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1、(10)申请公布号 CN 104027797 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104027797 A (21)申请号 201410276097.9 (22)申请日 2014.06.19 A61K 39/05(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C07K 14/34(2006.01) C07K 1/34(2006.01) A61P 31/04(2006.01) C12R 1/15(2006.01) (71)申请人 山东亦度生物技术有限公司 地址 257061 山东省东营市东营区黄河路 38 号生态谷 22 楼 1-3 层 (72)发明人 耿星涛 樊可 陶。
2、亮 马世勇 许小媛 贾福利 刘彪 贾涛 (74)专利代理机构 北京联瑞联丰知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11411 代理人 郑自群 (54) 发明名称 一种白喉疫苗的制备方法 (57) 摘要 本发明提出了一种白喉疫苗的制备方法， 解 决了现有技术中白喉疫苗生产周期过长， 生产过 程中产生硫酸铵污染， 终产品杂蛋白过多， 产品副 反应过大的问题， 一种白喉疫苗的制备方法， 其特 征在于， 包括以下步骤 ： 1) 白喉杆菌菌种复苏、 发 酵培养， 制备白喉菌液 ； 2) 将所述白喉菌液离心， 三次过滤处理， 然后进行超滤浓缩、 透析洗换， 从 而得到白喉毒素 ； 3) 对所述白喉毒素脱毒。
3、， 然后 用切向流超滤系统进行超滤浓缩、 透析洗换 ； 4) 对脱毒的白喉毒素进行纯化。 高速离心去除菌体， 超滤浓缩、 洗换替代活性炭吸附和硫酸铵盐析， 且 整个实验步骤只需短短一天， 简化了工艺步骤， 缩 短了生产周期， 提高了生产效率， 增加操作步骤的 可控性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104027797 A CN 104027797 A 1/1 页 2 1. 一种白喉疫苗的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ：。
4、 1) 白喉杆菌菌种复苏、 发酵培养， 制备白喉菌液 ； 2) 将所述白喉菌液离心， 三次过滤处理， 然后进行超滤浓缩、 透析洗换， 从而得到白喉 毒素 ； 3) 对所述白喉毒素脱毒， 然后用切向流超滤系统进行超滤浓缩、 透析洗换 ； 4) 对脱毒的白喉毒素进行纯化。 2. 如权利要求 1 所述的一种白喉疫苗的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤2)的具体方法 ： 将离心除菌后的白喉菌液经0.22m0.1m滤膜过滤， 然 后经 300KD 中空纤维柱过滤， 再用 10KD 的中空纤维柱进行超滤浓缩， 当超滤剩余体积为原 体积的 1/5 时， 进行透析洗换， 洗换液为 0.9 NaCl 溶液， 。
5、洗换 3 5 个体积。 3. 如权利要求 1 所述的一种白喉疫苗的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤3)中脱毒是在保持pH值为7.47.6， 添加80150mM赖氨酸， 0.40.6 甲醛， 置 35 37下进行， 且脱毒时间为 25 45 天， 透析洗换是用 0.9 NaCl 溶液洗滤 3 5 个体积。 4. 如权利要求 1 所述的一种白喉疫苗的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 3) 中切向流超滤系统是使用截留分子量为 10KD 的 Quixstand 中空纤维柱进 行超滤。 5. 如权利要求 1 所述的一种白喉疫苗的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 4) 中纯化方法为分子筛层析法。
