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1、(10)申请公布号 CN 104031121 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104031121 A (21)申请号 201410276114.9 (22)申请日 2014.06.19 C07K 7/08(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/26(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 周礼红 地址 550000 贵州省贵阳市南明区贵工路上 寨 6 号 (72)发明人 周礼红 高燕燕 丁旭 (。
2、74)专利代理机构 北京超凡志成知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11371 代理人 吴开磊 (54) 发明名称 一种虫草抗菌肽及其制备方法 (57) 摘要 本发明涉及微生物领域， 具体而言， 涉及一种 虫草抗菌肽及其制备方法。 该一种虫草抗菌肽， 所 述虫草抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。 本发明提供的一种虫草抗菌肽， 其从蛹虫草菌株 中分离得到， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所示 ； 经过抗菌实验测定， 其对多种革兰氏阳性菌和革 兰氏阴性菌具有抑菌作用， 体现出了抑菌活性， 实 现了从蛹虫草中获取具有抑菌活性的抗菌肽的技 术效果， 进而可进行全面的推广应用。
3、。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104031121 A CN 104031121 A 1/1 页 2 1. 一种虫草抗菌肽， 其特征在于， 所述虫草抗菌肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。 2. 一种根据权利要求 1 所述的虫草抗菌肽的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 步骤 A ： 将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中， 培养至产生斜面 孢子 ； 利用无菌水将得到。
4、的所述斜面孢子洗下， 并转接到三角瓶中， 振荡培养， 得到孢子悬 液 ； 步骤 B ： 将所述孢子悬液转接到萨氏液体培养基中， 恒温振荡培养之后静置、 过滤， 得 到菌丝体 ； 步骤 C ： 将所述菌丝体烘干至粉末状后加入蒸馏水， 提取过夜后过滤， 得到滤液 ； 步骤 D ： 将所述滤液进行旋转蒸发浓缩， 并同时加入饱和硫酸铵溶液， 静置后离心， 得 到第一浓缩液， 在所述第一浓缩液中再次加入饱和硫酸铵溶液， 得到预定饱和度的第二浓 缩液， 将所述第二浓缩液离心， 得到沉淀样品， 在所述沉淀样品中加入蒸馏水进行溶解， 得 到样品溶解液 ； 将所述样品溶解液利用蒸馏水透析后冷冻干燥， 得到粗蛋白。
5、样品 ； 步骤E ： 将所述粗蛋白样品利用 CM-52 阳离子交换柱进行洗脱， 得到洗脱组份， 再将洗 脱组份透析后进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳， 得到 13KD 的蛋白质条带 ； 步骤 F: 切下所述蛋白质条带， 并进行液质联用质谱检测， 得到质谱数据， 并进行分析， 得到虫草抗菌肽及其序列。 3. 根据权利要求 2 所述的虫草抗菌肽的制备方法， 其特征在于， 在步骤 A 中 ： 所述萨氏 琼脂改良固体培养基， 按照重量份数计， 其有效组份包括 ： 麦芽糖 4-6 份、 蛋白胨 8-12 份、 酵母膏 4-6 份、 琼脂 18-22 份、 葡萄糖 18-22 份、 水 900-1100。
