多元醇氧化酶.pdf

本发明提供新型的多元醇氧化酶。由下述(a)～(e)所记载的性质特定的来自属于青霉菌(Penicillium)属的微生物的多元醇氧化酶。(a)稳定pH为pH6.0以上，反应最适pH为7.0～9.0。(b)作用温度为50℃以下，反应最适温度为40℃。(c)分子量约为113kDa。(d)多元醇的2位和3位的OH基特异地识别L-赤型的结构并进行反应，4位的OH基不能识别L-核糖型不发生反应。(e)底物特异性是D-阿拉伯糖醇、赤藓糖醇、D-甘露糖醇、D-山梨糖醇的顺序。

权利要求书
1.  一种多元醇氧化酶，其中，
所述多元醇氧化酶由下述(a)～(e)所记载的性质特定的来自属于青霉菌(Penicillium)属的微生物，
(a)稳定pH为pH6.0以上，反应最适pH为7.0～9.0；
(b)作用温度为50℃以下，反应最适温度为40℃；
(c)分子量约为113kDa；
(d)多元醇的2位和3位的OH基特异地识别L-赤型的结构并进行反应，4位的OH基不能识别L-核糖型不发生反应；
(e)底物特异性是D-阿拉伯糖醇、赤藓糖醇、D-甘露糖醇、D-山梨糖醇的顺序。

2.  如权利要求1所述的多元醇氧化酶，其中，
属于青霉菌(Penicillium)属的微生物为Penicillium sp.KU-1，其保藏号为NITE BP-1156。

3.  如权利要求1或2所述的多元醇氧化酶，其中，
上述多元醇氧化酶是将小麦麸皮作为培养基培养属于青霉菌(Penicillium)属的微生物而得到的。

4.  一种D-甘露糖的生产方法，其特征在于，
使权利要求1～3中任一项所述的多元醇氧化酶作用于D-甘露糖醇，从而氧化为D-甘露糖。

5.  一种D-来苏糖的生产方法，其特征在于，
使权利要求1～3中任一项所述的多元醇氧化酶作用于D-阿拉伯糖醇，从而氧化为D-来苏糖。

6.  一种L-古洛糖的生产方法，其特征在于，
使权利要求1～3中任一项所述的多元醇氧化酶作用于D-山梨糖醇，从而氧化为L-古洛糖。

7.  一种L-赤藓糖的生产方法，其特征在于，
使权利要求1～3中任一项所述的多元醇氧化酶作用于赤藓糖醇，从而氧化为L-赤藓糖。

说明书多元醇氧化酶
技术领域
本发明涉及一种来自属于青霉菌(Penicillium)属的微生物的新型的多元醇氧化酶，以及利用该多元醇氧化酶对稀有糖的特异性性质来高效地制造稀有糖的方法。
背景技术
众所周知酶被利用于利用仅选择性地与特定的物质反应的分子识别功能来制造目标物质，或者被利用于进行目标物质的检测的传感器中。
作为酶传感器，与一直以来的作为通常的分析方法的液相色谱法或者气相色谱法等相比，可以举出简便、迅速、正确、小型、并且低成本等的优点。因此，被广泛地利用于临床诊断或者食品分析、环境污染的测定等中。
作为酶传感器，例如，提出有向混有D-山梨糖醇或者葡萄糖的检测体中添加含有木糖醇氧化酶的试剂将木糖醇转化为D-木糖之后，使含有木糖脱氢酶的试剂作用，检测生成的D-木糖，从而能够简便并且特异地定量检测体中存在的木糖醇(专利文献1)；或者在含有选自山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇以及阿拉伯糖醇中的至少1种的多元醇的样品中使山梨糖醇氧化酶作用，测定生成的过氧化氢或者D-葡萄糖、甘露糖、木糖或者阿拉伯糖或者消耗的氧量测定多元醇的样品中的多元醇的测定方法(专利文献2)等多种提案。
作为将酶传感器实用化的代表例子，有利用葡萄糖氧化酶的糖尿病患者使用的血糖值测定器。在血液中混有多种成分，很难从中选择性地检测出葡萄糖。但是，通过利用葡萄糖氧化酶可以选择性地从血中识别葡萄糖。由于该血糖值测定器能够在糖尿病患者进行胰岛素给药的时候通过自己采血来简便地监测血糖值，因此扩大了其市场。在血糖值测定器中使用的氧化酶通常在氧化底物时作为电子受体会消耗 氧，催化生成过氧化氢的反应。由于氧的消耗可以用氧电极来简单地测定，过氧化氢的生成可以通过使用过氧化氢电极来简单地测定，因此，氧化酶是适合用于酶传感器中的酶。
近些年来，我们国家步入老龄化社会，随之要求医疗技术的充实。另外，随着酶传感器的应用的进步，预测食品分析或者环境测定在今后是酶传感器的需求进一步提高的领域。但是，现在由于底物特异性高的氧化酶受限制，所以有必要在今后开发酶传感器时探索新型的氧化酶。
然而，稀有糖是自然界中不存在、或者只存在极微量的单糖，且至今基本没有研究，但是由于D-阿洛酮糖、D-阿洛糖能够大量生产，因此着手稀有糖的生产技术的研究或相关生理作用、化学性质的研究，依次弄清特异的生理作用。在作为这些的医药的实用化时希望提供对稀有糖特异性反应的酶。将稀有糖的生理活性的例子示于以下的表1中。
[表1]

