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1、(10)申请公布号 CN 104073517 A (43)申请公布日 2014.10.01 CN 104073517 A (21)申请号 201310120623.8 (22)申请日 2013.03.28 bjyylys-00001 2012.10.20 C12N 15/861(2006.01) C12N 15/66(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 卫生部北京医院 地址 100730 北京市东城区东单大华路 1 号 北京医院老研所办公室 (72)发明人 胡刚 林雅军 徐蓉 魏洁 程建华 (54) 发明名称 p66。
2、Shc 重组腺病毒载体及构建和应用 (57) 摘要 本发明提供一种 p66Shc 重组腺病毒载体， 是 利用基因工程技术， 将人 p66Shc 片段与 pAdeno X-CMV 载体在体外同源重组后， 转化感受态菌， 筛选正确的重组腺病毒并将其线性化后转染 HEK293A 细胞， 在 HEK293A 细胞内包装并大量扩 增。 本发明的p66Shc重组腺病毒载体感染人子宫 颈癌细胞 (Hela) 后可使细胞的生长增殖受到明 显抑制， 而感染人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 则不 发生明显的生长抑制效应。 本发明的p66Shc重组 腺病毒载体有望达到特异性抑制肿瘤细胞生长的 作用。 (83)生物保。
3、藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104073517 A CN 104073517 A 1/1 页 2 1. 一种 p66Shc 重组腺病毒载体， 所述载体中插入的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 2. 根据权利要求 1 所述的一种 p66Shc 重组腺病毒载体的构建方法， 其特征在于， 通过 以下步骤实现 ： (1) 设计上游引物 SEQ ID NO ： 2 ： 5 -gtaac。
4、tataacggtc atggatctcctgccc-3 ； 下游引 物 SEQ ID NO ： 2 ： 5 -attacctctttctcc tcacagtttccgctcca-3 ， 上下游引物 5 端分别包含 与 pAdeno X-CMV 载体上重组位点两端同源的 15bp 碱基对 ； (2)p66Shc基因PCR纯化物与pAdenoX-CMV载体在体外重组酶(In-Fusion HD Enzyme) 的作用下进行同源重组连接 ； (3) 阳性重组腺病毒质粒的鉴定， 片段在 34kb 左右者做测序鉴定。 3. 根据权利要求 1 所述的一种 p66Shc 重组腺病毒载体具备可特异性抑制肿瘤。
5、细胞生 长而对正常细胞生长无明显抑制作用的特点。 4. 根据 3 的 p66Shc 重组腺病毒载体， 其中肿瘤细胞选取人子宫颈癌肿瘤细胞系， 正常 细胞选取人脐静脉内皮细胞。 5. 根据 3 或 4 的 p66Shc 重组腺病毒载体， 其中人脐静脉内皮细胞细胞是原代细胞。 6. 根据 3 到 5 任何一项的 p66Shc 重组腺病毒载体存在于细胞裂解液中。 7. 根据 6 的细胞裂解液， 其中细胞是 HEK293A 细胞系。 8. 根据 6 或 7 的细胞裂解液， 其裂解前的细胞数是 3106。 9. 根据 6 至 8 的细胞裂解液， 其加入细胞培养基的量至少 0.01l/103细胞。 权 利。
6、 要 求 书 CN 104073517 A 2 1/5 页 3 p66Shc 重组腺病毒载体及构建和应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及 p66Shc 重组腺病毒的构建及应用， 是利用分子克 隆技术、 包括PCR扩增基因、 体外重组连接等， 获得能够感染各种细胞的p66Shc重组腺病毒 载体， 探讨了此载体对人子宫颈癌细胞 (Hela 细胞系 ) 和人脐静脉内皮细胞增殖的不同影 响， 为进一步研制可特异性抑制肿瘤细胞生长的腺病毒基因治疗制剂奠定了实验基础。 背景技术 0002 p66Shc 是调控哺乳动物细胞氧化应激及生命周期信号转导途径的关键蛋白， 由原 癌基因 ShcA。