6、 份。 4. 根据权利要求 3 所述的虫草抗菌肽的制备方法， 其特征在于， 在步骤 A 中 ： 所述将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中， 培养至产生斜面孢子 具体包括 ： 将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中， 在251培养4-5天。 5. 根据权利要求 4 所述的虫草抗菌肽的制备方法， 其特征在于， 在步骤 B 中 ： 所述孢子悬液与所述萨氏液体培养基的体积比为 1:10 ； 所述恒温振荡培养的条件包括 ： 培养温度为 25-27， 培养时间为 4-5 天， 转速为 180-220r/min ； 所述静置的时间为 6-12 小时。 6. 根据权利要求 2-5 任。
7、一项所述的虫草抗菌肽的制备方法， 其特征在于， 在步骤 C 中， 具体包括 ： 称取干燥菌丝体粉末， 按质量比为 1:8-14 的比例加入蒸馏水， 并在 4提取过 夜， 过滤后， 得到所述滤液。 7. 根据权利要求 6 所述的虫草抗菌肽的制备方法， 其特征在于， 在步骤 D 中 ： 所述将所述第二浓缩液离心， 得到沉淀样品具体包括 ： 将所述第二浓缩液静置后在 8000r/min 的转速下离心 18-22 分钟， 除去上清液， 得到所述沉淀样品。 8. 根据权利要求 7 所述的虫草抗菌肽的制备方法， 其特征在于， 在步骤 E 中的所述 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳中 ： 浓缩胶的浓度为 10-。
8、16、 分离胶的浓度为 4-5、 染色液为考马斯亮蓝 R-250。 权 利 要 求 书 CN 104031121 A 2 1/7 页 3 一种虫草抗菌肽及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物领域， 具体而言， 涉及一种虫草抗菌肽及其制备方法。 背景技术 0002 抗菌肽是生物体免疫系统为抵御外源性病原微生物入侵而产生的一类多肽物质， 是先天免疫的重要组成成分。目前， 在抗菌肽数据库 (Antimicrobial Peptide Database， APD)中已经有2353条抗菌肽， 其中有215个细菌素， 305个植物抗菌肽， 12个真菌抗菌肽和 1773 个动物宿主防御肽。 00。
9、03 由于抗菌肽能够抑制革兰氏阳性和阴性细菌、 真菌、 病毒及寄生物等。此外， 抗菌 肽还对免疫系统具有调控作用。 相比传统抗生素抗菌肽具有抗菌谱广、 热稳定性好、 杀菌快 速、 作用专一、 多样化的应用潜力以及不易产生耐药性等优点。因此， 抗菌肽有望成为新型 的抗菌药物。 目前， 已有几种抗菌肽进入临床研究， 多种抗菌肽应用于食品保鲜以及饲料添 加剂。 0004 抗菌肽的分布极为广泛， 在病毒、 细菌到植物、 昆虫、 软体动物、 甲壳动物、 两栖动 物、 鱼类、 鸟类及哺乳动物等生物中均有发现。 具体的， 抗菌肽是由基因编码的一类多肽。 所 有抗菌肽均是由一段包含信号序列的前体翻译后修饰而来。
10、。在不同生物体内， 分泌抗菌肽 的部位不尽相同， 抗菌肽的氨基酸组成也相差甚远。 根据其氨基酸组成及结构特点， 一般将 抗菌肽分为以下五种类型 ： 线性阳离子 - 螺旋抗菌肽、 富含特殊氨基酸的阳离子抗菌肽、 含有二硫键的抗菌肽、 阴离子抗菌肽、 大型蛋白质的片段。 -螺旋型抗菌肽是其中一大类， 在自然界广泛存在， 它们与细菌细胞膜互作， 依静电引力靠近并结合在质膜表面， 随之疏水 结构域插入质膜中， 当抗菌肽达到一定浓度后， 通过分子聚集和膜内分子间相互位移破坏 细胞膜稳定性， 增加膜通透性， 形成离子通道， 引起去极化 ； 或形成较大通道， 使细胞内容物 外泄， 最终导致细胞死亡。 000。
11、5 蛹虫草是药食两用的新资源食品， 是唯一实现规模化人工种植的虫草真菌。研究 表明， 虫草多肽在毫克水平就能发挥作用， 安全评价药理和功能检测结果也证明虫草多肽 无毒、 无副作用、 营养价值和生物利用率均极高。因此， 以蛹虫草为研究材料， 制取虫草多 肽， 并进行应用是相关领域中的研究热点。 0006 在相关技术中， 通常利用碱性蛋白酶水解蛹虫草子座热水浸提虫草素后的剩余 物 ； 再通过电泳进行分离纯化， 获得分子量在 3180 5620 之间的多肽混合物。这些多肽混 合物虽具有一定的清除自由基、 抗脂质过氧化的能力 ； 但是， 均不能体现出抑菌活性。进而 严重了限制了其推广应用。 0007 。
