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1、(10)申请公布号 CN 103992987 A (43)申请公布日 2014.08.20 CN 103992987 A (21)申请号 201410095644.3 (22)申请日 2014.03.17 C12N 5/10(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/113(2010.01) (71)申请人 首都医科大学 地址 100069 北京市丰台区右安门外西头条 10 号基础科研楼 1023 室 (72)发明人 张玉祥 刘浩 (54) 发明名称 一种通过Notch通路调节胰腺癌细胞EGFR表 达的方法 (57) 摘要 一个通过 Notch 通路调节胰腺癌细。
2、胞 EGFR 表达的方法， 是通过 Notchl siRNA 干扰胰腺癌 细胞后， EGFR 明显下降。并经过 ChIP-seq 发现 Notch 和 CSL 共同结合在 EGFR 的启动子上。这说 明 Notch 通路通过 CSL 来调节胰腺癌细胞中 EGFR 表达， 进而抑制肿瘤生长。 该方法首次在胰腺癌细 胞中明确了Notch 通路和 EGFR 表达的关系。 可为 肿瘤的靶向治疗提供重要的靶点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 C。
3、N 103992987 A CN 103992987 A 1/1 页 2 1. 一个通过 Notch 通路调节胰腺癌细胞 EGFR 表达的方法， 其特征在于使用 Notchl siRNA 干扰作用胰腺癌细胞后， EGFR 表达明显下降。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于使用的是Notchl siRNA来干扰胰腺癌 细胞。 3. 根据权利要求 2 所述的检测方法。 权 利 要 求 书 CN 103992987 A 2 1/3 页 3 一种通过 Notch 通路调节胰腺癌细胞 EGFR 表达的方法 技术领域 0001 本发明涉及通过Notch通路调节胰腺癌细胞EGFR表达的方法， 属。
4、于肿瘤分子生物 学领域。 背景技术 0002 表皮生长因子受体 (epithelial growth factor receptor， EGFR) 可启动细胞核内 的有关基因， 从而促进细胞分裂增殖。目前已经发现在胃癌、 乳腺癌、 膀胱癌和头颈部鳞癌 中， EGFR 表达增高， 说明表皮生长因子受体是在许多肿瘤的发生发展中起关键作用。 0003 Notch 信号通路是一个高度进化并且保守的通路， 介导细胞和细胞之间的相互作 用。当相邻的细胞配体与受体相互作用时， 会导致 Notch 蛋白连续裂解， 释放出受体的胞 内段 (NICD)。NICD 转入细胞核内， 并在细胞核中与 DNA 结合蛋白 。
5、CSL(CBFi RBP-J， Suppressor of Hairless， Lag-1 的首字母缩写 ) 结合， 启动目标基因的转录。我们的研究 证明 EGFR 的表达受 Notch-1 的调控， 通过调控 Notch-1 可以降低 EGFR 的表达。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是为控制肿瘤细胞的增殖与生长， 如何阻断 EGFR 所介 导的信号通路。 0005 本发明的技术解决方案为使用Notch1siRNA来干扰胰腺癌细胞后， 可使EGFR表达 明显下降。 0006 本方法具有如下的优点和效果 ： 0007 1. 本方法可使 EGFR 表达明显下降。 0008 2. 本方。
6、法， 具有稳定性好， 作用明显的特点。 附图说明 0009 图1ChIP样品验证的PCR电泳结果(M ： 100bp DNA Marker ； 1 ： 用RNA pol II抗体做 的阳性对照组 ； 2 ： Flag抗体沉淀Notch1的样品组 ； 3 ： Flag抗体沉淀CSL的样品组 ； 4 ： 非特 异性 IgG 抗体做的阴性对照组 ) ； 0010 图 2 测序片段中 CSL 结合位点示意图 ( 在我们所测序片段之中比对 CSL 结合位点 后， 我们发现了有两处是和 CSL 结合位点序列一致的 )。 具体实施方式 0011 1. 合成干扰片段 0012 合成特异性针对 Notch1 基。
7、因 mRNA 的 siRNA 和阴性对照 siRNA。 0013 2. 转染 0014 在含有 10的胎牛血清的 1640 培养基中培养 BxPC3 细胞， 在细胞培养箱中于 37、 50mL L C02 饱和湿度下培养， 试验组转染第一步中所获得重组表达载体质粒， 对 说 明 书 CN 103992987 A 3 2/3 页 4 照组转染 pcDNA3 空质粒。细胞提前 24 小时传代， 六孔板中融合度至 80左右后， 即按照 LipofectamineTM2000 说明书进行阴性对照 siRNA 序列和 Notch1 siRNA 的转染。 0015 3.WESTERN BLOT 检测 00。