另外，对于酶在化合物的制造中的利用也提出有多种相关化合物或者酶，例如，近些年来，确立了通过利用D-塔格糖-3-差向异构酶(DTE)来大量生产作为稀有糖的1种的D-阿洛酮糖或者D-阿洛糖的技术。提出有使来自施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)(IPOD FERM BP-08593)的具有L-鼠李糖异构酶活性的蛋白质作用从而异构化为D-阿洛糖的D-阿洛糖的生产方法(专利文献3)；在含有D-阿洛酮糖和/或L-阿洛酮糖的溶液中使D-木糖·异构酶作用，由D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖和D-阿卓糖，由L-阿洛酮糖生成L-阿卓糖，采集选自这些D-阿洛糖、D-阿卓糖以及L-阿卓糖中的1种或2种以上的己醛醣的己醛糖的制造方法(专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平11-346797号公报
专利文献2：日本特开平6-169764号公报
专利文献3：日本特开2008-109933号公报
专利文献4：日本特开2002-17392号公报
非专利文献
非专利文献1：Agric.Biol.Chem.,43,2531-2535(1979)
非专利文献2：J.Biosci.Bioeng.,88,676-678(1999)
非专利文献3：食品卫生学杂志49，82-87.(2008)
非专利文献4：Jan.J.Med.Mycol.,45,55-58.(2004)
发明内容
发明所要解决的技术问题
如上所述，已知稀有糖具有实用性高的生理活性，另外还隐藏了在甜味剂、农药、医药、工业材料等广泛的领域中的实用化的可能性。因此，认为今后需要简便并且迅速的定量法。但是，由于该微量定量法并未确立，因此，如果发现对各稀有糖特异性高的氧化酶，能用于酶传感器中则其意义很大。另外，不是所有的稀有糖中都确立了大量生产，很多都是经过多个阶段的反应还只能生产少量的，如果发现通过氧化反应生产稀有糖的酶，则能够制作出通过一个阶段的反应高收率地生产出大量的稀有糖的新型的途径，进一步期待与稀有糖研究的进展有关。
在这样的状况中，麸皮培养基，从在湿度低的培养基的表面上繁殖微生物的方面出发，总所周知与微生物在自然界中繁殖的状况相似。 较多报告有如果使用麸皮培养基培养放线菌或者丝状菌，则在通常的液体培养基等中不能生产，在菌体外生产许多独特的酶。例如，绿色木霉菌(Trichoderma viride)生产的赖氨酸氧化酶(非专利文献1)等可以通过使用麸皮培养基得到底物特异性高的氧化酶。本发明通过探讨这样的现有技术，可以提供对稀有糖特异性作用的新型的酶。
本发明提供对于稀有糖底物特异性高的多元醇氧化酶，以及通过利用该多元醇氧化酶对稀有糖特异的性质来高效地制造稀有糖的方法。另外，以发现对各稀有糖特异性高的氧化酶，提供各稀有糖的酶传感器为目的。
解决技术问题的技术手段
本发明以以下的(1)～(3)中记载的多元醇氧化酶为要点。
(1)一种由下述(a)～(e)所述的性质特定的来自属于青霉菌(Penicillium)属的微生物的多元醇氧化酶。
(a)稳定pH为pH6.0以上，反应最适pH为7.0～9.0。
(b)作用温度为50℃以下，反应最适温度为40℃。
(c)分子量约为113kDa。
(d)多元醇的2位和3位的OH基特异地识别L-赤型的结构并进行反应，4位的OH基不能识别L-核糖型不发生反应。
(e)底物特异性是D-阿拉伯糖醇、赤藓糖醇、D-甘露糖醇、D-山梨糖醇的顺序。
(2)如上述(1)所述的多元醇氧化酶，其中，所述属于青霉菌(Penicillium)属的微生物为Penicillium sp.KU-1(保藏号NITEBP-1156)。
(3)如上述(1)或(2)所述的多元醇氧化酶，其中，上述多元醇氧化酶为以小麦麸皮作为培养基培养属于青霉菌(Penicillium)属的微生物得到的。
本发明以以下的(4)～(7)所述的稀有糖的生产方法为要点。
(4)一种D-甘露糖的生产方法，其特征在于，使上述(1)～(3)中任一项所述的多元醇氧化酶作用于D-甘露糖醇，从而氧化为D-甘露糖。
(5)一种D-来苏糖的生产方法，其特征在于，使上述(1)～(3) 中任一项所述的多元醇氧化酶作用于D-阿拉伯糖醇，从而氧化为D-来苏糖。
(6)一种L-古洛糖的生产方法，其特征在于，使上述(1)～(3)中任一项所述的多元醇氧化酶作用于D-山梨糖醇，从而氧化为L-古洛糖。