12、综上， 以蛹虫草为了来源， 制取一种具有抑菌活性的虫草抗菌肽是本领域亟待解 决的一个技术问题。 发明内容 0008 本发明的目的在于提供一种虫草抗菌肽及其制备方法， 以解决上述的问题。 说 明 书 CN 104031121 A 3 2/7 页 4 0009 在本发明的实施例中提供了一种虫草抗菌肽， 其从蛹虫草菌株中分离得到， 其氨 基酸序列如 SEQ ID NO:1 所示 ； 经过抗菌实验测定， 其对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 具有抑菌作用， 体现出了抑菌活性， 实现了从蛹虫草中获取具有抑菌活性的抗菌肽的技术 效果， 进而可进行全面的推广应用。 0010 本发明的实施例中提供的这种虫草抗菌。
13、肽的制备方法具体包括以下步骤 ： 0011 步骤 A ： 将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中， 培养至产生 斜面孢子 ； 利用无菌水将得到的所述斜面孢子洗下， 并转接到三角瓶中， 振荡培养， 得到孢 子悬液 ； 0012 步骤 B ： 将所述孢子悬液转接到萨氏液体培养基中， 恒温振荡培养之后静置、 过 滤， 得到菌丝体 ； 0013 步骤 C ： 将所述菌丝体烘干至粉末状后加入蒸馏水， 提取过夜后过滤， 得到滤液 ； 0014 步骤 D ： 将所述滤液进行旋转蒸发浓缩， 并同时加入饱和硫酸铵溶液， 静置后离 心， 得到第一浓缩液， 在所述第一浓缩液中再次加入饱和硫酸铵溶液， 得。
14、到预定饱和度的第 二浓缩液， 将所述第二浓缩液离心， 得到沉淀样品， 在所述沉淀样品中加入蒸馏水进行溶 解， 得到样品溶解液 ； 将所述样品溶解液利用蒸馏水透析后冷冻干燥， 得到粗蛋白样品 ； 0015 步骤 E ： 将所述粗蛋白样品利用 CM-52 阳离子交换柱进行洗脱， 得到洗脱组份， 再 将洗脱组份透析后进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳， 得到 14KD 的蛋白质条带 ； 0016 步骤 F: 切下所述蛋白质条带， 并进行液质联用质谱检测， 得到质谱数据， 并进行 分析， 得到虫草抗菌肽及其序列。 0017 通过发明实施例提供的这种制备方法可实现以蛹虫草菌株为来源， 获得具有抑菌 活性。
15、的虫草抗菌肽。 0018 可选的， 在步骤 A 中 ： 所述萨氏琼脂改良固体培养基， 按照重量份数计， 其有效组 份包括 ： 0019 麦芽糖 4-6 份、 蛋白胨 8-12 份、 酵母膏 4-6 份、 琼脂 18-22 份、 葡萄糖 18-22 份、 水 900-1100 份。 0020 可选的， 在步骤 A 中 ： 0021 所述将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中， 培养至产生斜面 孢子具体包括 ： 0022 将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中， 在 25 1培养 4-5 天。 0023 可选的， 在步骤 B 中 ： 0024 所述孢子悬液与所述萨氏液体培养。
16、基的体积比为 1:10 ； 0025 所述恒温振荡培养的条件为 ： 培养温度为 25-27， 培养时间为 4-5 天， 转速为 180-220r/min ； 0026 所述静置的时间为 6-12 小时。 0027 可选的， 在步骤 C 中， 具体包括 ： 称取干燥菌丝体粉末， 按质量比为 1:8-14 的比例 加入蒸馏水， 并在 4提取过夜， 过滤后， 得到所述滤液。 0028 可选的， 在步骤 D 中 ： 0029 所述将所述第二浓缩液离心， 得到沉淀样品具体包括 ： 将所述第二浓缩液静置后 说 明 书 CN 104031121 A 4 3/7 页 5 在 8000r/min 的转速下离心 。
17、18-22 分钟， 除去上清液， 得到所述沉淀样品。 0030 可选的， 在步骤 E 中的所述 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳中 ： 0031 浓缩胶的浓度为 10-16、 分离胶的浓度为 4-5、 染色液为考马斯亮蓝 R-250。 附图说明 0032 图 1 示出了本发明实施例一提供的制备方法的流程图 ； 0033 图 2 示出了本发明实施例二提供的制备方法中获得的虫草多肽的质谱数据图。 具体实施方式 0034 在本发明中， 虫草抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示， 具体的， 其氨基酸序列 为 -M-A-I-T-A-A-K-V-L-E-T-R- ； 其命名为 cordyampin-。
