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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410819646.2 (22)申请日 2014.12.25 201410799778.3 2014.12.19 CN C07C 403/24(2006.01) (71)申请人 宁夏农林科学院 地址 750002 宁夏回族自治区银川市金凤区 黄河东路 590 号 (72)发明人 刘兰英 曹有龙 石志刚 安巍 (54) 发明名称 一种枸杞叶黄素 HSCCC 分离制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种枸杞叶黄素 HSCCC 分离制 备方法, 主要包括如下步骤 : 枸杞果破碎提取、 提 取液浓缩、 皂化、 洗脱溶解、 HSCCC 分离。
2、, 得到枸杞 叶黄素溶液, 再经浓缩、 冷冻干燥, 得到叶黄素纯 品, 经 HPLC 分析检测纯度达 90.6以上。本发明 采用甲醇与四氢呋喃复合溶剂超声波提取, 结合 皂化工艺, 并与 HSCCC 协同作用, 成功解决了枸杞 中主要类胡萝卜素叶黄素和玉米黄素属同分异构 体, 分离困难的问题。利用秋果枸杞作为原料, 大 大降低了生产成本, 通过在逆流色谱分离纯化阶 段, 反复调整溶剂比例, 成功实现了叶黄素和玉米 黄素的有效分离, 获得了较高纯度的叶黄素单体, 为实现从枸杞中分离提纯叶黄素, 实现工业化生 产提供了新的思路。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和。
3、国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 104447470 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104447470 A 1/3 页 2 1. 一种枸杞叶黄素 HSCCC 分离制备方法, 包括如下步骤 : (1) 提取 : 称取枸杞鲜果, 研磨后加入甲醇、 四氢呋喃复合溶剂提取, 料液比 1:15, 超声 功率 300w, 超声提取 30min, 过滤得提取液, 滤渣按以上操作再提取 2 次, 合并提取液 ; 所述复合溶剂为体积比 1 : 1 的甲醇、 四氢呋喃复合溶液, 其中含有以混合溶液总体积 计 0.1质量体积百分数的 。
4、BHT ; (2) 浓缩 : 35条件下避光浓缩至提取液体积的四十分之一至四十五分之一, 得粗浓 缩物, 加入粗浓缩物8-12倍体积的石油醚和5-8倍体积10的NaCl水溶液于分液漏斗中, 有机层用粗浓缩物 8-10 倍体积的纯水洗至无色, 合并有机层, 用无水硫酸钠脱水, 浓缩至 与粗浓缩物同体积, 得到浓缩物 ; (3) 皂化 : 加入浓缩物 8-10 倍 10 KOH- 甲醇溶液, 充入 N2, 避光条件下在室温皂化 8-12h, 得皂化液 ; (4) 洗脱溶解 : 加入浓缩物 8-10 倍体积的石油醚和5-8 倍体积 10的 NaCl 溶液, 有机 层用纯水洗至中性, 避光浓缩蒸干, 。
5、残渣按质量体积比 1:50 加入二氯甲烷溶解, 得叶黄素 二氯甲烷溶液 ; (5)HSCCC 分离 : 采用高速逆流色谱仪, 选用体积比为 4:3:1 的正己烷 - 乙醇 - 水两相 溶剂体系, 流动相流速 1mL/min, 离心转速 1800r/min, 检测波长 450nm, 根据紫外谱图, 接收 目标成分。 2. 根据权利要求 1 所述枸杞叶黄素 HSCCC 分离制备方法, 还包括叶黄素 HPLC 检测步 骤 : 采用 Agilent 1260 高效液相色谱系统, YMC-C30 分析柱 (4.6250mm, 5m) ; 流动 相 A 相 : 质量体积百分比为 0.1的三乙胺甲醇水溶液,。