7、 编码 (Biochim Biophys Acta， 1797， 952-960(2010)。p66Shc 蛋白含有几个 基本功能区 ： 1)N 末端磷酸化酪氨酸结合结构域 (PTB)， 在其 36 位氨基酸上有一个磷酸化 丝氨酸残基及一个与线粒体细胞色素 C 结合区 (CB)。它们是诱导线粒体细胞 ROS 产生的 关键位点与区域， 在调控细胞氧化应激及凋亡反应中起关键作用 (Arch Biochem Biophys， 486， 73-80(2009) ； 2)C 端 Src 同源 2 区 (SH2) ； 3) 中央富含脯氨酸结构域 (CH1) ； 4)N 端 富含脯氨酸结构域 (CH2)(T。
8、rends Biochem Sci， 21， 257-261(1996) ； J Biol Chem， 272， 28042-28049(1997) ； EMBO J， 16， 706-716(1997)。 李西川等研究发现小细胞肺癌是肺癌中 恶性程度最高的一种， 转移快， 存活率低。他们发现 ShcA 家族中的成员 p66Shc 在小细胞肺 癌细胞中表达缺失， 将 p66Shc 基因导入 p66Shc 表达缺失的鼠肺癌细胞中并通过鼠尾静脉 注射入小鼠体内， 能够 100抑制肿瘤细胞的转移， 说明 p66Shc 的缺失是小细胞肺癌细胞 转移的主要原因。另有报道 p66Shc 是调节氧化应激下凋。
9、亡应答和衰老信号转导途径的重 要基因， 可通过引起线粒体中活性氧自由基产生导致细胞氧化损伤， 敲除 p66Shc 可增强细 胞对氧化应激的抵抗能力， 如Menini等发现， p66Shc基因敲除鼠， 可减少STZ诱导的1型糖 尿病肾病肾组织的氧化损伤， 保护肾脏组织结构和功能， 降低蛋白尿， 抑制 NF-KB 的活性， 降低 AGE 的形成 (Diabetes， 55， 1642-1650(2006)。而 p66Sh c 的过表达则与机体内氧化 应激的增加密切相关 (Cell， 122， 221-233(2005) ； Nature， 402， 309-313(1999) ； PNAS， 10。
10、7， 13420-13425(2010)。另外， 高葡萄糖， 血管紧张素 II(Ang II) 可诱导 p66shc 磷酸化， 通 过PKC-p66Shc-P1n1-CytC信号通路， 导致小管细胞损伤(Am J Physiol Renal Physiol， 299， F1014-1025(2010)。根据这些报道， 目前认为 p66Shc 基因与细胞内活性氧水平密切 相关， 而对于 p66Shc 基因对于细胞增殖方面的作用还未见报道。 0003 本发明利用分子克隆技术、 包括 PCR 扩增基因、 体外重组连接等， 获得能够感染各 种细胞的 p66Shc 重组腺病毒载体， 探讨了此载体对人子宫。
11、颈癌细胞 (Hela 细胞系 ) 和人脐 静脉内皮细胞的增殖的不同影响， 为进一步研制可特异性抑制肿瘤细胞生长的腺病毒基因 治疗制剂奠定了实验基础。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种p66Shc重组腺病毒载体， 所述载体的核苷酸序列SEQ ID NO ： 1。 说 明 书 CN 104073517 A 3 2/5 页 4 0005 本发明的另一个目的是提供上述载体的构建方法， 通过以下步骤获得 ： 0006 (1) 获取目的基因 0007 将含有质粒 pcDNA3.1his p66shc 的菌株涂布于抗生素平板， 筛选阳性克隆， 挑取 单个克隆于 LB 培养基中振荡生长至 OD600。