18、2。分子式为 C56H102N16O17S1， 分子量 为 1303.59， 为 a- 螺旋结构， 疏水率 30， 静电荷为 +1， 90时稳定。 0035 下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明提供的这种虫草抗菌肽的制备方 法做进一步的详细描述。 0036 实施例一 0037 在本发明的实施例中提供了一种虫草抗菌肽的制备方法， 包括以下步骤， 请参考 图 1 ： 0038 步骤 101 ： 将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中， 培养至产 生斜面孢子 ； 利用无菌水将得到的所述斜面孢子洗下， 并转接到三角瓶中， 振荡培养， 得到 孢子悬液 ； 0039 在步骤 101 中， 。
19、通过萨氏琼脂改良固体培养基的培养， 蛹虫草菌株斜面菌种会生 长至产生大量的斜面孢子， 然后再利用无菌水即可将斜面孢子洗下， 在进行振荡培养， 即可 得到孢子悬液， 备用。 0040 步骤 102 ： 将所述孢子悬液转接到萨氏液体培养基中， 恒温振荡培养之后静置、 过 滤， 得到菌丝体 ； 0041 得到的孢子悬液通过萨氏液体培养基培养之后， 再进行振荡培养后过滤 ( 去除滤 液 )， 即可得到蛹虫草菌种菌丝体， 备用。 0042 步骤 103 ： 将所述菌丝体烘干至粉末状后加入蒸馏水， 提取过夜后过滤， 得到滤 液。 0043 得到的菌丝体通过烘干之后， 需用蒸馏水对其进行溶解 ( 在 4过夜。
20、提取 )， 过滤 取滤液， 再进行旋转蒸发浓缩。 0044 步骤 104 ： 将所述滤液进行旋转蒸发浓缩， 并同时加入饱和硫酸铵溶液， 静置后离 心， 得到第一浓缩液， 在所述第一浓缩液中再次加入饱和硫酸铵溶液， 得到预定饱和度的第 二浓缩液， 将所述第二浓缩液离心， 得到沉淀样品， 在所述沉淀样品中加入蒸馏水进行溶 解， 得到样品溶解液 ； 将所述样品溶解液利用蒸馏水透析后冷冻干燥， 得到粗蛋白样品。 0045 步骤 104 为通过旋转蒸发浓缩将菌丝体制备成粗蛋白样品的操作， 具体的， 在加 入饱和硫酸铵溶液的过程中， 需要缓慢加入， 且第一浓缩液具体为浓缩汁饱和度为 35的 液体 ； 第二。
21、浓缩液为浓缩至饱和度为 70的液体。在得到第一浓缩液的过程中， 加入了饱 和硫酸铵溶液的滤液需静置6-8小时， 然后再在8000r/min离心20min， 取上清弃沉淀， 获得 说 明 书 CN 104031121 A 5 4/7 页 6 第一浓缩液。根据上清体积 ( 第一浓缩液 ) 再次加入饱和硫酸铵溶液至 70饱和度， 充分 搅拌后， 4冰箱静置过夜， 再次离心 (8000r/min 离心 20min) 取沉淀， 此为 35-70饱和度 的硫酸铵沉淀样品。 0046 步骤 105 ： 将所述粗蛋白样品利用 CM-52 阳离子交换柱进行洗脱， 得到洗脱组份， 再将洗脱组份透析后进行 SDS-。
22、 聚丙烯酰胺凝胶电泳， 得到 14KD 的蛋白质条带。 0047 粗蛋白样品再溶 (20mmol/L pH6.0PBS 缓冲液 ) 后利用 CM-52 阳离子交换柱进行 洗脱， 得到洗脱组份 ； 洗脱组份经过透析 ( 具体为水透析 )、 冻干 ( 至粉末状 ) 后， 再进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( 浓缩胶浓度为 4， 分离胶浓度为 15， 上样量 25 微升 )， 得到 14KD 的蛋白质条带。 0048 步骤 106 ： 切下所述蛋白质条带， 并进行液质联用质谱检测， 得到质谱数据， 并进 行分析， 得到虫草抗菌肽及其序列。 0049 具体的， 在步骤 106 中， 肽段检测的操作。