(7)一种L-赤藓糖的生产方法，其特征在于，使上述(1)～(3)中任一项所述的多元醇氧化酶作用于赤藓糖醇，从而氧化为L-赤藓糖。
发明的效果
通过本发明产生以下的效果。
1.可以提供对稀有糖底物特异性高的多元醇氧化酶。
2.可以提供对D-阿拉伯糖醇、赤藓糖醇、D-甘露糖醇、D-山梨糖醇底物特异性高的多元醇氧化酶。
3.与作为通常的分析方法的液相色谱法或者气相色谱法等相比，简便、迅速、准确、小型并且低成本，对与稀有糖相关的临床诊断或者食品分析、环境污染的测定等有用。
4.能够高效地制造稀有糖。
5.本酶是一个阶段的反应并且是氧化反应的不可逆反应，因此，期待能够以大致100％的收率大量生产稀有糖。
6.可以提供通过利用本多元醇氧化酶来特异地制造以下的糖类的方法。
a.以D-阿拉伯糖醇为原料制造D-来苏糖的方法；
b.以赤藓糖醇为原料制造L-赤藓糖的方法；
c.以D-甘露糖醇为原料制造D-甘露糖的方法；
d.以D-山梨糖醇为原料制造L-古洛糖的方法。
附图说明
[图1]表示多元醇氧化酶生产菌(A株或B株)的氧化酶的反应。
[图2]表示D-葡萄糖氧化酶生产菌(C株)的氧化酶反应。
[图3]表示C株在PDA培养基中的形态。
[图4]表示以D-山梨糖醇作为底物的本酶反应生成物的HPLC分析。
[图5]表示由底物得到的酶诱导生产的探讨结果。
[图6]表示小麦麸皮颗粒的大小对酶生产性产生的影响。
[图7]表示粗酶液中酶的稳定性。
[图8]表示TOYOPEARL Butyl-650M柱色谱分析。
[图9]表示TOYOPEARL DEAE-650M柱色谱分析。
[图10]表示Hiprep Q XL柱色谱分析。
[图11]表示HiLoad16/10Superdex200grade柱色谱分析。
[图12]表示非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)(左)和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(右)。
[图13]表示使用了凝胶过滤柱色谱分析的分子量计算的结果。
[图14]表示本酶的温度稳定性。
[图15]表示本酶的pH稳定性。
[图16]表示本酶的反应最适温度。
[图17]表示本酶的反应最适pH。
[图18]表示多元醇(D体)的结构式和底物识别部位。
[图19]表示本酶对D-阿拉伯糖醇的作用。
[图20]表示通过本酶对D-山梨糖醇的反应。
[图21]表示18S rDNA的结构和目标扩增部位。
[图22]表示PCR之后的琼脂糖凝胶电泳的照片。
[图23]表示PCR扩增片段中的比对检索。
[图24]表示多元醇生产菌的显微镜照片。
具体实施方式
本发明涉及一种由下述(a)～(e)的性质特定的来自属于青霉菌(Penicillium)属的微生物的多元醇氧化酶。
(a)稳定pH为pH6.0以上，反应最适pH为7.0～9.0。
(b)作用温度为50℃以下，反应最适温度为40℃。
(c)分子量约为113kDa。
(d)多元醇的2位和3位的OH基特异地识别L-赤型的结构并进行反应，4位的OH基不能识别L-核糖型不发生反应。
(e)底物特异性是D-阿拉伯糖醇、赤藓糖醇、D-甘露糖醇、D- 山梨糖醇的顺序。
本发明的多元醇氧化酶对D-阿拉伯糖醇、赤藓糖醇、D-甘露糖醇、D-山梨糖醇的底物特异性显著并且对稀有糖的制造或者稀有糖的检测等有用。特别是，对由D-甘露糖醇到D-甘露糖、由D-阿拉伯糖醇到D-来苏糖、由D-山梨糖醇到L-古洛糖、由赤藓糖醇到L-赤藓糖的制造有用。
本发明的氧化酶是来自从香川县三木町池户公民馆采集的土壤中得到的菌株KU-1的氧化酶，如以下的段落中详细说明的，该菌株判断为属于青霉菌(Penicillium)属的菌株。该菌株Penicillium sp.KU-1是以保藏号NITE P-1156在平成23年(2011年)10月26日被国内保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(千叶县木更津市上总镰足2-5-8)，可以由其中得到。此次进行国际申请时，在2012年10月16日请求将原保藏(NITE P-1156)移交至进行了上述原保藏的国际保藏单位，并于2012年10月25日由该国际保藏单位颁发了对原保藏的保藏证明(NITE BP-1156)。
