病毒+鸭源新城疫病毒,3番鸭细小病毒,4鸭圆环病毒,5减蛋综合症病毒,6鸭瘟病毒,7H9亚型禽流感,8ddH2O。
图7是荧光定量RT-PCR检测鸭坦布苏病毒的批内重复性(ROX通道)结果图,图中:1-4分别同一批次内四个重复样品,5-7为阴性对照。
图8是荧光定量RT-PCR检测鸭源新城疫病毒的批内重复性(FAM通道)结果图,图中:1-4分别为同一批次内四个重复样品,5和6空白对照。
具体实施方式
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法;所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下:
Lightcycler2.0荧光定量PCR仪(Roche);DNA片断回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自BioDev公司;pGEM-T Easy试剂盒购自Promega公司;T7体外转录试剂盒购自Fermengtas公司;One Step PrimeScript RT-PCR Kit购自大连宝生物公司;TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。
鸭坦布苏病毒记载在“4株广西鸭源坦布苏病毒分离及初步鉴定”,中国动物检疫,2013,30(6):31-35,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得;
减蛋综合症病毒记载在“减蛋综合症植物油乳剂苗的研究”,中国预防兽医学报,2000,(04):23-27,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得;
鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”,中国畜牧兽医,2010,37(11):156-158,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得;
小鹅瘟病毒记载在“小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立”,上海畜牧兽医通讯,2008,160(06):30-31,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得;
新城疫病毒记载在“新城疫植物油乳剂苗的研究”,中国预防兽医学 报,2000,(04):23-27,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得;
鸭瘟病毒AV1221株购自中国兽医药品监察所;
H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”,中国人兽共患病学报,2006,(09):858-860,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
实施例1、引物与Taqman探针的设计与合成
根据GenBank中鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的保守序列,采用Primer Express 3.0软件,设计了多套探针和引物,通过分析其引物之间的二聚体,选定两对特异性引物和两条Taqmam探针(表1)。
表1 为引物和TaqMan探针序列(5’-3’)