6、， 其中分子筛填料为 Sephacryl S-300HR。 6. 如权利要求 1 所述的一种白喉疫苗的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 1) 中发酵培养采用合成培养基， 所述合成培养基包括 ： 20g/L 酸水解酪蛋白、 5g/L 蛋白胨、 2.5g/L 麦芽糖、 2.5ml/L 乳酸， 1ml/L Mueller 氏 I 号液、 2ml/L Mueller 氏 II 号液、 浓度低于 0.10mg/ml 的铁离子。 权 利 要 求 书 CN 104027797 A 2 1/5 页 3 一种白喉疫苗的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及疫苗领域， 特别是指一种白喉疫苗的制备方法。 背景。
7、技术 0002 白喉疫苗由白喉杆菌菌种制成， 白喉杆菌菌体分泌出来的毒素是单一的多肽链， 不含糖基和辅基， 蛋白质由 560 个氨基酸组成， 分子量为 62kDa， 是一种酶原， 只有在蛋白酶 的作用下， 将其切成缺口毒素， 才具有生物活性。白喉类毒素包括 A、 B 两个片段， 其中 B 片 段是手提结合和穿膜片段， A 片段是毒性片段， 通过阻抑蛋白合成中的酶活性， 最终引起细 胞死亡， 它对远端组织和器官也可产生毒性， 尤其是心脏及外周和中枢神经系统。 0003 我国目前的白喉疫苗简要生产过程为 ： 菌种复苏传代， 扩增至一定量， 上发酵罐发 酵培养， 所采用的产毒培养基为 Pope 及 。
8、Ling-good 培养基， Pope 及 Ling-good 培养基均是 以蛋白酶 ( 胰酶 ) 消化牛肉液， 加入生长因子制成。该培养基营养丰富， 用于白喉杆菌培 养都能达到较高的产毒水平。但缺点是胰酶消化牛肉蛋白的工艺复杂难以控制， 且不适于 大批量的生产， 消化的牛肉蛋白各批之间差异较大， 质量难于控制， 不利于后处理工艺的优 化。然后将发酵罐的培养物经甲苯处理过后， 收集于一个大容器， 加入活性炭、 硫酸铵进行 脱色， 过滤收集上清液， 此实验过程需 1 到 2 天， 添加硫酸铵二次盐析 3 4 天， 透析去除铵 离子又耗费37天， 然后用甲醛脱毒3042天， 透析去除甲醛37天， 。
9、传统工艺用硫酸 铵盐析沉淀蛋白的实验步骤较多， 操作繁琐， 后处理难度较大， 且生产过程中会产生大量的 硫酸铵废液， 活性炭在后处理过程中有一定的残留。经硫酸铵沉淀获得的白喉毒素含有较 多杂蛋白， 纯度较差， 导致终产品的副作用较大， 最主要的是生产一批白喉疫苗周期过长。 发明内容 0004 本发明提出一种白喉疫苗的制备方法， 解决了现有技术中白喉疫苗生产周期过 长， 生产过程中产生硫酸铵污染， 终产品杂蛋白过多， 产品副反应过大的问题。 0005 本发明的技术方案是这样实现的 ： 一种白喉疫苗的制备方法， 其特征在于， 包括以 下步骤 ： 0006 1) 白喉杆菌菌种复苏、 发酵培养， 制备。
10、白喉菌液 ； 0007 2) 将所述白喉菌液离心， 三次过滤处理， 然后进行超滤浓缩、 透析洗换， 从而得到 白喉毒素 ； 0008 3) 对所述白喉毒素脱毒， 然后用切向流超滤系统进行超滤浓缩、 透析洗换 ； 0009 4) 对脱毒的白喉毒素进行纯化。 0010 作为优选的技术方案， 所述步骤 2) 的具体方法 ： 将离心除菌后的白喉菌液经 0.22m 0.1m 滤膜过滤， 然后经 300KD 中空纤维柱过滤， 再用 10KD 的中空纤维柱进行 超滤浓缩， 当超滤剩余体积为原体积的1/5时， 进行透析洗换， 洗换液为0.9NaCl溶液， 洗 换 3 5 个体积。 0011 作为优选的技术方案。