6、 所述甲醇水溶液中甲醇与水的体 积比为 75:25 ; B 相 : 体积比为 70:5:25 的丙酮 / 二氯甲烷 / 甲醇溶液 ; 梯度洗脱程序 : 0min-5min, 0 B-25 B ; 10-15min, 50 -85 B, 35-45min, 100 B-0 B ; 流速 1mL/min ; 检测波长 450nm ; 柱温 25, 进样量 25L。 3.根据权利要求1或2所述枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法, 其特征在于, 所述枸杞鲜 果为秋果枸杞。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述枸杞叶黄素 HSCCC 分离制备方法, 包括如下步骤 : (1) 提取 : 称取枸杞鲜果 10g。
7、, 研磨后加入甲醇、 四氢呋喃复合溶剂提取, 料液比 1:15, 超声功率 300w, 超声提取 30min, 过滤得提取液, 滤渣按以上操作再提取 2 次, 合并提取液 ; (2) 浓缩 : 35条件下避光浓缩至 10mL, 得粗浓缩物, 加入 100mL 石油醚和 50mL10的 NaCl 水溶液于分液漏斗中, 有机层用 100mL 的纯水洗至无色, 合并有机层, 用无水硫酸钠脱 水, 浓缩至 10mL, 得到浓缩物 ; (3) 皂化 : 加入 80mL10 KOH- 甲醇溶液, 充入 N2, 避光条件下在室温皂化 8h, 得皂化 液 ; (4)洗脱溶解 : 加入100mL的石油醚和50m。
8、L10的NaCl溶液, 有机层用纯水洗至中性, 避光浓缩蒸干, 残渣用 2mL 二氯甲烷溶解, 得叶黄素二氯甲烷溶液 ; (5) 枸杞叶黄素 HSCCC 分离 : 选取正己烷 - 乙醇 - 水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶黄素, 按 4:3:1 的体积比将上述溶剂组分超声 15min, 配置于分液漏斗中, 摇匀后静置分层 ; 待平 权 利 要 求 书 CN 104447470 A 2 2/3 页 3 衡一段时间后, 将上相和下相分开, 取下相作为固定相, 上相作为流动相 ; 采用半制备高 速逆流色谱仪, 配有 CF-80 泵, 手动进样阀, 柱容积为 500mL, UV3000U。
9、V-vis 紫外检测器, BSZ-100-LCD 自动馏分收集器 ; 取步骤 (4) 叶黄素二氯甲烷溶液 1mL 溶解于流动相中待用 ; 进样前, 先用固定相装满整个柱子, 调整主机转速为 1800rpm, 仪器反转, 以 1.0mL/min 的流 速将流动相泵入柱内 ; 待整个体系达到静态平衡后, 进样, 根据紫外谱图, 接收目标成分, 得 到纯化的枸杞叶黄素, HPLC 纯度达 93.6。 5. 根据权利要求 1 或 2 所述枸杞叶黄素 HSCCC 分离制备方法, 包括如下步骤 : (1) 提取 : 称取枸杞鲜果 10g, 研磨后加入甲醇、 四氢呋喃复合溶剂提取, 料液比 1:15, 超声。
10、功率 300w, 超声提取 30min, 过滤得提取液, 滤渣按以上操作再提取 2 次, 合并提取液 ; (2) 浓缩 : 35条件下避光浓缩至 11.25mL, 得粗浓缩物, 加入 90mL 石油醚和 70mL10 的 NaCl 水溶液于分液漏斗中, 有机层用 90mL 的纯水洗至无色, 合并有机层, 用无水硫酸钠 脱水, 浓缩至 11.25mL, 得到浓缩物 ; (3) 皂化 : 加入 112mL10 KOH- 甲醇溶液, 充入 N2, 避光条件下在室温皂化 10h, 得皂化 液 ; (4) 所述洗脱溶解 : 加入 100mL 的石油醚和 70mL10的 NaCl 溶液, 有机层用纯水洗至。