23、可以利用液质联用质谱 (tandem high performance liquid chromatography with mass spectrometry,LC-MS/MS) 检测， 获得的质 谱数据利用 Data Analysis 软件标峰后， 进行分析， 即可获得知晓其序列的虫草抗菌肽。 0050 接下来， 为了使得本发明实施例一的制备方法得到更好的应用， 本发明还在上述 实施例一的基础之上提供了实施例二， 实施例二是实施例一的虫草抗菌肽的进一步限定和 增加， 现做详细的阐述和解释， 请参考图 1- 图 2 ： 0051 实施例二 0052 本实施例的虫草抗菌肽包括以下步骤 ： 00。
24、53 1、 将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中， 培养至产生斜面 孢子 ； 利用无菌水将得到的所述斜面孢子洗下， 并转接到三角瓶中， 振荡培养， 得到孢子悬 液 ； 0054 具体的， 在该步骤中， 所述萨氏琼脂改良固体培养基， 按照重量份数计， 其有效组 份包括 ： 麦芽糖 4-6 份、 蛋白胨 8-12 份、 酵母膏 4-6 份、 琼脂 18-22 份、 葡萄糖 18-22 份、 水 900-1100份 ； 更具体的， 麦芽糖5g、 蛋白胨10g、 酵母膏5g、 琼脂20g、 葡萄糖20g、 水1000ml， pH 自然， 121， 灭菌 20min。 0055 在所述将蛹。
25、虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中， 培养至产 生斜面孢子具体包括 ： 将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中， 在 25 1培养 4-5 天。 0056 2、 将所述孢子悬液转接到萨氏液体培养基中， 恒温振荡培养之后静置、 过滤， 得到 菌丝体。 0057 具体的， 步骤 2 按照以下具体步骤操作 ： 按照 10 (v/v) 将孢子悬液接种于装有 250ml萨氏液体培养基的500ml三角瓶中， 26， 200r/min， 恒温振荡培养4d， 然后静置培养 6-12d。过滤得蛹虫草菌株 Cmamp-1 菌丝体。 0058 3、 将所述菌丝体烘干至粉末状后加入蒸馏水， 提。
26、取过夜后过滤， 得到滤液。 0059 具体的， 上述步骤具体按照以下操作进行 ： 将菌丝体在 40 -60烘干得到蛹虫 草菌株 Cmamp-1 干菌丝体， 然后再称取干燥菌丝体粉末， 按质量比为 1:8-14 的比例加入蒸 馏水， 并在 4提取过夜， 过滤后， 得到滤液。 0060 4、 所述滤液进行旋转蒸发浓缩， 并同时加入饱和硫酸铵溶液， 静置后离心， 得到第 说 明 书 CN 104031121 A 6 5/7 页 7 一浓缩液， 在所述第一浓缩液中再次加入饱和硫酸铵溶液， 得到预定饱和度的第二浓缩液， 将所述第二浓缩液离心， 得到沉淀样品， 在所述沉淀样品中加入蒸馏水进行溶解， 得到样。
27、品 溶解液 ； 将所述样品溶解液利用蒸馏水透析后冷冻干燥， 得到粗蛋白样品。 0061 具体的， 上述步骤按照以下操作进行 ： 将滤液进行旋转蒸发浓缩， 根据浓缩液体积 缓慢加入饱和硫酸铵溶液至35饱和度， 4冰箱静置6-8h， 8000r/min离心18-22分钟， 取 上清弃沉淀。根据上清体积再次加入饱和硫酸铵溶液至 70饱和度， 充分搅拌后， 4冰箱 静置过夜， 再如前法离心(8000r/min离心18-22分钟)取沉淀， 此为35-70饱和度的硫酸 铵沉淀样品。加入适量蒸馏水将沉淀重新溶解， 装入已预处理的透析袋内， 用蒸馏水 4透 析， 透析过夜彻底除去硫酸铵离子， 冷冻干燥得到粗蛋。
28、白样品。 0062 5、 将所述粗蛋白样品利用 CM-52 阳离子交换柱进行洗脱， 得到洗脱组份， 再将洗 脱组份透析后进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳， 得到 14KD 的蛋白质条带。 0063 具体的， 在改步骤中， 具体按照以下操作进行洗脱 ： 冻干的粗蛋白样品用 20mmol/ L pH6.0PBS 缓冲液溶解， 上样预先用 20mmol/L pH6.0PBS 缓冲液平衡好的 CM-52 阳离子 交换柱， 流动相是 20mmol/LPBS 缓冲液， pH6.0， 并加入 NaCl 至浓度梯度为 0.1、 0.3、 0.6、 0.9mol/L， 流速 15ml/h， 收集组分。操作前将。
