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1、(10)申请公布号 CN 104263696 A (43)申请公布日 2015.01.07 CN 104263696 A (21)申请号 201410540658.1 (22)申请日 2014.10.14 C12N 5/04(2006.01) C12N 5/02(2006.01) (71)申请人 南京帝道农业科技有限公司 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇工 业集中区 (72)发明人 刘东锋 杨成东 (54) 发明名称 一种千年健悬浮细胞的快速繁殖方法 (57) 摘要 本发明研究了一种千年健悬浮细胞的快速繁 殖方法， 包括无菌培养体系的建立、 愈伤组织的诱 导、 增殖和悬浮细胞培养体。
2、系的建立等步骤， 本发 明方法所制备的千里健悬浮细胞分散性好， 细胞 团大小大致相同， 生长迅速， 重复性好， 易于控制， 为细胞大规模培养生产相关药用物质打下基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 (10)申请公布号 CN 104263696 A CN 104263696 A 1/1 页 2 1. 一种千年健悬浮细胞的快速繁殖方法， 包括无菌培养体系的建立、 愈伤组织的诱导、 增殖和悬浮细胞培养体系的建立， 其主要步骤如下 ： （1） 取千年健幼嫩的叶片， 进行消毒处理 ； （。
3、2）取 步 骤 （1）消 毒 处 理 过 的 千 年 健 幼 嫩 的 叶 片 切 割 成 1cm2的 小 块 接 入 HB+IAA0.1-0.2mg/L+6-BA1.0-1.5mg/L+1.0-1.5mg/L2,4-D 培养基中进行愈伤组织诱导， 附 加蔗糖 30g/L， 半凝固剂为琼脂 6g/L， pH 值以 1mol/L 的氢氧化钠或盐酸调至 6.0， 弱光照， 温度 24 ； （3） 取步骤 （2） 诱导出来的愈伤组织放入液体培养基改良 HB+0.1mg/L2,4-D+3.0mg/ L6-BA+1g/L 胡萝卜汁进行液体悬浮细胞培养， 附加蔗糖 30g/L， pH 值以 1mol/L 的。
4、氢氧化钠 或盐酸调至 6.0， 光照强度 2100lx， 光照时间 13h/d， 温度 25。 2.按照权利要求1所述的一种千年健悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中所述千年健无菌叶片的获得为取千年健幼嫩的叶片， 洗衣粉溶液中浸泡 30min， 用刷子刷 洗外植体表面， 流水冲洗 3h， 在超净工作台上 0.2% 的次氯酸钠处理 20min， 无菌水冲洗 8 次， 吸水纸吸干。 3.按照权利要求1所述的一种千年健悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征在于 ： 步骤 （3） 中千年健液体悬浮细胞培养的条件为取颜色淡黄， 质地疏松的愈伤组织1.5g接入150ml三 角瓶的液体培养基。
5、中震荡培养， 培养基25ml， 转速100r/min， 两周继代一次， 继代时用80目 筛过滤。 权 利 要 求 书 CN 104263696 A 2 1/2 页 3 一种千年健悬浮细胞的快速繁殖方法 技术领域 0001 本发明涉及一种千年健悬浮培养的快繁方法， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 千年健，Homalomena occulta， 天南星科， 别名一包针、 千颗针、 千年见、 丝棱线， 多 年生草本植物。 根茎匍匐， 肉质根圆柱形， 花前席卷成纺锤形， 盛花时上部略展开成短舟状， 子房长圆形， 胚珠多， 褐色种子长圆形。 绿色的扇子叶， 花期79月。 千年健喜温暖、 湿润、 。
6、郁闭， 怕寒冷、 干旱和强光直射， 是比较典型的喜阴植物。 一般在年平均气温22左右、 年降 雨量 1000 毫米以上、 空气相对湿度 80% 以上、 郁闭度在 70% 90%。土壤含水量在 30% 40% 的肥沃砂壤上生长良好。能耐 0左右短时低温。过于干旱， 植株易枯萎死亡。在强光 下植物生长缓慢， 叶子变黄， 甚至发生灼伤现象。千年健生长缓慢， 在生长期间随地上茎的 增高， 根茎也增长和增粗， 并不断从根茎节上抽出新芽， 长出新的分株， 形成植株丛。 一年四 季都可抽芽形成新的分株， 营养生长期抽芽成株多， 花期抽芽成株少。 生于海拔801100m 的沟谷密林下、 笔林和山坡灌丛中。竹林。
7、和山坡灌丛中。药用部位是千年健的干燥根茎。 春、 秋二季采挖， 洗净， 除去外皮， 晒干。气香， 味辛、 微苦。性辛， 温， 小毒。归入肝 ； 肾 ； 胃 经。具有祛风湿、 舒筋活络、 止痛、 消肿等功效。能治风湿痹痛、 肢节酸育、 筋骨痿软、 跌打损 伤、 胃痛、 痈疽疮肿等。繁殖方法主要采用根状茎繁殖。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是提供一种千年健悬浮细胞的快速繁殖方法， 由该方 法所制备的千年健悬浮细胞分散性好， 细胞团大小大致相同， 生长迅速， 重复性好， 易于控 制， 为通过细胞大规模培养生产相关药用物质打下基础。 0004 本发明所要解决的技术问题是通过以下方案来实。