11、 中性, 避光浓缩蒸干, 残渣用 2mL 二氯甲烷溶解, 得叶黄素二氯甲烷溶液 ; (5) 枸杞叶黄素 HSCCC 分离 : 选取正己烷 - 乙醇 - 水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶黄素, 按 4:3:1 的体积比将上述溶剂组分超声 15min, 配置于分液漏斗中, 摇匀后静置分层 ; 待平 衡一段时间后, 将上相和下相分开, 取下相作为固定相, 上相作为流动相 ; 采用半制备高 速逆流色谱仪, 配有 CF-80 泵, 手动进样阀, 柱容积为 500mL, UV3000UV-vis 紫外检测器, BSZ-100-LCD 自动馏分收集器 ; 取步骤 (4) 叶黄素二氯甲烷溶液 1。
12、mL 溶解于流动相中待用 ; 进样前, 先用固定相装满整个柱子, 调整主机转速为 1800rpm, 仪器反转, 以 1.0mL/min 的流 速将流动相泵入柱内 ; 待整个体系达到静态平衡后, 进样, 根据紫外谱图, 接收目标成分, 得 到纯化的枸杞叶黄素, HPLC 纯度达 92.3。 6. 根据权利要求 1 或 2 所述枸杞叶黄素 HSCCC 分离制备方法, 包括如下步骤 : (1) 提取 : 称取枸杞鲜果 10g, 研磨后加入甲醇、 四氢呋喃复合溶剂提取, 料液比 1:15, 超声功率 300w, 超声提取 30min, 过滤得提取液, 滤渣按以上操作再提取 2 次, 合并提取液 ; (。
13、2) 浓缩 : 35条件下避光浓缩至 10.5mL, 得粗浓缩物, 加入 126mL 石油醚和 84mL10 的NaCl水溶液于分液漏斗中, 有机层用105mL的纯水洗至无色, 合并有机层, 用无水硫酸钠 脱水, 浓缩至 10.5mL, 得到浓缩物 ; (3) 皂化 : 加入 84mL10 KOH- 甲醇溶液, 充入 N2, 避光条件下在室温皂化 12h, 得皂化 液 ; (4) 洗脱溶解 : 加入 95mL 的石油醚和 65mL10的 NaCl 溶液, 有机层用纯水洗至中性, 避光浓缩蒸干, 残渣用 2mL 二氯甲烷溶解, 得叶黄素二氯甲烷溶液 ; (5) 枸杞叶黄素 HSCCC 分离 : 。
14、选取正己烷 - 乙醇 - 水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶黄素, 按 4:3:1 的体积比将上述溶剂组分超声 15min, 配置于分液漏斗中, 摇匀后静置分层 ; 待平 衡一段时间后, 将上相和下相分开, 取下相作为固定相, 上相作为流动相 ; 采用半制备高 权 利 要 求 书 CN 104447470 A 3 3/3 页 4 速逆流色谱仪, 配有 CF-80 泵, 手动进样阀, 柱容积为 500mL, UV3000UV-vis 紫外检测器, BSZ-100-LCD 自动馏分收集器 ; 取步骤 (4) 叶黄素二氯甲烷溶液 1mL 溶解于流动相中待用 ; 进样前, 先用固定相装满整。
15、个柱子, 调整主机转速为 1800rpm, 仪器反转, 以 1.0mL/min 的流 速将流动相泵入柱内 ; 待整个体系达到静态平衡后, 进样, 根据紫外谱图, 接收目标成分, 得 到纯化的枸杞叶黄素, HPLC 纯度达 90.6。 7. 根据权利要求 1-6 任一所述枸杞叶黄素 HSCCC 分离方法制备得到的枸杞叶黄素。 权 利 要 求 书 CN 104447470 A 4 1/5 页 5 一种枸杞叶黄素 HSCCC 分离制备方法 技术领域 0001 本发明属于分离提纯技术领域, 特别涉及一种枸杞叶黄素 HSCCC 分离制备方法。 背景技术 0002 高速逆流色谱(high-speed co。
16、untercurrent chromatography,简称HSCCC)是一 种能实现连续有效的分配分离功能的液液分配技术, 具有样品无损失、 无污染、 高效、 快 速和大制备量分离等优点。HSCCC 技术自发明以来, 由于其独特的分离优势, 得到了不断的 推广和发展, 目前已被广泛应用在中药成分分离、 保健食品、 生物化学、 生物工程、 天然产物 化学、 有机合成等领域。目前, 我国应用 HSCCC 技术在天然药物有效成分的分离纯化方面处 于国际领先地位。世界上许多国家, 尤其是墨西哥和西班牙早在 60 年代就开展了万寿菊植 物中天然叶黄素资源的专项研究, 我国叶黄素的应用尚处于研究开发阶段。