实施例2、荧光定量RT-PCR检测的建立
一、荧光定量RT-PCR检测方法的确定
1、样本的制备
1)、核酸的提取
参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书,提取鸭坦布苏病毒、新城疫病毒和H9亚型禽流感的RNA,提取减蛋综合症病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒和鸭瘟病毒的DNA。
2)、RNA的反转录
鸭坦布苏病毒、鸭源新城疫病毒和H9亚型禽流感反转录合成cDNA,具体如下:建立如下反转录体系,总反应体积为50μL)的鸭坦布苏病毒、新城疫病毒和H9亚型禽流感RNA为36.5μL(约20μg),10μL 5×PCR缓冲液(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:2680A),2μL 10mM dNTP(四种碱基)(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:4019), 1μL RNA抑制剂(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:2313A),1μL随机引物(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:3802),1μL反转录酶(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:2680A),用无Rnase水加至总体积为20μL,离心均匀,于25℃10min,42℃60min,95℃5min,4℃结束,得到鸭坦布苏病毒、鸭源新城疫病毒和H9亚型禽流感cDNA。
2、标准品的制备
分别以上述得到的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的cDNA为模板进行PCR扩增,反应体系为50μL(含0.2mmol/L dNTP、2.5mmol/L MgCl2、0.5μmol/L引物(表1)、1.25U Taq聚合酶、1×PCR buffer、5μL DNA模板),反应条件为:95℃预变性5min,94℃60s,50℃60s,70℃60s,35个循环,72℃延伸10min。
PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,回收目的片断后克隆至pGEM-T Easy载体,阳性克隆菌(pGEM-NDV和pGEM-TMUV)送大连宝生生物技术有限公司进行测序,pGEM-TMUV菌中含有的PCR产物大小为68bp,具有序列表中SEQ.ID.No.7的第1-68位核苷酸(为TMUV GX2013H株的NS5序列,genbank号为KJ700462,第9995-10062位核苷酸),说明为阳性克隆,含有TMUV病毒;pGEM-NDV菌中含有的PCR产物大小为66bp,具有序列表中SEQ.ID.No.8的第1-66位核苷酸(为duck-China-Guangxi19-2009株的NP基因,genbank号为:JX193080.1,第1671-1736位核苷酸),说明为阳性克隆,含有NDV病毒。
分别提取pGEM-NDV菌和pGEM-TMUV菌中的质粒,得到pGEM-NDV质粒和pGEM-TMUV质粒。
将pGEM-NDV和pGEM-TMUV质粒作为阳性标准品,按照文献(Vaitomaa,J.,Rantala A.,Halinen K.,Rouhiainen L.,Tallberg P.,Mokelke L.&Sivonen K.(2003)Quantitative Real-Time PCR for Determination of Microcystin Synthetase E Copy Numbers for Microcystis and Anabaena in Lakes.Applied and Environmental Microbiology.69:7289-7297.)计算拷贝数,结果为拷贝数为1.8×1010和2.1×1010拷贝/μl。
将pGEM-NDV和pGEM-TMUV质粒,37℃SpeⅠ单酶切过夜,使质粒线性化,琼脂糖凝胶电泳及试剂盒回收纯化质粒DNA线性化产物,用于体外转录,按T7体外转录试剂盒说明加入反应试剂37℃作用2h,然后加DNaseⅠ酶1μl,37℃消化转录产物中未转录的DNA20min,70℃灭活DNaseⅠ酶15min,用等体积盐酸饱和苯酚、氯仿抽提,再用等体积氯仿抽提,取上清用0.5倍体积5M醋酸氨和2倍体积冰乙醇沉淀,再用75%冰乙醇洗沉淀,最 后用DEPC水溶解,得到NDV-RNA和TMUV-RNA,紫外分光光度计测NDV-RNA和TMUV-RNA浓度和纯度,-70℃保存备用,结果为NDV-RNA和TMUV-RNA浓度分别为1.2×1010和1.3×1010拷贝/μl。
3、荧光定量RT-PCR的反应体系中引物和探针浓度的确立
用NDV-RNA和TMUV-RNA(二者的拷贝比为1:1)作为模板,将表1中的引物和探针在终浓度为0.2-0.8μmol/L之间,进行不同浓度的配比进行荧光定量RT-PCR,选择引物和探针的最佳浓度。
扩增反应总体积为20μl,其中2×One Step RT-PCR Buffer III(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:DRR064A)10μl;Takara Ex Taq HS(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:DRR064A)0.4μl;PrimeScript RT Enzyme Mix II(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:DRR064A)0.4μl;2μl模板,终浓度均为0.2-0.8μmol/L的TMUV-F、TMUV-R和TMUV-probe;终浓度均为0.2-0.8μmol/L的NDV-F、NDV-R和NDV-probe;余下用灭菌DEPC水补足,均匀混合,置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20℃/s,在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为:42℃5min;95℃10s;然后按95℃变性10s、60℃退火延伸20s进行40个循环;最后于40℃结束反应。
结果显示,不同的引物和探针终浓度对试验结果影响比较大,鸭坦布苏病毒上、下游引物及探针终浓度分别为0.2μmol/L,鸭源新城疫病毒上、下游引物及探针终浓度分别为0.2μmol/L,对标准品的检测可获得较小的Ct值。
因此,优化的荧光定量RT-PCR的反应体系如下:扩增反应总体积为20μl,其中2×One Step RT-PCR Buffer III(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:DRR064A)10μl;Takara Ex Taq HS(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:DRR064A)0.4μl;PrimeScript RT Enzyme Mix II(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:DRR064A)0.4μl;2μl模板,终浓度均为0.2μM的TMUV-F、TMUV-R和TMUV-probe;终浓度均为0.2μM的NDV-F、NDV-R和NDV-probe;余下用灭菌DEPC水补足,均匀混合,置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20℃/s,在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为:42℃5min;95℃10s;然后按95℃变性10s、60℃退火延伸20s进行50个循环;最后于40℃结束反应。
FAM在530nm激发光下发荧光,用来检测鸭源新城疫病毒;ROX在610nm激发光下发荧光,用来检测鸭坦布苏病毒;
二、荧光定量RT-PCR的敏感性试验
分别以10倍系列稀释的NDV-RNA(鸭源新城疫病毒)和TMUV-RNA(鸭坦布苏病毒),得到拷贝数均为1×109-1×102拷贝/μl的NDV-RNA和TMUV-RNA,再将各种拷贝数的NDV-RNA和TMUV-RNA混合作为模板进行二重荧光定量PCR扩增,扩增体系和条件如一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序。
在610nm激发光下的结果(ROX)如图1和2所示;在530nm激发光下的结果(FAM)如图3和4所示。从荧光曲线可见,对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的检测100拷贝仍有荧光曲线,表明该检测方法对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的灵敏度均为100拷贝,比常规PCR方法敏感性高10倍,重复检测的结果一致。从标准曲线可见扩增成线性,说明所建立的方法具有很好的扩增效率。
三、荧光定量RT-PCR的特异性试验及干扰性试验
1、荧光定量RT-PCR的特异性试验
按照上述一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR,不同的是模板分别为鸭坦布苏病毒RNA、鸭坦布苏病毒RNA+鸭源新城疫病毒RNA、番鸭细小病毒RNA、鸭圆环病毒DNA、减蛋综合症病毒DNA、鸭瘟病毒DNA、H9亚型禽流感RNA,以ddH2O作为阴性对照。
在610nm激发光下检测鸭坦布苏病毒的特异性,结果(ROX)如图5所示,可见,样品1和2有PCR产物,得到相应病毒的特异性荧光曲线,而样品3-8均没有特异性荧光曲线,证实所设计的引物探针具有特异性,该方法特异性强,与其它检测对象无交叉反应。
在530nm激发光下检测鸭源新城疫病毒的特异性,结果(FAM)如图6所示,可见,样品1和2有PCR产物,得到相应病毒的特异性荧光曲线,而样品3-8均没有特异性荧光曲线,证实所设计的引物探针具有特异性,该方法特异性强,与其它检测对象无交叉反应。
应用建立的二重荧光定量PCR,进行检测以确定两种模板存在时是否对检测的Ct值产生影响,图5中鸭坦布苏病毒、鸭坦布苏病毒RNA+鸭源新城疫病毒RNA混合样本(2)检测的CT值分别为13.21和13.59;图6中,鸭源新城疫病毒RNA、鸭坦布苏病毒RNA+鸭源新城疫病毒RNA混合样本检测的CT值分别为13.81和13.95。结果说明,样品中存在两种病毒与存在单种病毒,检测的CT值变异非常小,并未影响对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的检出及检出的敏感性。因此,本发明的引物、探针和及其建立的二重荧光定量RT-PCR检测方法可应用于鉴定未知样本是否感染鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒,二重荧光PCR反应结果的判断如下:
反应结果为一条直线,则为阴性;反应结果为S型曲线,则为阳性;
若在610nm激发光下(ROX)的反应结果为S型曲线,则待测样本中含有鸭坦布苏病毒;反之,则样品中不含有鸭坦布苏病毒;若在530nm激发光下(FAM)的反应结果为S型曲线,则待测样本中含有鸭源新城疫病毒;反之,则样品中不含有鸭源新城疫病毒;
若在610nm激发光下(ROX)和530nm激发光下(FAM)的反应结果均为S型曲线,则样品中含有鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒;若在610nm激发光下(ROX)和530nm激发光下(FAM)的反应结果均不为S型曲线,则样品中均不含有鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒。
四、重复性试验
按照上述一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR,不同的是模板为拷贝数均为1×108拷贝/μl的鸭坦布苏病毒RNA和鸭源新城疫病毒DNA混合的阳性样品。分为3个标本同时检测。通过计算Ct值的标准差(SD)和变异系数(CV)来验证荧光定量RT-PCR的批内重复性。三天后重复检测保存于-20℃的模板,来验证模板的稳定性及荧光定量RT-PCR的批间重复性。
检测结果见图7-8和表3所示,图7为在610nm激发光(ROX)下检测鸭坦布苏病毒RNA通道,图8为在530nm激发光(FAM)下检测鸭源新城疫病毒通道,可见,变异系数均小于3%(表3)。结果说明此方法具有良好的准确性和重复性。
表3 批间重复性