11、， 所述步骤3)中脱毒是在保持pH值为7.47.6， 添加80 说 明 书 CN 104027797 A 3 2/5 页 4 150mM 赖氨酸， 0.4 0.6甲醛， 置 35 37下进行， 且脱毒时间为 25 45 天， 透析洗换 是用 0.9 NaCl 溶液洗滤 3 5 个体积。 0012 作为优选的技术方案， 所述步骤 3) 中切向流超滤系统是使用截留分子量为 10KD 的 Quixstand 中空纤维柱进行超滤。 0013 作为优选的技术方案， 所述步骤 4) 中纯化方法为分子筛层析法， 其中分子筛填料 为 Sephacryl S-300HR。 0014 作为优选的技术方案， 所述步。
12、骤 1) 中发酵培养采用合成培养基， 所述合成培养基 包括 ： 20g/L 酸水解酪蛋白、 5g/L 蛋白胨、 2.5g/L 麦芽糖、 2.5ml/L 乳酸， 1ml/L Mueller 氏 I 号液、 2ml/L Mueller 氏 II 号液、 浓度低于 0.10mg/ml 的铁离子。 0015 高速离心去除菌体， 超滤浓缩、 洗换替代活性炭吸附和硫酸铵盐析， 且整个实验步 骤只需短短一天， 缩短了生产周期， 提高生产效率， 增加操作步骤的可控性， 且制品中无外 源物质引入安全性增加 ； 采用中空纤维柱方法去除脱毒剂甲醛， 时间仅为 1 天， 缩短工艺操 作时间， 在封闭条件下操作， 减少。
13、产品在空气中暴露的时间， 减少污染风险， 增加了操作的 安全性， 纯化脱毒的白喉毒素采用分子筛层析法， 其中分子筛填料为 Sephacryl S-300HR， 由于 Sephacryl S-300HR 采用了亲水的、 刚性的烯丙基葡聚糖 / 双丙烯酰胺交联填料， 具有 最大回收率、 最小非特异吸附， 且有长期的化学和物理稳定性。 经纯化后的白喉毒素纯度更 高， 杂蛋白含量更低， 安全性更好。且合成培养基替代传统的牛肉消化液培养基， 使培养基 成分简单易控， 不含有影响制品质量和安全性的物质 ； 质量可控的培养基也使发酵产品的 质量可控性更高。 附图说明 0016 为了更清楚地说明本发明实施例或。
14、现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动性的前提下， 还可 以根据这些附图获得其他的附图。 0017 图 1 为本发明一种白喉疫苗的制备方法的工艺流程图 ； 0018 图 2 为白喉杆菌的生长曲线图 ； 0019 图 3 为白喉杆菌的产毒曲线图 ； 0020 图 4 为纯化白喉毒素紫外监测图谱。 具体实施方式 0021 下面将结合本发明实施例中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完 整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明。
15、一部分实施例， 而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例， 都属于本发明保护的范围。 0022 如图 1 所示， 一种白喉疫苗的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 0023 1) 白喉杆菌菌种复苏、 发酵培养， 制备白喉菌液 ； 0024 2) 将所述白喉菌液离心， 三次过滤处理， 然后进行超滤浓缩、 透析洗换， 从而得到 白喉毒素 ； 说 明 书 CN 104027797 A 4 3/5 页 5 0025 3) 对所述白喉毒素脱毒， 然后用切向流超滤系统进行超滤浓缩、 透析洗换 ； 0026 4) 对脱毒的白喉。