17、, 目前国内外叶 黄素加工主要以万寿菊和金盏菊花瓣为原料, 采用有机溶剂提取、 树脂皂化、 精制、 重结晶 制备。 0003 申请号 02100125.1 的中国发明 叶黄素的分离制备方法 涉及一种用高速逆流色 谱法从万寿菊粗提物中分离制备出高纯度单体叶黄素的方法。 其特点是所用的溶剂可为正 构、 烷烃、 卤代烃、 脂肪醇、 脂肪酮、 脂肪酯、 醚类、 水等溶剂, 其溶剂的两相组合可由其中的 三个、 四个或二个组分构成, 其适用于对各种途径获得的万寿菊花粗提物提纯, 纯度可达到 98以上, 用各种型号的逆流色谱仪分离制备叶黄素单体, 能直接进大量粗品或合成混合 物, 分离效果能达到很高的纯度。。
18、 0004 枸杞是我国重要的 “药食同源” 功能性特色植物资源, 传统医学认为枸杞具有 “滋 肝明目, 清肺补肾” 之功效, 枸杞富含类胡萝卜素, 其中速冻枸杞叶黄素含量达 65mg/100g, 居世界水果之首。叶黄素在延缓人体衰老、 预防视网膜黄斑退化、 抑制癌症、 抗心脑血管疾 病等方面有显著功效。 叶黄素是人眼视网膜黄斑色素的主要组成部分, 流行病学研究表明, 经常食用富含类胡萝卜素尤其是含叶黄素和玉米黄色素的食品, 能够有效预防眼球视网膜 黄斑退化引起的视力下降。作为一种优良的叶黄素来源, 枸杞的开发利用也正日益受到关 注。 但是, 作为中药材的枸杞果实价格昂贵, 导致从枸杞中分离制备。
19、叶黄素生产成本十分高 昂, 限制了从枸杞中分离提纯叶黄素的研究和应用, 更重要的是, 枸杞中不仅富含叶黄素, 同时富含玉米黄素, 而两者不易分离, 传统采用的柱色谱法和 HPLC 法制备量小, 难以实现 大规模工业化生产, 没有实际应用价值。如何降低生产成本, 从枸杞中有效分离提纯叶黄 素, 是我们要解决的问题。而有关采用 HSCCC 技术从枸杞中分离叶黄素的研究未见报道。 发明内容 0005 为解决上述问题, 本发明提供一种枸杞叶黄素 HSCCC 分离制备方法, 以枸杞为原 料, 采用 HSCCC 分离技术, 分离制备叶黄素, 所述枸杞叶黄素 HSCCC 分离制备方法包括如下 步骤 : 00。
20、06 枸杞果破碎提取、 类胡萝卜素提取液浓缩、 皂化、 洗脱溶解、 HSCCC 分离得到枸杞叶 说 明 书 CN 104447470 A 5 2/5 页 6 黄素溶液, 再经浓缩、 冷冻干燥, 得到叶黄素纯品, 采用 HPLC 分析检测产品纯度。 0007 所述枸杞叶黄素 HSCCC 分离制备方法主要步骤如下 : 0008 (1) 提取 : 称取枸杞鲜果, 研磨后加入甲醇、 四氢呋喃复合溶剂提取, 料液比 1:15, 超声功率 300w, 超声提取 30min, 过滤得提取液, 滤渣按以上操作再提取 2 次, 合并提取液 ; 0009 所述复合溶剂为体积比 1 : 1 的甲醇、 四氢呋喃复合溶。
21、液, 其中含有以混合溶液总 体积计 0.1质量体积百分数的 BHT。 0010 (2) 浓缩 : 35条件下避光浓缩至提取液体积的四十分之一至四十五分之一, 得 粗浓缩物, 加入粗浓缩物 8-12 倍体积的石油醚和 5-8 倍体积 10的 NaCL 水溶液于分液漏 斗中, 有机层用粗浓缩物 8-10 倍体积的纯水洗至无色, 合并有机层, 用无水硫酸钠脱水, 浓 缩至与粗浓缩物同体积, 得到浓缩物。 0011 (3) 皂化 : 加入浓缩物 8-10 倍 10 KOH- 甲醇溶液, 充入 N2, 避光条件下在室温皂 化 8-12h, 得皂化液。 0012 (4) 洗脱溶解 : 加入浓缩物 8-10。