实施例3、检测试剂盒的组装
根据实施例1和2的研究结果,组装检测试剂盒以方便使用。
A液:PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B;其中,PrimeScriptTM Reverse Transcriptase(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:2680A);Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:RR390A);引物 1、引物2、探针A终浓度均为0.2μmol/L,引物3、引物4、探针B终浓度均为0.2μmol/L;
B液:DTMUV+NDV模板,作为阳性对照;
C液:ddH2O,作为阴性对照。
实施例4、临床病料的检测
待测样本为广西地区鸭群收集的100份病料(编号为1-100),分别提取鸭病料(病鸭的肝、病鸭的脾脏或病鸭的肺脏)的RNA。分别将编号为1-100各个样本的RNA混合作为模板,使用实施例3的试剂盒,按照实施例2一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR。
参照上述判断标准评价检测结果如下:
检出鸭坦布苏病毒15份(阳性率为15%),检出鸭源新城疫病毒12份(阳性率为12%),其他样本均未检出鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒。
同时,将100份病料(编号为1-100)分别按照参照文献[1]李庆阳,陈芳艳,刘平,等.鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].动物医学进展,2012,33(7):18-22.和参照文献[2]陈安莉.鸭源新城疫病毒分离鉴定、遗传进化分析及检测方法的研究[D].广西大学硕士学位论文,2012.中的方法进行鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒检测,结果与本发明一致,说明本发明的方法正确。
上述结果说明广西地区的鸭群存在鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的感染,该二重荧光定量RT-PCR方法的建立,对广西地区鸭群的疫病控制有指导意义。


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1、(10)申请公布号 CN 104313186 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104313186 A (21)申请号 201410606300.4 (22)申请日 2014.10.30 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 广西壮族自治区兽医研究所 地址 530001 广西壮族自治区南宁市西乡塘 区友爱北路 51 号 (72)发明人 谢芝勋 曾婷婷 谢丽基 邓显文 谢志勤 罗思思 刘加波 黄莉 黄娇玲 (74)专利代理机构 广西南宁公平专利事务。

2、所有 限责任公司 45104 代理人 杨立华 (54) 发明名称 鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定 量 RT-PCR 检测试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种鸭坦布苏病毒和鸭源新城 疫病毒二重荧光定量 RT-PCR 检测试剂盒, 包括引 物组和探针组 ; 引物组有引物 1 至 4, 它们分别具 有序列表 SEQ.ID.No.1 和 2、 SEQ.ID.No.4 和 5 的 碱基序列 ; 探针组有探针 A 和探针 B, 它们分别具 有序列表 SEQ.ID.No.3 和 6 的碱基序列。实验证 明, 本发明具有检测时间短、 检测敏感性高且特异 性强的优点, 可实现同时检测和鉴别鸭坦布苏病。

3、 毒和鸭源新城疫病毒两种病原体, 并对其相应病 原含量进行定量, 因而可用于鸭坦布苏病毒和鸭 源新城疫病毒疫苗和药物疗效的评估, 以及其致 病机理等方面的研究, 因此本发明对鸭坦布苏病 毒和鸭源新城疫病毒的防治有重要意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104313186 A CN 104313186 A 1/1 页 2 1. 鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量 RT-PCR 检测引物组, 其特。

4、征在于包 括两对特异性引物, 分别是引物1和2、 引物3和4, 它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、 SEQ.ID.No.4 和 5 的碱基序列。 2. 一种鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量 RT-PCR 检测试剂盒, 其特征在 于包括引物组和探针组 ; 引物组有引物1至4, 它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、 SEQ. ID.No.4 和 5 的碱基序列 ; 探针组有探针 A 和探针 B, 它们分别具有序列表 SEQ.ID.No.3 和 6 的碱基序列。 3. 根据权利要求 1 所述的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量 RT-PCR 检测 试剂盒, 其特征。