16、毒素进行纯化。 0027 作为优选的技术方案， 所述步骤 2) 的具体方法 ： 将离心除菌后的白喉菌液经 0.22m 0.1m 滤膜过滤， 然后经 300KD 中空纤维柱过滤， 再用 10KD 的中空纤维柱进行 超滤浓缩， 当超滤剩余体积为原体积的1/5时， 进行透析洗换， 洗换液为0.9NaCl溶液， 洗 换 3 5 个体积。 0028 作为优选的技术方案， 所述步骤3)中脱毒是在保持pH值为7.47.6， 添加80 150mM 赖氨酸， 0.4 0.6甲醛， 置 35 37下进行， 且脱毒时间为 25 45 天， 透析洗换 是用 0.9 NaCl 溶液洗滤 3 5 个体积。 0029 作为。
17、优选的技术方案， 所述步骤 3) 中切向流超滤系统是使用截留分子量为 10KD 的 Quixstand 中空纤维柱进行超滤。 0030 作为优选的技术方案， 所述步骤 4) 中纯化方法为分子筛层析法， 其中分子筛填料 为 Sephacryl S-300HR。 0031 作为优选的技术方案， 所述步骤 1) 中发酵培养采用合成培养基， 所述合成培养基 包括 ： 20g/L 酸水解酪蛋白、 5g/L 蛋白胨、 2.5g/L 麦芽糖、 2.5ml/L 乳酸， 1ml/L Mueller 氏 I 号液、 2ml/L Mueller 氏 II 号液、 浓度低于 0.10mg/ml 的铁离子。 0032 。
18、具体实施例 0033 实验 1) 白喉杆菌发酵培养 0034 实验材料 ： 0035 菌种 ： 白喉杆菌 PW8 株 (CMCC38007) 0036 培养基 ： 采用改良的合成培养基 ： 酸水解酪蛋白20g/L、 蛋白胨5g/L、 麦芽糖2.5g/ L、 乳酸2.5ml/L， Mueller氏I号液1ml/L、 II号液2ml/L ； 培养液的铁离子浓度低于0.10mg/ ml。 0037 补液 ： 20麦芽糖， Mueller 氏 I、 II 号液， 1谷氨酸溶液。 0038 主要设备 ： 50L 发酵罐 ( 上海万木青生物工程有限公司 ) 0039 实验方法 ： 0040 待白喉菌种复苏。
19、， 在改良液体培养基上培养， 37， 培养 72 小时后， 刮取菌膜传液 体培养基上摇瓶， 37培养 48 小时。按酸水解酪蛋白 20g/L、 蛋白胨 5g/L、 麦芽糖 2.5g/L、 乳酸 2.5ml/L 配制液体培养基 30L， 调节 pH 值至 7.6， 铁离子含量 0.10mg/ml。液体培养基 灭菌后， 加入 Mueller 氏 I 号液 1ml/L、 II 号液 2ml/L， 按 10的菌种浓度接种摇瓶菌种， 设 置发酵条件 ： 转速 250rpm、 培养温度 35、 pH7.8， 通气量 10L/min 发酵培养。发酵培养期 间， 控制 DO 维持在 10， 通入氧气量 4L/。
20、min， 剩余为压缩空气。24 小时后， 当 pH 低于 7.8 时开始补液。补液速度维持在 3 5ml/min。发酵过程中， 每隔 4 个小时取样一次， 检测菌 浓度、 毒素絮状单位。 0041 实验结果 ： 如图 2 所示， 溶解氧维持在 10左右时， 白喉杆菌随着培养时间的增 加， 菌浓度也逐渐上升 ( 吸光度值逐渐增加 )， 产毒也逐渐增加 ； 当发酵时间为 40h 时， 细菌 生长进入了稳定期， 此时白喉菌的产毒能力也达到了最大值， 可以进行收获。由结果可见， 采用该工艺发酵培养白喉杆菌生长良好， 产毒稳定， 产毒达 170Lf 絮状单位以上， 如图 3。 0042 实验 2) 白喉。
21、毒素的精制 说 明 书 CN 104027797 A 5 4/5 页 6 0043 实验材料及样品 ： 0044 过滤系统 ： Durapore0.22m、 0.1m， Millipore ； 0045 BT300， 保定兰格恒流泵有限公司 0046 中空纤维滤柱 ： UFP-500-E-4X2MA， GE ； UFP-10-E-H22LA， GE 0047 切向流处理系统 ： Quixstand 中空纤维膜分离系统， GE 0048 样品 ： 离心处理后的收获液， 样品量 10L。 0049 实验方法 ： 0050 收获的白喉菌液， 首先经离心 (8000 10000rpm) 去除菌体， 再。