22、 倍体积的石油醚和 5-8 倍体积 10的 NaCl 溶液, 有机层用纯水洗至中性, 避光浓缩蒸干, 残渣按质量体积比 1:50 加入二氯甲烷溶解, 得叶 黄素二氯甲烷溶液。 0013 (5)HSCCC 分离 : 采用高速逆流色谱仪, 选用体积比为 4:3:1 的正己烷 - 乙醇 - 水 两相溶剂体系, 流动相流速 1mL/min, 离心转速 1800r/min, 检测波长 450nm, 根据紫外谱图, 接收目标成分。 0014 (6) 叶黄素 HPLC 检测 : 0015 采用 Agilent 1260 高效液相色谱系统, YMC-C30 分析柱 (4.6250mm, 5m) ; 流 动相 。
23、A 相 : 质量体积百分比为 0.1的三乙胺甲醇水溶液, 所述甲醇水溶液中甲醇与水的 体积比为 75:25 ; B 相 : 体积比为 70:5:25 的丙酮 / 二氯甲烷 / 甲醇溶液 ; 梯度洗脱程序 : 0min-5min, 0 B-25 B ; 10-15min, 50 -85 B, 35-45min, 100 B-0 B ; 流速 1mL/min ; 检测波长 450nm ; 柱温 25, 进样量 25L。 0016 本发明通过以上技术手段成功地从枸杞原料中分离制备得到了叶黄素, 产品经 HPLC 分析检测纯度达 90.6以上。 0017 本发明优选秋果枸杞为原料。 0018 有益效果。
24、 : 0019 1. 采用超声波提取法, 超声波的空化效应可强化萃取, 加速萃取过程, 且条件温 和, 耗能少。 0020 2. 提取溶剂的选择 : 选用甲醇与四氢呋喃复合溶剂提取, 目标提取物叶黄素在四 氢呋喃中的溶解度最大, 为 8000mg/L, 而且所选用复合溶剂安全性较高。 0021 3.皂化过程对提取效果有着至关重要的影响。 枸杞中的叶黄素大部分以酯化形式 存在, 经过了有机溶剂萃取后, 它们的存在形式并没有发生改变, 因此, 在进一步纯化前必 须要经过皂化处理, 将叶黄素还原为单体形式。皂化处理可以使枸杞鲜果中的酯化叶黄素 最大限度释放出来, 皂化完全的程度直接影响提取效果。 时。
25、间短, 皂化不完全, 时间过长, 部 分叶黄素在碱性条件下会发生降解, 反而会降低叶黄素的提取率。同时, KOH- 甲醇溶液的 质量浓度也影响着皂化效果, 浓度过高会使叶黄素在强碱环境发生分解。本发明通过大量 试验, 研究了不同KOH-甲醇溶液浓度和皂化时间对提取效果的影响, 最终确定最佳KOH-甲 说 明 书 CN 104447470 A 6 3/5 页 7 醇溶液浓度为 10, 皂化时间为 8-12h。本发明采用特定的提取、 皂化工艺为 HSCCC 分离纯 化奠定了基础, 并与 HSCCC 协同作用, 与未经皂化直接经 HSCCC 分离相比, 枸杞果实中的叶 黄素提取量提高了近 4 倍。具。
26、体见表 1 和表 2。 0022 4. 叶黄素和玉米黄素是枸杞中的主要类胡萝卜素, 由于两者属同分异构体, 将两 者成功的分离存在很大困难。 本发明通过在逆流色谱分离纯化阶段, 反复调整溶剂比例, 成 功实现了叶黄素和玉米黄素的有效分离。 0023 5. 秋果枸杞也即 9 月中旬 -10 月底采摘的枸杞果实, 由于枸杞树前期消耗大量营 养, 果实表现为果形小, 果皮厚, 种子颗粒大, 出汁率低, 苦味和生药味加重, 不适宜加工利 用, 因而价格低廉, 干果每千克售价仅 10-15 元。发明人分析发现, 秋果枸杞类胡萝卜素总 量是夏果枸杞的75-80, 但其中叶黄素含量较夏果高5-8, 作为制备。
27、叶黄素的原 料非常适宜, 扩大了资源的有效开发利用, 又大大提升了枸杞的附加值。而且, 制备叶黄素 过程中产生的副产物枸杞籽是枸杞籽油的主要原料, 可实现二次增值。本发明利用秋果枸 杞作为制备叶黄素的原料, 大大降低了生产成本, 采用 HSCCC 技术, 实现了叶黄素和玉米黄 素的有效分离, 成功的获得了较高纯度的叶黄素单体, 为实现从枸杞中分离提纯叶黄素, 实 现工业化生产提供了新的思路。 0024 表 1 : KOH- 甲醇溶液质量浓度对叶黄素提取效果的影响 单位 : g/100g 0025 皂化液浓度58101520 叶黄素含量15.6416.7820.7518.0815.14 0026。