5、在于 : 所述探针 A 的 5 端标记有报告荧光染料 ROX, 3 端标记有淬灭荧光染 料 BHQ2 ; 所述探针 B 的 5 端标记有报告荧光染料 FAM, 3 端标记有淬灭荧光染料 BHQ1。 4. 根据权利要求 2 所述的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量 RT-PCR 检测 试剂盒, 其特征在于 : 所述引物 1、 引物 2、 探针 A、 引物 3、 引物 4 和探针 B 的摩尔比为 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1。 5. 根据权利要求 3 所述的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量 RT-PCR 检测 试剂盒, 其特征在于该试剂盒含有以下试剂 : A 液 : P。

6、CR 扩增缓冲液、 引物 1、 引物 2、 探针 A、 引物 3、 引物 4、 探针 B ; B 液 : DTMUV+NDV 模板, 作为阳性对照 ; C 液 : ddH2O, 作为阴性对照。 6. 根据权利要求 5 所述的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量 RT-PCR 检测 试剂盒, 其特征在于 : 所述 A 液中引物 1、 引物 2、 探针 A 终浓度均为 0.2mol/L, 引物 3、 引 物 4、 探针 B 终浓度均为 0.2mol/L。 权 利 要 求 书 CN 104313186 A 2 1/7 页 3 鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量 RT-PCR 检 测试剂盒 。

7、技术领域 0001 本发明属于 RT-PCR 检测试剂盒技术领域, 尤其涉及一种鸭坦布苏病毒和鸭源新 城疫病毒二重荧光定量 RT-PCR 检测试剂盒。 背景技术 0002 鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)是危害病原。 该病主要侵害产蛋鸭和 雏鸭, 引起产蛋鸭产蛋急剧下降和少量死亡, 导致产蛋鸭高淘汰率, 自 2010 年爆发以来严 重危害养鸭业。 鸭源新城疫病毒(Newcaslte Disease Virus, NDV), 同样引起产蛋鸭的产蛋 下降。 鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒感染产蛋鸭后, 引起相似的症状即产蛋下降, 因此迫 切需要建立一种快速敏感的鸭坦布。

8、苏病毒和鸭源新城疫病毒检测方法, 以便在感染早期就 能检测出这些病毒, 从而为这些病的控制争取宝贵的时间。 目前, 这两种病毒的传统检测方 法有病毒分离、 琼脂扩散试验等, 但这些检测存在耗时长、 敏感性较低、 不易标准化等缺点, 在实际应用中具有一定的局限性。 0003 荧光定量 PCR 技术实现了对模板的定量, 而且具有敏感、 特异、 准确可靠、 能实现 多重反应和实时性好等特点。在实际应用中, 当样品量非常大时, 单重荧光 PCR 在成本和时 间方面就存在一定的劣势, 迫切需要一种高通量、 低成本、 高效率的方法来进行批量的快速 检测。多重荧光 PCR 采用多对引物扩增检测多个模板, 克。

9、服了单重荧光 PCR 的不足。但是, 建立一个多重荧光 PCR 方法比单重的要复杂得多, 其对试剂和引物的要求更高, 同时需要 保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰, 使用的荧光定量 PCR 仪具有相应的多个检 测通道。目前, 还未见有应用多重荧光定量 PCR 技术对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒进 行检测和诊断的报道。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、 特异性高、 准确可靠、 快速方便的 鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量 RT-PCR 检测试剂盒, 以实现同时检测并定 量鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒两种病原体。 0005 为解决上述技术问题, 本发明采。

10、用以下技术方案 : 鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病 毒二重荧光定量 RT-PCR 检测引物组, 包括两对特异性引物, 分别是引物 1 和 2、 引物 3 和 4, 它们分别具有序列表 SEQ.ID.No.1 和 2、 SEQ.ID.No.4 和 5 的碱基序列。 0006 鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒二重荧光定量 RT-PCR 检测试剂盒, 包括引物组 和探针组 ; 引物组有引物 1 至 4, 它们分别具有序列表 SEQ.ID.No.1 和 2、 SEQ.ID.No.4 和 5 的碱基序列 ; 探针组有探针A和探针B, 它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。 0007 探针 A 。

11、的 5 端标记有报告荧光染料 ROX, 3 端标记有淬灭荧光染料 BHQ2 ; 探针 B 的 5 端标记有报告荧光染料 FAM, 3 端标记有淬灭荧光染料 BHQ1。 0008 引物 1、 引物 2、 探针 A、 引物 3、 引物 4 和探针 B 的摩尔比为 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1。 说 明 书 CN 104313186 A 3 2/7 页 4 0009 该试剂盒含有以下试剂 : 0010 A 液 : PCR 扩增缓冲液、 引物 1、 引物 2、 探针 A、 引物 3、 引物 4、 探针 B ; 0011 B 液 : DTMUV+NDV 模板, 作为阳性对照 ; 0012 。

12、C 液 : ddH2O, 作为阴性对照。 0013 A 液中引物 1、 引物 2、 探针 A 终浓度均为 0.2mol/L, 引物 3、 引物 4、 探针 B 终浓 度均为 0.2mol/L。 0014 针对目前缺乏对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒同时进行检测和诊断的有效可 靠的技术, 发明人研究筛选了两套特异性的探针和引物, 并通过进行不同浓度的配比, 获得 最佳引物和探针的浓度组合, 据此建立了鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的二重荧光定量 RT-PCR 的检测方法, 并制备了相应的检测试剂盒。实验证明, 本发明具有如下优点 : 0015 1) 检测时间短 0016 应用本发明可实现一管二检的目。