8、现的 ： 取千年健幼嫩的叶片， 洗衣粉溶液中浸泡 30min， 用刷子刷洗外植体表面， 流水冲洗 3h， 在超净工作台上 0.2% 的次氯酸钠处理 20min， 无菌水冲洗 8 次， 吸水纸吸干， 消毒处 理过的千年健幼嫩的叶片切割成 1cm2的小块接入 HB+IAA0.1-0.2mg/L+6-BA1.0-1.5mg/ L+1.0-1.5mg/L2,4-D 培养基中进行愈伤组织诱导， 附加蔗糖 30g/L， 半凝固剂为琼脂 6g/L， pH 值以 1mol/L 的氢氧化钠或盐酸调至 6.0， 弱光照， 温度 24， 取诱导出来的颜色淡黄， 质 地疏松的愈伤组织1.5g放入液体培养基改良HB+0。
9、.1mg/L2,4-D+3.0mg/L6-BA+1g/L胡萝卜 汁进行液体悬浮细胞培养， 附加蔗糖 30g/L， pH 值以 1mol/L 的氢氧化钠或盐酸调至 6.0， 光 照强度2100lx， 光照时间13h/d， 温度25， 接入150ml三角瓶的液体培养基中震荡培养， 培 养基 25ml， 转速 100r/min， 两周继代一次， 继代时用 80 目筛过滤。 0005 采用本发明制备的悬浮细胞增长率高， 周期短， 产量大， 利于大规模种植。 0006 下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述， 但本发明要求保护的范围并不 局限于下列实施方式。 说 明 书 CN 104263696 A。
10、 3 2/2 页 4 具体实施方式 0007 实施例 1 取千年健幼嫩的叶片， 洗衣粉溶液中浸泡 30min， 用刷子刷洗外植体表面， 流水冲洗 3h， 在超净工作台上0.2%的次氯酸钠处理20min， 无菌水冲洗8次， 吸水纸吸干， 消毒处理过 的千年健幼嫩的叶片切割成 1cm2的小块接入 HB+IAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L+1.0mg/L2,4-D 培养基中进行愈伤组织诱导， 附加蔗糖 30g/L， 半凝固剂为琼脂 6g/L， pH 值以 1mol/L 的氢 氧化钠或盐酸调至 6.0， 弱光照， 温度 24， 取诱导出来的颜色淡黄， 质地疏松的愈伤组织 1.5g 放入液体培。
11、养基改良 HB+0.1mg/L2,4-D+3.0mg/L6-BA+1g/L 胡萝卜汁进行液体悬浮细 胞培养， 附加蔗糖 30g/L， pH 值以 1mol/L 的氢氧化钠或盐酸调至 6.0， 光照强度 2100lx， 光 照时间 13h/d， 温度 25， 接入 150ml 三角瓶的液体培养基中震荡培养， 培养基 25ml， 转速 100r/min， 两周继代一次， 继代时用 80 目筛过滤， 增长率提高 56%。 0008 实施例 2 取千年健幼嫩的叶片， 洗衣粉溶液中浸泡 30min， 用刷子刷洗外植体表面， 流水冲洗 3h， 在超净工作台上0.2%的次氯酸钠处理20min， 无菌水冲洗8。
12、次， 吸水纸吸干， 消毒处理过 的千年健幼嫩的叶片切割成 1cm2的小块接入 HB+IAA0.2mg/L+6-BA1.5mg/L+1.5mg/L2,4-D 培养基中进行愈伤组织诱导， 附加蔗糖 30g/L， 半凝固剂为琼脂 6g/L， pH 值以 1mol/L 的氢 氧化钠或盐酸调至 6.0， 弱光照， 温度 24， 取诱导出来的颜色淡黄， 质地疏松的愈伤组织 1.5g 放入液体培养基改良 HB+0.1mg/L2,4-D+3.0mg/L6-BA+1g/L 胡萝卜汁进行液体悬浮细 胞培养， 附加蔗糖 30g/L， pH 值以 1mol/L 的氢氧化钠或盐酸调至 6.0， 光照强度 2100lx，。
13、 光 照时间 13h/d， 温度 25， 接入 150ml 三角瓶的液体培养基中震荡培养， 培养基 25ml， 转速 100r/min， 两周继代一次， 继代时用 80 目筛过滤， 增长率提高 50%。 0009 实施例 3 取千年健幼嫩的叶片， 洗衣粉溶液中浸泡 30min， 用刷子刷洗外植体表面， 流水冲洗 3h， 在超净工作台上0.2%的次氯酸钠处理20min， 无菌水冲洗8次， 吸水纸吸干， 消毒处理过 的千年健幼嫩的叶片切割成 1cm2的小块接入 HB+IAA0.2mg/L+6-BA1.5mg/L+1.0mg/L2,4-D 培养基中进行愈伤组织诱导， 附加蔗糖 30g/L， 半凝固剂。
14、为琼脂 6g/L， pH 值以 1mol/L 的氢 氧化钠或盐酸调至 6.0， 弱光照， 温度 24， 取诱导出来的颜色淡黄， 质地疏松的愈伤组织 1.5g 放入液体培养基改良 HB+0.1mg/L2,4-D+3.0mg/L6-BA+1g/L 胡萝卜汁进行液体悬浮细 胞培养， 附加蔗糖 30g/L， pH 值以 1mol/L 的氢氧化钠或盐酸调至 6.0， 光照强度 2100lx， 光 照时间 13h/d， 温度 25， 接入 150ml 三角瓶的液体培养基中震荡培养， 培养基 25ml， 转速 100r/min， 两周继代一次， 继代时用 80 目筛过滤， 增长率 52%。 说 明 书 CN 104263696 A 4 。