将产生本发明的上述多元醇氧化酶的属于青霉菌(Penicillium)属的菌株Penicillium sp.KU-1在以下的记载中也称为A株。
作为已知的多元醇氧化酶可以列举链霉菌(Streptomyces)属生产的山梨糖醇氧化酶或者木糖醇氧化酶，可知在以D-山梨糖醇为底物的这些酶反应中生产了D-葡萄糖。另一方面，青霉菌(Penicillium)属生产的酶强烈地启示由D-山梨糖醇生产(L-)古洛糖，由D-阿拉伯糖醇生产(D-)来苏糖。现在，L-古洛糖是使用异构酶由L-山梨糖生产的。而且，D-来苏糖是经过从D-葡萄糖到D-阿拉伯糖醇、D-木糖的多阶段的反应生产的。进一步，由于是使用了异构酶的反应，因此，生产的D-来苏糖的收率低。在这一点上，本酶是一个阶段的反应，进一步氧化反应是不可逆反应，因此，可以以大致100％的收率大量生产这些稀有糖。因此，本发明的酶期待利用于稀有糖的新的生产体系中。
以下针对本发明的氧化酶进行说明。
[1.微生物的分离]
1.实验方法
1.1试剂
培养基中使用的马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar)(PDA)使用了Bection,Dickinson and Company制造的产品。
1.2培养基组成和培养条件
向约1g的各地采集的土壤中加入约5ml的水，制作土壤悬浊液。将其上清液进一步稀释100倍的溶液涂布50μl于PDA培养基上，在28℃下培养。从由其形成的菌落中将被认为是丝状菌的菌株接种于同样的培养基中，在28℃下培养分离菌株。
2.结果和考察
从大学的楼内或者以其周边为中心的香川县内、或者县外的大阪府内的公园等中采集土壤。从其中进行被认为是丝状菌的139株的菌株的分离。从通过采集的土壤得到的细菌为中心的微生物中，或者能够确认多个丝状菌的菌落的微生物等各种微生物中，可知根据采集场所从而土壤微生物的种类不同。另外，由于细菌相比于丝状菌的繁殖速度快，因此，在培养基整体中细菌扩展，难以分离丝状菌。为了防止此情况，认为通过在添加有氨苄青霉素(Ampicillin)等抗生素的培养基中进行培养能够效率良好地分离丝状菌。
[新型氧化酶的筛选]
将从土壤中分离的丝状菌在小麦麸皮培养基中培养，进行在培养基中分泌生产氧化酶的丝状菌的筛选。
1.实验方法
1.1试剂
作为培养基使用的小麦麸皮培养基的小麦麸皮使用了由JA香川购得的小麦麸皮，马铃薯葡萄糖肉汤(Potato Dextrose Broth(PDB))使用了Bection,Dickinson and Company制造的产品。缓冲液使用磷酸钾缓冲液(pH7)，磷酸氢二钾、磷酸二氢钾都使用了和光纯药工业株式会社制造的产品。作为底物使用的糖类的D-葡萄糖、D-甘露糖醇、D-山梨糖醇使用Nacalai Tesque Inc.制造的产品，D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖使用和光纯药工业株式会社制造的产品，蒜糖醇(Allitol)、D-塔格糖、D-阿洛酮糖、D-阿洛糖使用了由香川大学稀有糖中心得到的产品。作为底物使用的氨基酸的肌酸、肌酸酐使用了和光纯药工业株式会社制造的产品，L-鸟氨酸、L-瓜氨酸、γ-氨基丁酸使用了 SIGMA-ALDRICH CO.制造的产品。在氧化酶测定中使用的过氧化物酶(Peroxidase)(ABTS)分别使用和光纯药工业株式会社的产品。
1.2培养基组成和培养条件
在5mlPDB中接种分离的菌体，在1周时间内在28℃下振荡培养。向200ml容量的三角烧瓶中加入6g小麦麸皮、15ml水混合，将在高压釜中灭菌后的物质作为小麦麸皮培养基使用。向制作的小麦麸皮培养基中连同培养液将液体培养的菌体全部加入，在28℃下培养。培养2周之后按照以下所述的方法调制提取液，用于氧化酶活性测定中。
1.3培养基提取液的调制
在繁殖有菌体的小麦麸皮培养基中加入20ml的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)充分浸渍，在冰上静置1小时之后，使用纱布挤压。之后在4℃、12,000r.p.m下进行18分钟离心分离除去微颗粒，将其作为粗提取液。
1.4一次筛选中使用的底物
一次筛选考虑到高效性使用了糖混合溶液和氨基酸混合溶液。各底物调节成最终浓度为0.5M。混合溶液的组合示于表2中。在一次筛选中检测了活性的粗提取液单独使用0.5M的各底物进行二次筛选，进行底物的特定。
[表2]