13、的, 并且反转录和PCR一步完成, 仅需约30分钟, 并且反应结果可以直接通过电脑观察, 而常规的RT-PCR方法起码需要3.5小时来完成扩增 反应, 然后还得花 1 小时进行凝胶电泳来观察结果 ; 0017 2) 检测敏感性高且特异性强 0018 当鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒同时存在时, 本发明对其检测的 CT 值与单个 病毒检测的 CT 值比较, 结果基本一样, 并未影响对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的检出 及检出的敏感性。 另外, 利用本发明还可对样品中相应病原含量进行定量, 并且检测敏感性 非常高, 均能检测到100个拷贝的鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒, 比常规PCR方法敏感性 高 。

14、10 倍, 因而可用于鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒疫苗和药物疗效的评估, 以及其致病 机理等方面的研究, 因此本发明对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的防治有重要意义。 附图说明 0019 图 1 是荧光定量 RT-PCR 检测鸭坦布苏病毒的敏感性 (ROX 通道 ) 结果图, 图中 : 1 9 分别为 11010 1102拷贝 /l, 10 空白对照 ( 为 DEPC 水 )。 0020 图 2 是荧光定量 RT-PCR 检测鸭坦布苏病毒的敏感性 (ROX 通道 ) 的标准曲线。 0021 图 3 是荧光定量 RT-PCR 检测鸭源新城疫病毒的敏感性 (FAM 通道 ) 结果图, 图中 : 1 。

15、9 分别为 11010 1102拷贝 /l, 10 空白对照 ( 为 DEPC 水 )。 0022 图 4 是荧光定量 RT-PCR 检测鸭源新城疫病毒的敏感性 (FAM 通道 ) 的标准曲线。 0023 图 5 是荧光定量 RT-PCR 检测鸭坦布苏病毒的特异性 (ROX 通道 ) 结果图, 图中 : 1 鸭坦布苏病毒, 2 鸭坦布苏病毒 + 鸭源新城疫病毒, 3 番鸭细小病毒, 4 鸭圆环病毒, 5 减蛋综 合症病毒, 6 鸭瘟病毒, 7H9 亚型禽流感, 8ddH2O。 0024 图 6 是荧光定量 RT-PCR 检测鸭源新城疫病毒的特异性 (FAM 通道 ) 结果图, 图中 : 其中1。

16、鸭源新城疫病毒, 2鸭坦布苏病毒+鸭源新城疫病毒, 3番鸭细小病毒, 4鸭圆环病毒, 5 减蛋综合症病毒, 6 鸭瘟病毒, 7H9 亚型禽流感, 8ddH2O。 0025 图 7 是荧光定量 RT-PCR 检测鸭坦布苏病毒的批内重复性 (ROX 通道 ) 结果图, 图 中 : 1-4 分别同一批次内四个重复样品 ,5-7 为阴性对照。 0026 图 8 是荧光定量 RT-PCR 检测鸭源新城疫病毒的批内重复性 (FAM 通道 ) 结果图, 图中 : 1-4 分别为同一批次内四个重复样品, 5 和 6 空白对照。 说 明 书 CN 104313186 A 4 3/7 页 5 具体实施方式 002。

17、7 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明, 均为常规方法 ; 所用的材料、 试剂 等, 如无特殊说明, 均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下 : 0028 Lightcycler2.0 荧光定量 PCR 仪 (Roche) ; DNA 片断回收试剂盒和质粒小量提取 试剂盒购自 BioDev 公司 ; pGEM-T Easy 试剂盒购自 Promega 公司 ; T7 体外转录试剂盒购自 Fermengtas公司 ; One Step PrimeScript RT-PCR Kit购自大连宝生物公司 ; TIANamp病毒 基因组 DNA/RNA 提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。 0。

18、029 鸭坦布苏病毒记载在 “4株广西鸭源坦布苏病毒分离及初步鉴定” , 中国动物检疫, 2013, 30(6):31-35, 公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得 ; 0030 减蛋综合症病毒记载在 “减蛋综合症植物油乳剂苗的研究” , 中国预防兽医学报, 2000, (04):23-27, 公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得 ; 0031 鸭圆环病毒记载在 “广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查” , 中国畜牧兽 医 ,2010, 37(11):156-158, 公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得 ; 0032 小鹅瘟病毒记载在 “小鹅瘟病毒荧光定量 PCR 检测方法的建立” , 上海畜。

19、牧兽医通 讯 ,2008, 160(06):30-31, 公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得 ; 0033 新 城 疫 病 毒 记 载 在 “新 城 疫 植 物 油 乳 剂 苗 的 研 究” , 中 国 预 防 兽 医 学 报 ,2000,(04):23-27, 公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得 ; 0034 鸭瘟病毒 AV1221 株购自中国兽医药品监察所 ; 0035 H9 亚型禽流感病毒记载在 “多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别 H9 亚型禽流 感病毒方法的建立” , 中国人兽共患病学报 ,2006,(09):858-860, 公众可从广西壮族自治区 兽医研究所获得。 0036 。

20、实施例 1、 引物与 Taqman 探针的设计与合成 0037 根据 GenBank 中鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的保守序列, 采用 Primer Express 3.0 软件, 设计了多套探针和引物, 通过分析其引物之间的二聚体, 选定两对特异 性引物和两条 Taqmam 探针 ( 表 1)。 0038 表 1 为引物和 TaqMan 探针序列 (5 -3 ) 0039 0040 实施例 2、 荧光定量 RT-PCR 检测的建立 0041 一、 荧光定量 RT-PCR 检测方法的确定 说 明 书 CN 104313186 A 5 4/7 页 6 0042 1、 样本的制备 0043 1)、。