22、将收获液经 0.22m0.1m的滤膜过滤， 然后再经300KD中空纤维过滤。 通过不同孔径的过滤处理， 去除不同大小的杂蛋白及代谢产物。最后采用 10KD 的中空纤维柱进行超滤浓缩处理， 设定 蠕动泵转速为320rmp， 过膜压力为10psi在25进行超滤， 当超滤剩余体积为原体积的1/5 时， 进行透析洗换， 洗换液为 0.9 NaCl 溶液， 洗换 3-5 个体积。 0051 实验结果 ： 处理样品的回收率在 90以上， 样品的纯度达 2000Lf/mg， 符合现行版 中国药典 不低于 1500Lf/mg 的要求。 0052 实验 3) 脱毒 0053 实验材料及样品 ： 0054 中空纤。
23、维滤柱 ： UFP-10-E-H22LA， GE 0055 切向流处理系统 ： Quixstand 中空纤维膜分离系统， GE 0056 样品 ： 精致白喉毒素样品量 1L。 0057 实验方法 ： 0058 将精制白喉毒素稀释至 300Lf/ml， 然后加入赖氨酸使其终浓度为 80 150mM， 再 加入 38的甲醛使其终浓度分别为 0.4 0.6， 调节 pH 至 7.4 7.6， 然后放置在 35 37条件下脱毒 30 天。脱毒过程中， 监测 pH 变化， 保持 pH 值在 7.4 7.6。脱毒结束后， 用 10KD 中空纤维超滤浓缩， 然后用 0.9 NaCl 溶液洗滤 3 5 个体积。
24、， 去除残余甲醛。 0059 实验结果 ： 通过检测脱毒样品， 得脱毒实验合格， 毒性逆转实验也合格， 脱毒过程 样品的损失率不超过 5。 0060 实验 4) 白喉毒素纯化 0061 实验材料及样品 ： 0062 层析柱 ： XK1670， GE 0063 紫外检测仪 ： HD-9707， 上海精科 0064 蠕动泵 ： BT100-2J， 保定兰格恒流泵有限公司 0065 分子筛填料 ： Sephacryl S-300HR， GE 0066 样品 ： 精致脱毒后的收获液 30ml 0067 实验方法 ： 0068 使用0.9NaCl缓冲液平衡层析柱2个柱体积， 采用280nm紫外检测仪进行。
25、检测， 校正基线零点， 取精致脱毒后的白喉类毒素溶液， 以 10ml/min 的速度上样。上样结束后， 用 0.9 NaCl 缓冲液以 10ml/min 的速度进行洗脱， 收集 A280 处检测得到的蛋白峰， 检测收集 得到蛋白峰纯度及回收率。 0069 实验结果 ： 使用 S-300 分子筛分离脱毒后的白喉类毒溶液， 可以有效去除杂蛋白， 说 明 书 CN 104027797 A 6 5/5 页 7 得到纯度更高的白喉类毒素， 紫外监测结果见图 4。蛋白峰纯度在 2000Lf/mg 蛋白氮， 回收 率 90以上。 0070 实验 5) 吸附白喉疫苗配制 0071 将纯化后的白喉类毒素调整吸附。
26、 pH 值至 5.0 6.0， 然后加入氢氧化铝吸附剂按 白喉毒素 30Lf/0.5ml( 每 1 人次用量 0.5ml) 配方进行吸附， 调整氢氧化铝含量至 1.0 1.5mg， 最后调整 pH 值至 5.8 7.2。 0072 测定配制疫苗的效价为 55IU/0.5ml， 符合现行 中国药典 的要求。 0073 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 104027797 A 7 1/3 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 104027797 A 8 2/3 页 9 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104027797 A 9 3/3 页 10 图 4 说 明 书 附 图 CN 104027797 A 10 。