1.5氧化酶活性测定方法
氧化酶的活性测定方法使用了过氧化物酶法。如果将D-葡萄糖氧化酶为例，则过氧化物酶法的原理如下。

该方法通过将由氧化反应产生的过氧化氢进行比色定量来测定活性。如果通过与底物的氧化反应生成的过氧化氢和过氧化物酶反应，则ABTS的氧化反应被催化，生成氧化型的ABTS。由于氧化型ABTS呈色为蓝色，因此，能够通过目视或者测定420nm的吸光度来检测氧化酶活性。活性测定使用由小麦麸皮培养基提取的粗提取液。用于氧化酶活性测定的反应液组成示于表3中。另外，作为对照组，也同样地制成替代底物加入有水的反应液。在室温下反应之后，通过目视确认有无显色，判断发现有显色的反应液中添加的粗提取液有氧化酶活性。
[表3]

2.结果和考察
进行氧化酶的筛选，其结果发现3株认为产生氧化酶的丝状菌。其中2株是生产多元醇氧化酶的微生物，并且是从三木町池户公民馆采集的菌株(以下，称为A株)、和从大阪府守口市内的公园采集的菌株(以下，称为B株)。A株和B株都生产多元醇氧化酶，但是A株的氧化酶以D-山梨糖醇和D-甘露糖醇作为底物，对蒜糖醇不显示反应性，相对于此，在B株的酶将D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、蒜糖醇全部作为底物方面不同。另外，由于两种酶都在醛糖或者酮糖中不反应，因此，可知对多元醇显示底物特异性。将这些酶的通过过氧化物酶的酶反应示于图1中。至今报告的多元醇氧化酶的种类少。但是，由于 发现了底物特异性不同的2株的多元醇氧化酶，考虑到自然界中生产多元醇氧化酶的微生物意外广泛分布的可能性，剩余一株是从大阪府东大阪市的土壤中采集的菌株(以下称为C株。)，其生产D-葡萄糖氧化酶，与其他单糖不反应，是对D-葡萄糖显示高底物特异性的氧化酶。从分离的丝状菌的形状来看，认为C株是黑曲霉(Aspergillusniger)。已知黑曲霉(A.niger)底物特异性高，生产D-葡萄糖氧化酶，将该酶的通过过氧化物酶法的酶反应示于图2中，将C株在PDA培养基中培养过的菌株示于图3中。
[2.A株生产多元醇氧化酶的生产条件的探讨]
对于液体培养中的酶生产的有无、或者通过底物的添加的酶生产的诱导生产的有无等A株生产多元醇氧化酶的生产条件进行了探讨。
1.实验方法
1.1供试验菌
使用了作为多元醇氧化酶生产菌的A株。
1.2试剂
作为培养基使用的酵母提取物(Yeast extract)使用了NacalaiTesque Inc.制造的产品。
1.3培养基组成和培养条件
将细菌在5ml灭菌水中悬浊，将1ml悬浊液分别接种于100ml的(1)PDB和(2)分别加入有各0.5％的酵母提取物、甘露糖醇、D-山梨糖醇的液体培养基中之后，在28℃下振荡培养。
1.4粗酶溶液的调制
从培养第2天开始，从各培养液中每次抽出500μl，将其在12000r.p.m.、4℃下进行离心分离10分钟之后，回收上清液，用10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)进行透析。将其作为粗酶溶液。
1.5酶活性测定方法
在上述反应溶液组成中，进行将D-山梨糖醇作为底物使用的反应，通过目视测定ABTS的显色来调查活性的有无。
2.结果和考察
进行液体培养，从培养第2天开始到第10天进行粗酶溶液的酶活性测定，在(1)PDB和(2)分别加入有各0.5％的酵母提取物、D- 甘露糖醇、D-山梨糖醇的液体培养基中都没有检测出酶活性。由此，该酶是在小麦麸皮培养基等的固体培养基中良好地生产的酶，另外，启示了没有引起通过底物进行的诱导生产。已知丝状菌通常固体培养比液体培养生产更多种的酶，认为该酶也不例外。
[3.以D-山梨糖醇作为底物的反应生产物的HPLC分析]
将D-山梨糖醇作为底物进行酶反应，使用HPLC进行该反应生成物的分析。
1.实验方法
1.1供试验菌
使用了作为多元醇氧化酶生产菌的A株。
1.2试剂
HPLC样品的脱盐处理中使用的AMBERLITE使用OrganoCorporation制造的产品，DIAION使用了三菱化学株式会社制造的产品。
1.3培养基组成和培养条件
按照上述同样的方法进行。
1.4酶溶液的调制
按照与上述同样的方法进行。
1.5酶反应
使表4所示的组成的粗提取液和D-山梨糖醇在室温下反应24小时，通过煮沸停止反应。认为随着反应进行溶解氧会减少，因此，使用移液管向反应液中注入空气。另外，将反应溶液混合后立即煮沸使反应停止得到的产物和热处理后的用粗酶溶液同样地使之反应24小时得到的产物作为对照。
[表4]
0mM的D-山梨糖醇50μl过氧化氢酶(2.5units/μl)20μl粗提取液180μl总计250μl
1.6脱盐处理、分析
用煮沸停止酶反应之后，为了除去微颗粒而在13,000r.p.m.下进行10分钟离心分离，回收上清液。向其中添加少量将DIAION和AMBERLITE以1:2的比例混合后的混合物，静置1小时，进行反应液的脱盐。回收其上清液，以13,000r.p.m.离心分离5分钟之后，加入到0.22μm的过滤器(Ultrafree-MC)，在6000r.p.m.下离心分离5分钟。将通过了过滤器的溶液全部回收，以不带入气泡的方式注入到HPLC专用管(样品杯IA)中。用自动取样器进行分析。
1.7HPLC的条件
使用GL-C611柱色谱仪(日立化成工业株式会社)，将10-4M氢氧化钠水溶液作为移动相，通过差示折光计进行了检测。
2.结果和考察
以D-山梨糖醇作为底物进行24小时酶反应，该反应生成物使用HPLC进行了分析。其结果，如图4所示，确认了在21分钟附近在对照的反应液中不存在的峰。这与作为稀有糖的古洛糖的洗脱时间一致。另外，9分钟附近的峰认为是盐等，20分钟附近的峰与艾杜糖的洗脱时间一致，在对照样中也确认有同样的峰，因此，认为是不是来自酶反应的物质。并且，28分钟附近的峰是作为底物使用的D-山梨糖醇。
根据该结果，强烈暗示了A株生产的酶与D-山梨糖醇的反应生成物是作为稀有糖的古洛糖。另外，没有进行对光学活性的测定，如果考虑底物是山梨糖醇，则结构上认为生成物为L-古洛糖。但是，即便氧化反应是不可逆反应，反应24小时后生成的(L-)古洛糖为约3％的微量。这认为是使用了粗酶溶液的方面和反应溶液中的氧浓度不充分的方面是原因。
[4.来自属于青霉菌(Penicillium)属的菌株(A株)的多元醇氧化酶的生产条件的探讨]
对液体培养中的酶生产的有无、通过底物的添加导致的酶生产的诱导生产的有无等能够更高效地取得来自青霉菌(Penicillium)属的多元醇氧化酶的粗酶溶液的方法。
1.实验方法
1.1供试验菌
使用了生产多元醇氧化酶的属于青霉菌(Penicillium)属的菌株(A 株)。
1.2培养基组成和培养条件
1)液体培养基
在5ml灭菌水中悬浊菌体，将1ml悬浊液分别接种于100ml的(1)PDB和(2)分别加入了各0.5％的酵母提取物、D-甘露糖醇、D-山梨糖醇的液体培养基中之后，在28℃下振荡培养。
2)通过底物的酶诱导生产的探讨
将在PDB培养基中在28℃下振荡培养3天时间的本菌分别接种5ml于D-甘露糖醇非添加培养基和D-甘露糖醇添加培养基中，在28℃下静态培养。
[表5]