21、 核酸的提取 0044 参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书, 提取鸭坦布苏病毒、 新城疫 病毒和 H9 亚型禽流感的 RNA, 提取减蛋综合症病毒、 鸭圆环病毒、 小鹅瘟病毒和鸭瘟病毒的 DNA。 0045 2)、 RNA 的反转录 0046 鸭坦布苏病毒、 鸭源新城疫病毒和 H9 亚型禽流感反转录合成 cDNA, 具体如下 : 建 立如下反转录体系, 总反应体积为 50L) 的鸭坦布苏病毒、 新城疫病毒和 H9 亚型禽流感 RNA 为 36.5L( 约 20g), 10L 5PCR 缓冲液 ( 大连宝生物工程有限公司, 产品目录 号 : 2680A), 2L 10mM。

22、 dNTP( 四种碱基 )( 大连宝生物工程有限公司, 产品目录号 : 4019), 1L RNA 抑制剂 ( 大连宝生物工程有限公司, 产品目录号 : 2313A), 1L 随机引物 ( 大连 宝生物工程有限公司, 产品目录号 : 3802), 1L 反转录酶 ( 大连宝生物工程有限公司, 产品 目录号 : 2680A), 用无 Rnase 水加至总体积为 20L, 离心均匀, 于 25 10min, 42 60min, 95 5min, 4结束, 得到鸭坦布苏病毒、 鸭源新城疫病毒和 H9 亚型禽流感 cDNA。 0047 2、 标准品的制备 0048 分别以上述得到的鸭坦布苏病毒和鸭源新。

23、城疫病毒的cDNA为模板进行PCR扩增, 反应体系为 50L( 含 0.2mmol/L dNTP、 2.5mmol/L MgCl2、 0.5mol/L 引物 ( 表 1)、 1.25U Taq 聚合酶、 1PCR buffer、 5L DNA 模板 ), 反应条件为 : 95预变性 5min, 94 60s, 50 60s, 70 60s, 35 个循环, 72延伸 10min。 0049 PCR 产物经 2琼脂糖凝胶电泳, 回收目的片断后克隆至 pGEM-T Easy 载体, 阳 性克隆菌 (pGEM-NDV 和 pGEM-TMUV) 送大连宝生生物技术有限公司进行测序, pGEM-TMUV。

24、 菌中含有的 PCR 产物大小为 68bp, 具有序列表中 SEQ.ID.No.7 的第 1-68 位核苷酸 ( 为 TMUV GX2013H 株的 NS5 序列, genbank 号为 KJ700462, 第 9995-10062 位核苷酸 ), 说明为 阳性克隆, 含有 TMUV 病毒 ; pGEM-NDV 菌中含有的 PCR 产物大小为 66bp, 具有序列表中 SEQ. ID.No.8 的第 1-66 位核苷酸 ( 为 duck-China-Guangxi19-2009 株的 NP 基因, genbank 号 为 :JX193080.1, 第 1671-1736 位核苷酸 ), 说明为。

25、阳性克隆, 含有 NDV 病毒。 0050 分别提取pGEM-NDV菌和pGEM-TMUV菌中的质粒, 得到pGEM-NDV质粒和pGEM-TMUV 质粒。 0051 将pGEM-NDV和pGEM-TMUV质粒作为阳性标准品, 按照文献(Vaitomaa,J.,Rantala A.,Halinen K.,Rouhiainen L.,Tallberg P.,Mokelke L.&Sivonen K.(2003) Quantitative Real-Time PCR for Determination of Microcystin Synthetase E Copy Numbers for Mic。

26、rocystis and Anabaena in Lakes.Applied and Environmental Microbiology.69:7289-7297.) 计算拷贝数, 结果为拷贝数为 1.81010和 2.11010拷贝 /l。 0052 将 pGEM-NDV 和 pGEM-TMUV 质粒, 37 Spe 单酶切过夜, 使质粒线性化, 琼脂糖 凝胶电泳及试剂盒回收纯化质粒 DNA 线性化产物, 用于体外转录, 按 T7 体外转录试剂盒 说明加入反应试剂 37作用 2h, 然后加 DNase 酶 1l, 37消化转录产物中未转录的 DNA20min, 70灭活 DNase 酶 1。

27、5min, 用等体积盐酸饱和苯酚、 氯仿抽提, 再用等体积氯仿 抽提, 取上清用 0.5 倍体积 5M 醋酸氨和 2 倍体积冰乙醇沉淀, 再用 75冰乙醇洗沉淀, 最 说 明 书 CN 104313186 A 6 5/7 页 7 后用 DEPC 水溶解, 得到 NDV-RNA 和 TMUV-RNA, 紫外分光光度计测 NDV-RNA 和 TMUV-RNA 浓 度和纯度, -70保存备用, 结果为 NDV-RNA 和 TMUV-RNA 浓度分别为 1.21010和 1.31010 拷贝 /l。 0053 3、 荧光定量 RT-PCR 的反应体系中引物和探针浓度的确立 0054 用 NDV-RNA。

28、 和 TMUV-RNA( 二者的拷贝比为 1:1) 作为模板, 将表 1 中的引物和探针 在终浓度为 0.2-0.8mol/L 之间, 进行不同浓度的配比进行荧光定量 RT-PCR, 选择引物和 探针的最佳浓度。 0055 扩增反应总体积为 20l, 其中 2One Step RT-PCR Buffer III( 大连宝生物 工程有限公司, 产品目录号 : DRR064A)10l ; Takara Ex Taq HS( 大连宝生物工程有限公 司, 产品目录号 : DRR064A)0.4l ; PrimeScript RT Enzyme Mix II( 大连宝生物工程有限 公司, 产品目录号 :。