12、值 0.8， 离心收集菌体， 用无内毒素质粒大提试剂 盒 (TIANGEN) 提取质粒， 以所提质粒为模板进行 PCR 扩增获得 p66Shc， 再用琼脂糖胶回收 法纯化目的基因。获得的目的基因 p66Shc 的两侧分别含有与 pAdeno X-CMV 上重组位点两 端同源的 15bp 碱基对。用于扩增的上下游引物 ( 由 Invitrogen 合成 ) 分别为 ： 上游引物 (SEQ ID NO ： 2) ： 0008 5 gtaactataacggtcatggatct cctgccc-3 ； 下游引物 (SEQ ID NO ： 3) ： 0009 5 -attacctctttctcctca。
13、c agtttccgctcca-3 ， 用于扩增的聚合酶为 PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer(TaKaRa)。 0010 (2) 克隆 pAdeno X-p66Shc 0011 100ngp66Shc(两端分别连接了15bp的同源臂)与200ng pAdenoX-CMV混合， 加入 In-Fusion HD Enzyme(Clontech)， 50孵育15min， 体外同源重组原理见图1。 取1.5l反 应液加入一管感受态菌 (100l) 中进行转化。转化过程 ： 冰上孵育 30min， 42热激 90s， 冰上孵育 2min 后立即加入 9。
14、00l SOC 培养基， 37振荡培养 1h 后取 100l 均匀涂布于 氨苄青霉素平板， 37培养过夜后挑取单个克隆。 0012 (3)pAdeno X-p66Shc 质粒的鉴定 0013 挑取的单个克隆取少量作为模板进行菌落 PCR， 筛选引物分别为 ： 上游引物 (SEQ ID NO ： 4) ： 5 -tagtgtggcggaagtg tgatgttgc-3 ；下 游 引 物 (SEQ ID NO ： 5) ： 5 -taccgtagctgagcttctag-3 ， 选取能扩增出 3.7kb 左右片段的的单个菌落于 LB 培养 基中振荡生长至 OD600值 0.8， 离心收集菌体用 N。
15、ucleoBond Xtra Midi(Macherey-Nagel) 提取重组腺病毒质粒， 质粒经 Xho I 限制性内切酶酶切， 琼脂糖电泳分析后进行测序 (Invitrogen)。 0014 (4) 异丙醇沉淀回收线性化 pAdenoX-p66Shc 质粒 0015 10g pAdeno X-p66Shc 质粒经 Pac I 酶切暴露其倒置终端重复序列。线性化的 质粒经异丙醇沉淀纯化回收 ： 酶切反应液 100l 与 70l 异丙醇混合， 4， 13000g 离心 30min， 弃取上清加入 1ml70乙醇洗涤， 室温， 13000g 离心 10min， 弃去上清后置于超净台 中干燥十分。
16、钟， 加入 10l 无菌去离子水溶解质粒 DNA。 0016 (5) 人 p66Shc 腺病毒颗粒的产生 0017 0.8g 线性化 pAdeno X-p66 质粒与 2l lipofectamine2000 混合溶于 100l 无血清无双抗 MEM 培养基 (HyClone) 中， 室温孵育 20min， 加入一孔单层 HEK293A 细胞中 (24孔板培养， 前一天传代使转染时细胞达到90-95汇合)， 37， CO2孵箱温育， 4h后更换 新鲜的 5小牛血清 DMEM 培养基， 24h 后 1 10 传代， 继续培养。每天于倒置显微镜 (Oly mpus CKX31)下观察细胞状态， 1。
17、0d后吹打离心收集细胞， 反复冻融3次裂解细胞， 简单离心 沉淀细胞碎片， 取上清细胞裂解液感染正常 HEK293A 细胞获取高滴度病毒。 0018 本发明的再一个目的是提供所述的载体可在大部分细胞中大量表达 p66Shc 蛋 白， 并可特异性抑制肿瘤细胞生长而对正常细胞生长无明显抑制作用， 通过以下实验证 明 ： 说 明 书 CN 104073517 A 4 3/5 页 5 0019 (1) 感染人 p66Shc 缺陷型重组腺病毒的 Hela 细胞和人脐静脉内皮细胞中 p66Shc 蛋白的表达 ： 将收集的含人 p66Shc 腺病毒颗粒的细胞裂解液分别感染 Hela 细胞和人脐静 脉内皮细胞。