[表6]

3)小麦麸皮的颗粒的大小对酶生产性产生的影响
将以下组成的小麦麸皮培养基用向小麦麸皮培养基中添加糖同样的方法接种菌株，培养。将小麦麸皮和水的比例示于表7和表8中。
[表7]

[表8]

1.3酶溶液的调制
1)液体培养基
从培养的第2天开始，从各培养液中抽出500μl，将其在12,000r.p.m.、4℃下进行离心分离10分钟之后，将回收上清液后的物质用10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)进行透析。将其作为粗酶溶液。
2)通过底物的酶诱导生产的探讨
按照和上述同样的方法取得粗酶溶液。但是，缓冲液变更为10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)。
3)小麦麸皮的颗粒的大小对酶生产性产生的影响
按照与通过底物进行的酶诱导生产的探讨同样的方法进行提取，取得粗酶溶液。
1.4酶活性测定方法
1)液体培养基
在上述反应液组成下进行将D-甘露糖醇作为底物使用的反应，通过目视测定ABTS的显色来调查活性的有无。
2)通过底物的酶诱导生产的探讨
本酶活性的测定通过使用与上述同样的过氧化物酶法测定420nm的吸光度的上升来进行。酶反应通过添加D-甘露糖醇来开始，使用日立制造的分光光度计U-2010在30℃的反应条件下以10分钟的时间变化测定吸光度。反应如表9所示调制成反应液总量为1ml。1unit定义为420nm吸光度下在1分钟内吸光度上升1的酶量。
[表9]

3)小麦麸皮的颗粒的大小对酶生产性产生的影响
用与糖向小麦麸皮培养基中添加同样的方法进行测定。
2.结果和考察
1)液体培养基
从培养第2天开始到第10天进行粗酶溶液的酶活性测定，在任一液体培养基中都没有检测出酶活性。根据该结果，启示了该酶是在小麦麸皮培养基等的固体培养基中良好地生产的酶。另外，由于在液体培养基和固体培养基中的繁殖速度相同或者液体培养基更快，因此，启示了酶生产条件不依赖于菌丝生长。
2)通过底物的酶诱导生产的探讨
从培养第6天开始到第18天为止进行粗酶溶液的提取和酶活性测定，将其结果示于图5中。由于在酶活性中没有发现大的差别，因此，启示了该酶不会通过底物的添加引起酶产生的诱导。另外，由于小麦麸皮中含有甘露糖醇等构成诱导源的糖，因此，也不能否定即便进一步向小麦麸皮培养基中添加底物也不能发现此以上的诱导的可能性。
3)小麦麸皮颗粒的大小对酶生产性产生的影响
进行从培养第6天到第12天的粗酶溶液的提取和酶活性测定，将该结果示于图6中。根据该结果，对于峰发现有2.6倍的差，可知使用颗粒小的小麦麸皮的本菌的培养能够更良好地生产酶。另外，酶活性的峰在培养第9天附近出现。由这些结果，使用从用颗粒小的小麦麸皮培养基培养了9天时间的物质中提取的粗酶溶液来尝试本酶的精制。
[5.使用粗酶溶液的酶稳定性的探讨]
在精制之前，针对粗酶液中的本酶的稳定性进行了探讨。
1.试验方法
1.1供试验菌
使用生产多元醇氧化酶的属于青霉菌(Penicillium)属的菌株(A株)。
1.2试剂
硫酸铵分级中使用的硫酸铵使用了Nacalai Tesque Inc.制造的产品。
1.3培养基组成和培养条件
向500ml容量的三角烧瓶中加入20g小麦麸皮和40ml水用抹刀均匀混合，将其塞上棉塞用高压釜灭菌之后作为小麦麸皮培养基使用。向其中接种用PDB进行了3天振荡培养的菌株5ml，在28℃下静置培 养10天时间。
1.4酶溶液的调制
用与上述同样的方法取得粗提取液。但是，缓冲液更换为10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)。粗提取液的一半作为粗酶溶液在冰上静置0小时、5小时之后、24小时之后测定残留酶活性。剩余的通过硫酸铵沉淀来调制50～70％的饱和硫酸铵组分，同样地测定在冰上静置0小时之后、5小时之后、24小时之后的残留酶活性。
1.5酶活性测定方法
用与上述同样的方法进行。
2结果和考察
将测定酶活性的结果示于图7和表10中。
将粗酶溶液在冰上静置5小时后的残留酶活性为约5％，24小时后完全失活。但是，通过硫酸铵沉淀调制的50～70％饱和组分即使在冰上静置24小时后残留活性也为60％。由此启示了粗酶溶液中存在高蛋白酶活性，通过硫酸铵分级可以除去某种程度的蛋白酶。
[表10]