28、 注 : 本实验皂化时间 8h 0027 表 2 : 皂化时间对叶黄素提取效果的影响 单位 : g/100g 0028 皂化时间未皂化1h2h4h8h12h16h 叶黄素含量6.396.7810.4012.0824.4219.5715.10 具体实施方式 0029 实施例 1 0030 枸杞叶黄素 HSCCC 分离制备方法主要步骤如下 : 0031 (1) 提取 : 称取枸杞鲜果 10g, 研磨后加入甲醇、 四氢呋喃复合溶剂提取, 料液比 1:15, 超声功率 300w, 超声提取 30min, 过滤得提取液, 滤渣按以上操作再提取 2 次, 合并提 取液 ; 0032 所述复合溶剂为体积比 。
29、1 : 1 的甲醇、 四氢呋喃复合溶液, 其中含有以混合溶液总 体积计, 0.1质量体积百分数的 BHT。 0033 (2) 浓缩 : 35条件下避光浓缩至 10mL, 得粗浓缩物, 加入 100mL 石油醚和 50mL10的NaCL水溶液于分液漏斗中, 有机层用100mL的纯水洗至无色, 合并有机层, 用无 水硫酸钠脱水, 浓缩至 10mL, 得到浓缩物。 0034 (3) 皂化 : 加入 80mL10 KOH- 甲醇溶液, 充入 N2, 避光条件下在室温皂化 8h, 得皂 说 明 书 CN 104447470 A 7 4/5 页 8 化液。 0035 (4) 洗脱溶解 : 加入 100mL。
30、 的石油醚和 50mL10的 NaCl 溶液, 有机层用纯水洗至 中性, 避光浓缩蒸干, 残渣用 2mL 二氯甲烷溶解, 得叶黄素二氯甲烷溶液。 0036 (5) 枸杞叶黄素 HSCCC 分离 : 0037 选取正己烷 - 乙醇 - 水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶黄素, 按 4:3:1 的体积比将上述溶剂组分超声 15min, 配置于分液漏斗中, 摇匀后静置分层。待 平衡一段时间后, 将上相和下相分开, 取下相作为固定相, 上相作为流动相。采用半制备高 速逆流色谱仪, 配有 CF-80 泵, 手动进样阀, 柱容积为 500mL, UV3000UV-vis 紫外检测器, BSZ-。
31、100-LCD自动馏分收集器。 取步骤(4)叶黄素二氯甲烷溶液1mL溶解于流动相中待用。 进样前, 先用固定相装满整个柱子, 调整主机转速为 1800rpm, 仪器反转, 以 1.0mL/min 的流 速将流动相泵入柱内 ; 待整个体系达到静态平衡后, 进样, 根据紫外谱图, 接收目标成分。 得 到纯化的枸杞叶黄素, HPLC 纯度达 93.6。 0038 实施例 2 0039 枸杞叶黄素 HSCCC 分离制备方法主要步骤如下 : 0040 (1) 提取 : 同实施例 1 ; 0041 (2) 浓缩 : 35条件下避光浓缩至 11.25mL, 得粗浓缩物, 加入 90mL 石油醚和 70mL1。
32、0的 NaCL 水溶液于分液漏斗中, 有机层用 90mL 的纯水洗至无色, 合并有机层, 用无 水硫酸钠脱水, 浓缩至 11.25mL, 得到浓缩物。 0042 (3) 皂化 : 加入 112mL10 KOH- 甲醇溶液, 充入 N2, 避光条件下在室温皂化 10h, 得 皂化液。 0043 (4) 洗脱溶解 : 加入 100mL 的石油醚和 70mL10的 NaCl 溶液, 有机层用纯水洗至 中性, 避光浓缩蒸干, 残渣用 2mL 二氯甲烷溶解, 得叶黄素二氯甲烷溶液。 0044 (5) 枸杞叶黄素 HSCCC 分离同实施例 1。得到纯化的枸杞叶黄素, HPLC 纯度达 92.3。 0045。