18、 48 小时后收集细胞提取蛋白， 采用 Western Blot 检测其中 p66Shc 蛋白的表达 水平。 0020 (2) 感染人 p66Shc 缺陷型重组腺病毒对 Hela 细胞生长曲线的影响 ： 将 Hela 细胞 传代， 计数， 加入 12 孔板中， 2105/ 孔， 分为实验组 ( 加入含 p66Shc 缺陷型重组腺病毒的 细胞裂解液 0.01l/103细胞 ) 和对照组 ( 加入含有绿色荧光蛋白的缺陷型重组腺病毒处 理 )， 每天每组分别计数三个孔的细胞数， 取平均值， 连续计数六天后， 绘制生长曲线图。 0021 (3) 感染人 p66Shc 缺陷型重组腺病毒对人脐静脉内皮细胞。
19、生长曲线的影响 ： 将人 脐静脉内皮细胞传代， 计数， 加入 24 孔板中， 1.5105/ 孔， 分为实验组 ( 加入含有 p66Shc 缺陷型重组腺病毒的细胞裂解液 0.06l/103细胞 ) 和对照组 ( 加入含有绿色荧光蛋白的 缺陷型重组腺病毒处理 )， 每天每组分别计数三个孔的细胞数， 取平均值， 连续计数六天后， 绘制生长曲线图。 0022 (4)Hela 细胞感染人 p66Shc 缺陷型重组腺病毒 48 小时后的 MTT 实验 ： 将 Hela 细 胞传代， 计数， 加入 96 孔板中， 4103/ 孔， 分为 5 个剂量组 ( 最低剂量组加入含有 p66Shc 缺陷型重组腺病毒。
20、的细胞裂解液 0.0025l/103细胞， 之后每组剂量 2 倍递增 ) 和对照组 ( 加入含有绿色荧光蛋白的缺陷型重组腺病毒处理 )， 每组 5 个平均孔， 处理 48 小时后， 每 孔加入 MTT20l， 避光 37孵育 4 小时， 然后弃去培养基， 加入二甲基亚砜 150l/ 孔， 置 摇床上振荡10分钟使结晶物充分溶解， 选择490nm波长在酶联免疫检测仪上检测各孔吸光 度值， 用 t 检验比较各组间的差异。 0023 (5) 人脐静脉内皮细胞感染人 p66Shc 缺陷型重组腺病毒 48 小时后的 MTT 实验 ： 将人脐静脉内皮细胞传代， 计数， 加入 96 孔板中， 8103/ 孔。
21、， 分为 5 个剂量组 ( 最低剂量 组加入含有 p66Shc 缺陷型重组腺病毒的细胞裂解液 0.02l/103细胞， 之后每组剂量 2 倍 递增 ) 和对照组 ( 加入含有绿色荧光蛋白的缺陷型重组腺病毒处理 )， 每组 5 个平均孔， 处 理 48 小时后， 每孔加入 MTT20l， 避光 37孵育 4 小时， 然后弃去培养基， 加入二甲基亚砜 150l/孔， 置摇床上振荡10分钟使结晶物充分溶解， 选择490nm波长在酶联免疫检测仪上 检测各孔吸光度值， 用 t 检验比较各组间的差异。 0024 本发明的优点在于 ： (1)利用基因工程技术， 将人p66Shc基因片段与pAdenoX-CM。
22、V 进行体外同源重组后， 转化感受态菌， 筛选正确的重组腺病毒质粒并将其线性化后转染 HEK293A 细胞， 在 HEK293A 细胞内包装并大量扩增。(2) 为制备理想的肿瘤基因治疗制剂奠 定了实验基础， 可应用于抑制肿瘤细胞生长， 首次证明该基因在细胞中的表达与肿瘤细胞 的生长抑制相关。 附图说明 0025 图 1 为重组腺病毒载体构建示意图。 0026 图 2 显示参考例 1 中感染了人 p66Shc 缺陷型重组腺病毒 48 小时后的 Hela 细胞 和人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 中 p66Shc 蛋白的表达情况， 对照组用含有绿色荧光蛋白的 缺陷型重组腺病毒处理， 实验组用含有。
23、人 p66Shc 缺陷型重组腺病毒的细胞裂解液处理。 0027 图 3 显示参考例 2 中感染了人 p66Shc 缺陷型重组腺病毒的 Hela 细胞和对照组细 说 明 书 CN 104073517 A 5 4/5 页 6 胞的生长曲线。 0028 图 4 显示参考例 3 中感染了人 p66Shc 缺陷型重组腺病毒的人脐静脉内皮细胞和 对照组细胞的生长曲线。 0029 图 5 显示参考例 4 中感染了不同剂量人 p66Shc 缺陷型重组腺病毒的 Hela 细胞和 对照组细胞的 48 小时 MTT 结果比较。1 的剂量为 0.0025l/103细胞。 0030 图 6 显示参考例 5 中感染了不同。