[6.来自属于青霉菌(Penicillium)属的微生物的多元醇氧化酶的精制]
1.实验方法
1-1供试验菌
使用了生产多元醇氧化酶的属于青霉菌(Penicillium)属的菌株(A株)。
1-2培养基组成和培养条件
向500ml容量的三角烧瓶中加入20g小麦麸皮和30ml水均匀混合，塞上棉塞用高压釜灭菌之后作为小麦麸皮培养基使用，在28℃下培养9天时间。
1.3酶活性测定方法
本酶活性的测定通过使用与上述同样的过氧化物酶法测定420nm的吸光度的上升来进行。酶反应通过添加D-甘露糖醇来开始，使用日立制造的分光光度计U-2010在30℃的反应条件下以10分钟的时间变化测定吸光度。反应如表11所示调制成反应液总量为1ml。1unit定义为在420nm吸光度下1分钟内吸光度上升1的酶量。
[表11]
1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)50μl过氧化物酶(10units/ml)100μl10mM ABTS100μl0.5M D-甘露糖醇100μl酶溶液100μlH2O550μl总计1ml
1.4蛋白质定量
在蛋白质的定量中基于Bradford法，使用Nacalai Tesque Inc.制造的Protein Assay CBB溶液进行。分析曲线的制作中作为标准蛋白质使用了牛血清白蛋白。吸光度的测定中使用了日立制造的分光光度计U-3200。
1.5十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)SDS-PAGE调节成为分离凝胶15％、浓缩凝胶4％，按照Laemmli的方法进行。分子量标记使用了SIGMA公司制造的Protein Marker Low Range。
1.6非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和活性染色
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳调节成为分离凝胶15％、浓缩凝胶4％按照Davis法来进行。活性染色通过将电泳后凝胶用水清洗之后，在遮光状态下浸渍于与表11所示的溶液同样的组成的溶液中来进行。
1.7酶精制
酶精制是(1)～(4)全部在冰上或者在4℃下进行。另外，缓冲液使用了10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)。
(1)粗酶溶液的调制
向培养后的培养基中添加60ml缓冲液均匀混合，在冰上静置了1 小时以上之后，用纱布进行挤压，提取培养基中的酶。通过将其在4℃、800r.p.m.下离心分离10分钟除去微颗粒，将其作为粗酶溶液。
(2)50～70％饱和硫酸铵组分
向粗酶溶液中首先加入硫酸铵使其成为50％饱和，溶解之后在4℃下搅拌3小时。将其在4℃、8,000r.p.m.下离心分离10分钟。回收其上清液加入硫酸铵溶解使其成为70％饱和，在4℃下搅拌一个晚上。将其在4℃、8,000r.p.m.下离心分离10分钟，用由硫酸铵达到40％饱和的缓冲液溶解沉淀。
(3)TOYOPEARL Butyl-650M柱色谱分析
供给到用由硫酸铵达到40％饱和的缓冲液平衡化的TOYOPEARLButyl-650M柱(φ2.0cm×8.0cm)中。柱用100ml的由硫酸铵达到40％饱和的磷酸钾缓冲液清洗，酶通过每次各100ml将缓冲液中的硫酸铵饱和浓度梯度地变化为30％、20％来洗脱，回收有活性的组分。将回收的组分中所含的硫酸铵在缓冲液中4℃下透析一晚上来除去。此处的420nm的吸光度上升使用日立制造的分光光度计U-3200，不进行由时间变化的测定而测定从反应开始1分钟之后的1处的吸光度的值。
(4)TOYOPEARL DEAE－650M柱色谱分析
提供给用缓冲液平衡化后的TOYOPEARL DEAE-650M柱(φ1.0cm×5.0cm)。用50ml缓冲液清洗柱，酶通过每次各50ml将缓冲液中的氯化钠浓度梯度地变化为0mM、100mM、150mM、200mM来洗脱，回收有活性的部分。将回收的组分中所含的氯化钠用缓冲液在4℃下透析一晚上来除去。在此，420nm吸光度的上升使用日立制造的分光光度计U-3200，不进行由时间变化的测定而测定从反应开始1分钟之后的1处的吸光度。
(5)Hiprep Q XL柱色谱分析
使用Amicon Ultra-15(Millipore公司制造)浓缩成约1ml之后，提供给用200ml的缓冲液平衡化后的Hiprep Q XL(GE Healthcare)。酶通过将缓冲液中的氯化钠浓度配置成0～0.5M的直线的浓度梯度来洗脱，回收有活性的组分。将回收的组分中所含的氯化钠用缓冲液在4℃下透析一晚上来除去。在此的吸光度测定也使用日立制造的分光光度计U-3200，测定从反应开始1分钟之后的吸光度的值。
(6)HiLoad16/10Superdex200prep grade柱色谱分析
提供给用200ml添加有0.15M的NaCl的缓冲液平衡化后的HiLoad16/10Superdex200prep grade(GE Healthcare)。在此的吸光度测定使用日立制造的分光光度计U-300，测定从反应开始5分钟之后的吸光度的值。
2.结果和考察
多元醇氧化酶的精制按照TOYOPEARL Butyl-650M柱色谱分析仪(疏水柱色谱分析仪)、TOYOPEARL DEAE-650M柱色谱分析仪(弱阴离子交换柱色谱仪)、Hiprep Q XL柱色谱分析仪(强阴离子交换柱色谱仪)、Hiroad16/10Superdex200prep grade柱色谱分析仪(凝胶过滤柱色谱仪)的顺序来进行。
将TOYOPEARL Butyl-650M柱色谱分析的洗脱图案示于图8中。由于用30％饱和硫酸铵确认有1个活性峰，因此，将这些有活性的7～12的级分一起进行透析之后，用于下一次柱色谱分析中。另外，置换成20％饱和硫酸铵时立即在第45号附近的级分处也确认有小的活性峰。这认为是不是用30％饱和硫酸铵没有洗脱完的酶洗脱出来了。
将TOYOPEARL DEAE-650M柱色谱分析的洗脱图案示于图9中。确认了用100mM氯化钠洗脱的8～22的级分和用150mM洗脱的40～52的级分中有2个活性峰，比较了比活性，结果8～22的级分的更高，因此，将这些级分一起透析之后，使用Amicon Ultra-15(Millipore公司制造)浓缩成约1ml，用于Hiprep Q XL柱色谱分析。由于确认有2个峰，因此，认为存在同功酶或者不同的酶。
接下来使用的Hiprep Q XL柱色谱分析中成为如图10的洗脱图案，确认有1个活性峰。将确认了高活性的级分89～97的组分一起透析之后，使用Amicon Ultra-15(Millipore公司制造)浓缩成约1ml，提供给HiLoad16/10Superdex200prep grade柱色谱分析仪。HiLoad16/10Superdex200prep grade柱色谱分析时成为如图11所示的洗脱图案。另外，通过精制过程由280nm的吸光度得到的蛋白质的定量由Hiprep QXL柱色谱分析来进行。这是由于粗酶溶液中含有褐色的色素，直到TOYOPEARL DEAE-650M柱色谱分析样品发生了着色。将精制表示于表12中。精制的结果、收率为约0.1％，精制倍率为约3.0倍。
[表12]