29、 DRR064A)0.4l ; 2l 模板, 终浓度均为 0.2-0.8mol/L 的 TMUV-F、 TMUV-R 和 TMUV-probe ; 终浓度均为 0.2-0.8mol/L 的 NDV-F、 NDV-R 和 NDV-probe ; 余下用 灭菌 DEPC 水补足, 均匀混合, 置 Lightcycler 荧光定量 PCR 仪上进行自动化扩增反应。温 度转换率为20/s, 在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。 反应程序为 : 425min ; 95 10s ; 然后按 95变性 10s、 60退火延伸 20s 进行 40 个循环 ; 最后于 40结束反应。 0056 结果显示, 。

30、不同的引物和探针终浓度对试验结果影响比较大, 鸭坦布苏病毒上、 下 游引物及探针终浓度分别为 0.2mol/L, 鸭源新城疫病毒上、 下游引物及探针终浓度分别 为 0.2mol/L, 对标准品的检测可获得较小的 Ct 值。 0057 因此, 优化的荧光定量 RT-PCR 的反应体系如下 : 扩增反应总体积为 20l, 其 中 2One Step RT-PCR Buffer III( 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司,产 品 目 录 号 : DRR064A)10l ; Takara Ex Taq HS( 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司, 产 品 目 录 号 : DRR064。

31、A)0.4l ; PrimeScript RT Enzyme Mix II( 大连宝生物工程有限公司, 产品目录 号 : DRR064A)0.4l ; 2l 模板, 终浓度均为 0.2M 的 TMUV-F、 TMUV-R 和 TMUV-probe ; 终 浓度均为 0.2M 的 NDV-F、 NDV-R 和 NDV-probe ; 余下用灭菌 DEPC 水补足, 均匀混合, 置 Lightcycler 荧光定量 PCR 仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为 20 /s, 在每个循环 的延伸结束时进行荧光信号检测。 反应程序为 : 425min ; 9510s ; 然后按95变性10s、 60退。

32、火延伸 20s 进行 50 个循环 ; 最后于 40结束反应。 0058 FAM 在 530nm 激发光下发荧光, 用来检测鸭源新城疫病毒 ; ROX 在 610nm 激发光下 发荧光, 用来检测鸭坦布苏病毒 ; 0059 二、 荧光定量 RT-PCR 的敏感性试验 0060 分别以 10 倍系列稀释的 NDV-RNA( 鸭源新城疫病毒 ) 和 TMUV-RNA( 鸭坦布苏病 毒 ), 得到拷贝数均为 1109-1102拷贝 /l 的 NDV-RNA 和 TMUV-RNA, 再将各种拷贝数的 NDV-RNA 和 TMUV-RNA 混合作为模板进行二重荧光定量 PCR 扩增, 扩增体系和条件如一。

33、、 3 中 优化的荧光定量 RT-PCR 的反应体系和反应程序。 0061 在610nm激发光下的结果(ROX)如图1和2所示 ; 在530nm激发光下的结果(FAM) 如图 3 和 4 所示。从荧光曲线可见, 对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的检测 100 拷贝仍 有荧光曲线, 表明该检测方法对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的灵敏度均为 100 拷贝, 比常规 PCR 方法敏感性高 10 倍, 重复检测的结果一致。从标准曲线可见扩增成线性, 说明 所建立的方法具有很好的扩增效率。 说 明 书 CN 104313186 A 7 6/7 页 8 0062 三、 荧光定量 RT-PCR 的特异性试验及。

34、干扰性试验 0063 1、 荧光定量 RT-PCR 的特异性试验 0064 按照上述一、 3 中优化的荧光定量 RT-PCR 的反应体系和反应程序进行荧光定量 RT-PCR, 不同的是模板分别为鸭坦布苏病毒 RNA、 鸭坦布苏病毒 RNA+ 鸭源新城疫病毒 RNA、 番鸭细小病毒 RNA、 鸭圆环病毒 DNA、 减蛋综合症病毒 DNA、 鸭瘟病毒 DNA、 H9 亚型禽流感 RNA, 以 ddH2O 作为阴性对照。 0065 在 610nm 激发光下检测鸭坦布苏病毒的特异性, 结果 (ROX) 如图 5 所示, 可见, 样 品1和2有PCR产物, 得到相应病毒的特异性荧光曲线, 而样品3-8均。

35、没有特异性荧光曲线, 证实所设计的引物探针具有特异性, 该方法特异性强, 与其它检测对象无交叉反应。 0066 在 530nm 激发光下检测鸭源新城疫病毒的特异性, 结果 (FAM) 如图 6 所示, 可见, 样品 1 和 2 有 PCR 产物, 得到相应病毒的特异性荧光曲线, 而样品 3-8 均没有特异性荧光曲 线, 证实所设计的引物探针具有特异性, 该方法特异性强, 与其它检测对象无交叉反应。 0067 应用建立的二重荧光定量 PCR, 进行检测以确定两种模板存在时是否对检测的 Ct 值产生影响, 图5中鸭坦布苏病毒、 鸭坦布苏病毒RNA+鸭源新城疫病毒RNA混合样本(2)检 测的 CT 。