24、剂量人 p66Shc 缺陷型重组腺病毒的人脐静脉内 皮细胞和对照组细胞的 48 小时 MTT 结果比较。1 的剂量为 0.02l/103细胞。 具体实施方式 0031 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 0032 实施例 1p66Shc 重组腺病毒载体的构建与表达 0033 (1)pAdenoX-p66Shc 的克隆 0034 pAdenoX-p66Shc重组质粒经Xho I酶切， 电泳分析共包含1445， 2466， 3320， 5629， 8046， 五个条带， 条带大小均与重组质粒上酶切位点的数量与分布一致。 经过进。
25、一步测序验 证确认 pAdenoX-CMV 的重组克隆位点已准确连接了目的基因 p66Shc 的开放阅读框。 0035 (2) 人 p66Shc 腺病毒颗粒的产生 0036 将经Pac I酶切线性化后的pAdeno X-p66Shc重组质粒转染HEK293A细胞后第10 天在倒置显微镜下可观察到特征性细胞病变效应 (CPE)， 即细胞变圆， 折光性增强， 并开始 出现明显噬斑甚至细胞脱落， 收集的细胞裂解液 ( 初代腺病毒 ) 感染 HEK293A 细胞 48h 后， 感染组细胞 95以上变圆飘起呈串珠状。 0037 (3) 感染人 p66Shc 缺陷型重组腺病毒的 Hela 细胞和人脐静脉内。
26、皮细胞中 p66Shc 蛋白的表达 0038 将收集的含人p66Shc腺病毒颗粒的细胞裂解液分别感染Hela细胞和人脐静脉内 皮细胞 48h 后收集细胞提取蛋白， 采用 Western Blot 检测其中 p66Shc 蛋白的表达水平， 均 观察到相对分子质量55-72KDa间特征条带， 其大小与p66Shc蛋白基本吻合， 且其含量较对 照组细胞明显增高 ( 图 2)。 0039 实施例 2p66Shc 重组腺病毒载体抑制肿瘤细胞生长作用 0040 本发明构建的 p66Shc 重组腺病毒载体感染人子宫颈癌细胞 (Hela 细胞 )， 发挥抑 制 Hela 细胞增殖的作用。 0041 (1)He。
27、la 细胞感染 p66Shc 重组腺病毒后增殖速度明显减低 ： 从 Hela 细胞的生长 曲线可以看出， 感染 p66Shc 重组腺病毒 24h 后， Hela 细胞的增殖速度持续降低， 与对照组 ( 以感染绿色荧光蛋白重组腺病毒载体 (Ad-GFP) 的 Hela 细胞作为阴性对照 ) 相比有统计 学意义 ( 第 2、 3 天， p 0.05 ； 第 4、 5、 6 天， p 0.01)( 图 3)。Hela 细胞感染人 p66Shc 缺 陷型重组腺病毒 48h 后的 MTT 实验显示， 当加入的含有 p66Shc 缺陷型重组腺病毒的细胞裂 解液量达到 0.02l/103细胞后开始对 Hel。
28、a 细胞的增殖产生明显影响， 与对照组相比有统 计学意义 (p 0.05)( 图 5)。 0042 (2)人脐静脉内皮细胞(HUVECs)感染p66Shc重组腺病毒后增殖速度无明显改变 ： 从 HUVEC 的生长曲线可以看出， 感染 p66Shc 后连续 6 天， HUVEC 细胞数与对照组相比无统 说 明 书 CN 104073517 A 6 5/5 页 7 计学意义 ( 图 4)。人脐静脉内皮细胞感染人 p66Shc 缺陷型重组腺病毒 48h 后的 MTT 实验 显示， 高于 Hela 细胞最高感染剂量 8 倍的 p66Shc 缺陷型重组腺病毒感染对人脐静脉内皮 细胞的增殖仍无明显影响 ( 图 6)。 说 明 书 CN 104073517 A 7 1/1 页 8 0001 序 列 表 CN 104073517 A 8 1/3 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104073517 A 9 2/3 页 10 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 104073517 A 10 3/3 页 11 图 6 说 明 书 附 图 CN 104073517 A 11 。