29、流动相和样品溶液过滤 (0.22um)。组分检测 波长 280nm， 室温进行。从柱子上洗脱得到 Cm-01 蛋白质组分 ( 即洗脱组份 )。将 Cm-01 蛋 白质组分转入透析袋用水透析 12h， 取出冻干得到 Cm-01 蛋白质组分冻干样品。 0064 对Cm-01蛋白质组分冻干样品的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作条件具体为 ： 将 Cm-01 蛋白质组分冻干样品进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( 浓缩胶浓度为 4-5， 分离胶 浓度为10-16， 上样量25uL ； 电泳条件为浓缩胶70V下电泳40min， 分离胶电泳4-5h， 用考 马斯亮蓝 R-250 染色， 甲醇 - 乙酸为。
30、脱色液 )， 得到约 14KD 的蛋白质条带 ； 通过上述的洗脱 以及电泳操作， 即可获得 14KD 的蛋白质条带 ( 即虫草抗菌肽 )。 0065 6、 切下所述蛋白质条带， 并进行液质联用质谱检测， 得到质谱数据， 并进行分析， 得到虫草抗菌肽及其序列。 0066 具 体 的， 在 该 步 骤 中， 切 下 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 14KD 的 蛋 白 质 胶 条，用 液 质 联 用 质 谱 (tandem high performance liquid chromatography with mass spectrometry,LC-MS/MS) 检测。检测条件如下。
31、 ： 0067 1、 还原烷基化蛋白质消化操作流程 0068 a. 将胶点样品加 50L DD.H2O 洗两次， 10min/ 次 ； 0069 b. 加 50mM NH4HCO3/ 乙腈 1 ： 1 溶液 ( 考染脱色液 )50L， 超声脱色 5min 或 37 脱色 20min， 吸干 ； 0070 c. 重复步骤 2， 直至蓝色褪去 ； 0071 d. 加乙腈 50L 脱水至胶粒完全变白， 真空抽干 10min ； 0072 e. 加 10mM DTT(10L1M DTT， 990L25mM NH4HCO3配制 )20L， 56水浴 1h ； 0073 f. 冷却到室温后， 吸干， 快速。
32、加 55mM IAM(55L1M IAM， 945L25mM NH4HCO3配 制 )20L， 置于暗室 45min ； 0074 g. 依次用 25mM NH4HCO3(2X10 分钟 )、 25mM NH4HCO3+50乙腈溶液 (2X10 分钟 ) 和 乙腈洗 (10 分钟 )， 乙腈脱水到胶粒完全变白为止， 真空抽干 10min ； 0075 h. 将 0.1g/L 的酶储液以 25mM NH4HCO3稀释 10 20 倍， 每 EP 管加 2 3L， 说 明 书 CN 104031121 A 7 6/7 页 8 稍微离心一下， 让酶液充分与胶粒接触， 4或冰上放置 30min， 待溶。
33、液被胶块完全吸收， 加 25mM NH4HCO3至总体积 10-15L 置 37， 消化过夜 ； 0076 i. 加入 1 TFA 终止反应， 使 TFA 终浓度为 0.1， 振荡混匀， 离心， 上清液为进样 样品。 0077 2、 LC-MS/MS 鉴定 0078 取 10ul 进样样品上机进行 LC-MS/MS 检测， 具体仪器型号和参数如下 ： 0079 液相 ： prominence nano2D(shimazhu) 0080 柱料 ： C18， 5um， 150A(Eprogen) 0081 流速 ： 400nl/min 0082 液相梯度 ： 0083 0084 A 液 ： 100。
34、 H2O， 0.1 FA ； B 液 ： 100 ACN， 0.1 FA ； 0085 质谱仪器 ： MicrOTOF-QII(BrukerDaltonics) ； 0086 数据采集软件 ： BrukerDaltonicsmicrOTOFcontrol ； 0087 MS/MS 扫描范围 ： 50-2200m/z ； 0088 碰撞气体 ： 氩气 ； 0089 毛细管电压 ： 1500V ； 0090 干燥气体温度 ： 150。 0091 通过上述的检测和数据分析， 即可得知所获取的虫草抗菌肽的氨基酸序列及其理 化性质。 0092 本发明还提供了一种合成该虫草抗菌肽的方法， 具体包括以下步骤。