36、值分别为 13.21 和 13.59 ; 图 6 中, 鸭源新城疫病毒 RNA、 鸭坦布苏病毒 RNA+ 鸭源新 城疫病毒 RNA 混合样本检测的 CT 值分别为 13.81 和 13.95。结果说明, 样品中存在两种病 毒与存在单种病毒, 检测的 CT 值变异非常小, 并未影响对鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒 的检出及检出的敏感性。因此, 本发明的引物、 探针和及其建立的二重荧光定量 RT-PCR 检 测方法可应用于鉴定未知样本是否感染鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒, 二重荧光 PCR 反 应结果的判断如下 : 0068 反应结果为一条直线, 则为阴性 ; 反应结果为 S 型曲线, 则为阳性 ;。

37、 0069 若在 610nm 激发光下 (ROX) 的反应结果为 S 型曲线, 则待测样本中含有鸭坦布苏 病毒 ; 反之, 则样品中不含有鸭坦布苏病毒 ; 若在 530nm 激发光下 (FAM) 的反应结果为 S 型 曲线, 则待测样本中含有鸭源新城疫病毒 ; 反之, 则样品中不含有鸭源新城疫病毒 ; 0070 若在 610nm 激发光下 (ROX) 和 530nm 激发光下 (FAM) 的反应结果均为 S 型曲线, 则样品中含有鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒 ; 若在 610nm 激发光下 (ROX) 和 530nm 激发 光下 (FAM) 的反应结果均不为 S 型曲线, 则样品中均不含有鸭坦。

38、布苏病毒和鸭源新城疫病 毒。 0071 四、 重复性试验 0072 按照上述一、 3 中优化的荧光定量 RT-PCR 的反应体系和反应程序进行荧光定量 RT-PCR, 不同的是模板为拷贝数均为 1108拷贝 /l 的鸭坦布苏病毒 RNA 和鸭源新城疫 病毒 DNA 混合的阳性样品。分为 3 个标本同时检测。通过计算 Ct 值的标准差 (SD) 和变异 系数(CV)来验证荧光定量RT-PCR的批内重复性。 三天后重复检测保存于-20的模板, 来 验证模板的稳定性及荧光定量 RT-PCR 的批间重复性。 0073 检测结果见图 7-8 和表 3 所示, 图 7 为在 610nm 激发光 (ROX)。

39、 下检测鸭坦布苏病 毒 RNA 通道, 图 8 为在 530nm 激发光 (FAM) 下检测鸭源新城疫病毒通道, 可见, 变异系数均 小于 3 ( 表 3)。结果说明此方法具有良好的准确性和重复性。 0074 表 3 批间重复性 0075 说 明 书 CN 104313186 A 8 7/7 页 9 0076 实施例 3、 检测试剂盒的组装 0077 根据实施例 1 和 2 的研究结果, 组装检测试剂盒以方便使用。 0078 A 液 : PCR 扩增缓冲液、 引物 1、 引物 2、 探针 A、 引物 3、 引物 4、 探针 B ; 其中, PrimeScriptTM Reverse Trans。

40、criptase(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:2680A) ; Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)( 大连宝生物工程有限公司 , 产品目录号 :RR390A) ; 引物 1、 引物 2、 探针 A 终浓度均为 0.2mol/L, 引物 3、 引物 4、 探针 B 终浓度均为 0.2mol/L ; 0079 B 液 : DTMUV+NDV 模板, 作为阳性对照 ; 0080 C 液 : ddH2O, 作为阴性对照。 0081 实施例 4、 临床病料的检测 0082 待测样本为广西地区鸭群收集的 100 份病料 ( 编号为 1-100), 分别提取鸭病料 ( 病鸭的肝、。

41、 病鸭的脾脏或病鸭的肺脏 ) 的 RNA。分别将编号为 1-100 各个样本的 RNA 混合 作为模板, 使用实施例 3 的试剂盒, 按照实施例 2 一、 3 中优化的荧光定量 RT-PCR 的反应体 系和反应程序进行荧光定量 RT-PCR。 0083 参照上述判断标准评价检测结果如下 : 0084 检出鸭坦布苏病毒 15 份 ( 阳性率为 15 ), 检出鸭源新城疫病毒 12 份 ( 阳性率 为 12 ), 其他样本均未检出鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒。 0085 同时, 将 100 份病料 ( 编号为 1-100) 分别按照参照文献 1 李庆阳, 陈芳艳, 刘平 , 等 . 鸭坦布苏病毒 。

42、TaqMan 荧光定量 RT PCR 检测方法的建立 J. 动物医学进 展 ,2012,33(7):18-22. 和参照文献 2 陈安莉 . 鸭源新城疫病毒分离鉴定、 遗传进化分析 及检测方法的研究 D. 广西大学硕士学位论文, 2012. 中的方法进行鸭坦布苏病毒和鸭源 新城疫病毒检测, 结果与本发明一致, 说明本发明的方法正确。 0086 上述结果说明广西地区的鸭群存在鸭坦布苏病毒和鸭源新城疫病毒的感染, 该二 重荧光定量 RT-PCR 方法的建立, 对广西地区鸭群的疫病控制有指导意义。 说 明 书 CN 104313186 A 9 1/3 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 104313186 A 10 2/3 页 11 0003 序 列 表 CN 104313186 A 11 3/3 页 12 序 列 表 CN 104313186 A 12 1/2 页 13 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 104313186 A 13 2/2 页 14 图 7图 8 说 明 书 附 图 CN 104313186 A 14 。

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