33、 实施例 3 0046 枸杞叶黄素 HSCCC 分离制备方法主要步骤如下 : 0047 (1) 提取同实施例 1 ; 0048 (2) 浓缩 : 35条件下避光浓缩至 10.5mL, 得粗浓缩物, 加入 126mL 石油醚和 84mL10的NaCL水溶液于分液漏斗中, 有机层用105mL的纯水洗至无色, 合并有机层, 用无 水硫酸钠脱水, 浓缩至 10.5mL, 得到浓缩物。 0049 (3) 皂化 : 加入 84mL10 KOH- 甲醇溶液, 充入 N2, 避光条件下在室温皂化 12h, 得 皂化液。 0050 (4)洗脱溶解 : 加入95mL的石油醚和65mL10的NaCl溶液, 有机层用。
34、纯水洗至中 性避光浓缩蒸干, 残渣用 2mL 二氯甲烷溶解, 得叶黄素二氯甲烷溶液。 0051 (5) 枸杞叶黄素 HSCCC 分离同实施例 1 ; 得到黄色固体, 其 HPLC 纯度达 90.6。 0052 对比试验 1 : 0053 选取甲醇 - 丙酮 - 乙腈 - 水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶 黄素, 按 10:7:4.5:3 体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中, 摇匀后静置分层。待平 衡一段时间后, 将上相和下相分开, 取下相作为固定相, 上相作为流动相。采用半制备高 说 明 书 CN 104447470 A 8 5/5 页 9 速逆流色谱仪, 配有 CF-80 泵。
35、, 手动进样阀, 柱容积为 500mL, UV3000UV-vis 紫外检测器, BSZ-100-LCD 自动馏分收集器。取实施例 1 制备得到的叶黄素二氯甲烷溶液 1mL 溶解于流 动相中待用。进样前, 先用固定相装满整个柱子, 调整主机转速为 1800rpm, 仪器反转, 以 1.0mL/min 的流速将流动相泵入柱内 ; 待整个体系达到静态平衡后, 进样, 根据紫外谱图, 接收目标成分。得到纯化的枸杞叶黄素, HPLC 纯度达 80.3。 0054 对比试验 2 : 0055 选取甲醇-甲基叔丁基醚-水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶 黄素, 按 6 : 3 : 1 体积比将。
36、上述溶剂组分超声 15min, 配置于分液漏斗中, 摇匀后静置分层。 待平衡一段时间后, 将上相和下相分开, 取下相作为固定相, 上相作为流动相。采用半制备 高速逆流色谱仪, 配有 CF-80 泵, 手动进样阀, 柱容积为 500mL, UV3000UV-vis 紫外检测器, BSZ-100-LCD 自动馏分收集器。取实施例 1 制备得到的二氯甲烷溶解物 1mL 溶解于流动相 中待用。进样前, 先用固定相装满整个柱子, 调整主机转速为 1800rpm, 仪器反转, 以 1.0mL/ min 的流速将流动相泵入柱内 ; 待整个体系达到静态平衡后, 进样, 根据紫外谱图, 接收目 标成分。得到纯化。
37、的枸杞叶黄素, HPLC 纯度达 81.6。 0056 由对比试验可知 : 选取正己烷 - 乙醇 - 水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提 取物中的叶黄素, 较选取甲醇 - 丙酮 - 乙腈 - 水和甲醇 - 甲基叔丁基醚 - 水在半制备逆流 色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶黄素, 制备得到的叶黄素纯度均有明显提高, 这是由 于对比试验1和对比试验2中溶剂甲醇极性较高, 会增加叶黄素在固定相中的溶解难度, 另 外, 甲基叔丁基醚有毒性, 乙腈难以挥发, 而选取正己烷-乙醇-水作为溶剂体系, 克服了以 上缺点。以上试验说明 : 溶剂的选取对枸杞中叶黄素的提取具有重要影响, 选取体积比为 4:3:1 的正己烷 - 乙醇 - 水体系, 采用 HSCCC 分离枸杞叶黄素提纯率更高。 说 明 书 CN 104447470 A 9 。