35、 ： 0093 1、 接肽前树脂处理 ： 0094 称取 100 毫克 FMOC-Arg(PBF)-2CL-TRT-resin 到砂芯过滤反应器中 ； 0095 在过滤反应器中加入二氯甲烷浸泡洗涤6次， 每次5毫升， 过滤除去洗涤的二氯 甲烷 ； 0096 DMF 洗涤 5 次即可放入仪器反应器中进行接肽反应。 0097 接肽在431A自动合成仪上进行， 称取FMOC-Arg(PBF)-2CL-TRT-resin到放入反应 说 明 书 CN 104031121 A 8 7/7 页 9 器中， 然在合成仪中依次加入按照多肽的序列顺序从C端逐渐加入Fmoc-氨基酸， 同时要加 入相同摩尔的 PYB。
36、OP 试剂和 HOBT 试剂， 每一个氨基酸反应周期时间为 40 分钟， 合成多肽 c ordyampin-2-M-A-I-T-A-A-K-V-L-E-T-R-。 0098 2、 肽链的纯化 0099 先采 Waters600E 纯化系统确定目标肽 -M-A-I-T-A-A-K-V-L-E-T-R-， 再使用 C18 反相柱子， 条件为 ： A 相为 95的水 ( 甲醇配比 )， B 相为 95的甲醇 ( 甲醇配比 )， 然后各 加 0.1的 TFA， 检测波长 ： 220nm， 流速 :1mL/min。 0100 在上样品之前先用A相平衡柱子15分钟， 然后上样， 从A到B溶液梯度洗脱25m。
37、in， 收集多肽 cordyampin-2 洗脱峰， 质谱鉴定纯度为 95将收集的 cordyampin-2 多肽液经冷 冻干燥获得多肽 cordyampin-2 冻干粉。 0101 通过本发明实施例二的方法获得的虫草抗菌肽具体的抑菌实验例如下所述 ： 0102 分别将枯草芽孢杆菌、 大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌菌液 ( 浓度 108CFU/ml)100ul 涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板， 冰箱静置 30min 后， 将无菌牛津杯置于带菌的平板上， 每 个牛津杯加 100ul 不同浓度的多肽 cordyampin-2 水溶液 ( 虫草抗菌肽 )， 37 0.5 培养 48h。结果发现 ： 多肽 。
38、cordyampin-2 浓度在 16ug/ml 的生长枯草芽孢杆菌平板 上有抑菌圈， 多肽 cordyampin-2 浓度在 8ug/ml 的大肠杆菌生长平板上有抑菌圈， 多 肽 cordyampin-2 浓度在 16ug/ml 的金黄色葡萄球菌生长平板上有抑菌圈。表明多肽 cordyampin-2 对枯草芽孢杆菌、 大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌有抑制作用。 0103 通过测定发现 ： cordyampin-2 水溶液 ( 虫草抗菌肽 ) 对枯草芽孢杆菌、 大肠杆 菌、 金黄色葡萄球菌的 MIC 浓度分别为 16ug/ml、 8ug/ml、 16ug/ml ； 同样， 通过测定发现， cord。
39、yampin-2 水溶液 ( 虫草抗菌肽 ) 对乳腺癌细胞有抑制作用， 最小抑制浓度为 5umol/ L ； 另外， 通过抑菌试验测定， 其对芽孢杆菌胞菌、 肺炎双球菌、 奇异变形杆菌、 肺炎克雷白杆 菌、 流感嗜血杆菌以及 溶血性链球菌均具有抑制效果， 其 MIC 浓度分别为 8ug/mL、 32ug/ mL、 16ug/mL、 32ug/mL 和 32ug/mL。 0104 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技 术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修 改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 104031121 A 9 1/1 页 10 0001 序 列 表 CN 104031121 A 10 1/2 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 104031121 A 11 2/2 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 104031121 A 12 。