8、16 在上述胰腺癌细胞中加入 RIPA 蛋白裂解液裂解细胞后， 我们按照试剂盒要求提 取总蛋白， 制作聚丙烯酰胺浓缩胶和分离胶， 取不同组别的等量蛋白样品进行电泳， 然后依 次进行转膜、 封闭、 一抗、 二抗孵育和洗涤 ( 其中一抗稀释浓度为 ： 1 500 ； 二抗稀释浓度 为 ： 1 3000)。最后， 显色曝光并通过 x 线胶片曝光洗片， 经自动电泳凝胶分析系统扫描井 测定各组蛋白条带的灰度值进行比较， EGFR 表达下降。 0017 4. 染色质免疫沉淀实验 0018 (1) 所培养 BxPC3 细胞的汇合度为 80时 ( 每盘约 1107个， 用 RPMI1640 培养 基 )， 开。
9、始准备实验。 0019 (2)用Roche公司的转染试剂将5种质粒分别转染进BxPC3细胞中， 每种质粒至少 转染 2 盘细胞， 37 度恒温箱培养 48h 后收获细胞。 0020 (3) 在试验开始前一天将蛋白 G 琼脂糖球珠的封闭处理 ： 取 300L 溶胀好的蛋白 G 琼脂糖球珠， 短暂离心后弃上清， 加入 1mL 双蒸水， 在混匀器上 4旋转 3min 洗去残留的 盐和乙醇， 重复洗 3 次。加入双蒸水 900L、 10mg mL BSA100L， 在混匀器上 4旋转孵 育过夜， 备用。 0021 (4) 向培养基中加入 4甲醛溶液， 使其终浓度为 1， 混匀后在室温下静置交联 10 。
10、分钟。再加入 1.25M 甘氨酸， 使其终浓度为 0.125M， 混匀后在室温下静置 5 分钟终止交 联反应。倒掉反应液， 将培养皿至于冰上。 0022 (5) 用 适 量 4 1PBS 将 每 盘 细 胞 洗 2 次，吸 干 洗 液。 之 后 每 盘 加 1.2mL41PBS， 用细胞刮刮下细胞， 移至1.5mL EP管中。 45000rpm离心5min， 弃上清， 得到细胞沉淀。 0023 (6) 在 每 管 细 胞 沉 淀 中 加 入 300L4 Lysis buffer、终 浓 度 为 1 的 25cocktail 和终浓度为 1mM 的 PMSF， 吹打重悬混匀， 涡旋振荡 3-5 。
11、次， 在冰上静置裂解 10min。之后 4 8000rpm 离心 5min， 弃上清， 得到细胞核沉淀。 0024 (7) 在每管细胞核沉淀中加入 300L4细胞核裂解液、 终浓度为 1 的 25cocktaiL 和终浓度为 1mM 的 PMSF， 吹打重悬混匀， 涡旋振荡 3-5 次， 在冰上静置裂解 10min。 0025 (8) 冰上超声 3 次， 超声强度 50， 每次 5s， 每次间隔 1min。之后 4 12000rpm 离心 10min， 取上清。 0026 (9) 每管取少量等体积上清， 合并于 1 管中作为 Input 样品， 总体积 50L 即可。 再加入 50L 双 蒸水。
12、， 终浓度为 0.2M 的 NaCL 和 2L RNase A， 混匀后 37孵育 30min。之 后加入 2L 蛋白酶 K， 65解交联过夜。酚氯仿抽提， 1琼脂糖凝胶电泳鉴定超声片段 大小， 以 200-500bp 为宜。 0027 (10)于每管超声上清液中加入等体积封闭好的均质蛋白G琼脂糖球珠悬液(总用 量500L)， 终浓度为1的25cocktail， 在混匀器上4旋转孵育2小时进行预清洗， 以 除去体系中的非特异免疫球蛋白。之后 4 5000rpm 离心 2min， 收集上清。 0028 (11) 每管加入终浓度为 1 的 25cocktail， 再于其中一管中加入 2g Norm。
13、al 说 明 书 CN 103992987 A 4 3/3 页 5 Rabbit IgG 非特异性抗体作为阴性对照， 其他每管中各加入 2g Notchl 抗体， 在混匀器上 4旋转孵育过夜。 0029 (12) 将余下的另一半蛋白 G 琼脂糖球珠悬液混匀后等量加入各管中， 再加入终浓 度为1的25cocktail， 在混匀器上4旋转孵育2小时进行免疫沉淀。 之后45000rpm 离心 2min， 弃上清， 得到结合有 DNA- 转录因子 - 转录因子抗体复合物的蛋白 G 琼脂糖球珠 沉淀。 0030 (13) 于 4环境下， 在混匀器上将蛋白 G 琼脂糖球珠沉淀分别用 1mL 低盐缓冲 液、。
14、 高盐缓冲液和 LiCl 缓冲液各洗 1 次， 最后用 TE(pH 8.0) 缓冲液洗两次， 每次 5min， 4 5000rpm 离心 2min， 弃上清。 0031 (14)配好洗脱液。 在每管蛋白G琼脂糖球珠沉淀中加入300L洗脱液重悬， 在加 热混匀器上 65、 1200rpm 振荡 30min 进行洗脱。之后常温 5000rpm 离心 2min， 收集上清。 在每管上清中加入终浓度为0.2M的NaCL和2L蛋白酶K， 65解交联过夜， 苯酚氯仿抽 提， 得到纯化的目的 DNA。 0032 0033 6. 在 ILLUMINA HIseq2000 上进行高通量测序。 0034 7. 所得数据通过自编软件进行分析后， 我们发现有部分片段落在人 7 号染色体上 有 EGFR 的启动子区域。再进过与 CSL 结合位点 (TGGGAAA， TTTCCCA) 的比对， 结合位点均 在我们所测序片段之中 ( 见图 2)。这说明 Notch 和 CSL 的复合物结合特异性在 egfr 基因 (chr7 55054219-55192138) 前的启动子区域中， 调控 EGFR 的表达。 说 明 书 CN 103992987 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103992987 A 6 。