[7.来自属于青霉菌(Penicillium)属的菌株(A株)的多元醇氧化酶的各种性质的分析]
使用由上述方法得到的精制酶溶液进行多元醇氧化酶的各种性质的分析。
1.实验方法
1.1纯度的检测
通过进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)，并分别进行活性染色和GBB染色，来进行纯度的检测。
1.2分子量和亚单元结构的探讨
如上所述，由于在精制的最后阶段使用了HiLoad16/10Superdex200Prep grade柱色谱分析仪(凝胶过滤柱色谱分析仪)，因此，还同时进行了分子量的计算。分子量标记中使用SIGMA公司制造的GELFILTRATION MOLECULAR WEIGHT MARKERS的细胞色素c(Cytochrome c)、碳酸酐酶(Carbonicanhydrase)、白蛋白(Albumin)，乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)进行了酶的分子量的测定。另外，由精制酶的SDS-PAGE的结果进行了亚单元结构的检测。
1.3温度稳定性的探讨
反应液组成用与表11基本同样的组成来进行。在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下进行检测。底物使用了D-甘露糖醇，使用日立制造的分光光度计U-2810测定了在30℃的条件下通过反应产生的吸光 度420nm的上升。调制成反应液的总量为1ml，420nm的吸光度在1分钟内吸光度上升1的酶量定义为1unit。
1.4pH稳定性的探讨
各pH的缓冲液与酶混合使最终浓度为0.1M，在冰上静置15小时之后，测定残留酶活性。各缓冲液在pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0时使用柠檬酸缓冲液，pH6.0、7.0、8.0时使用磷酸钾缓冲液，pH8.0、9.0时使用甘氨酸NaOH缓冲液，pH8.0、9.0、10.0时使用Tris-HCl缓冲液。活性通过以D-甘露糖醇作为底物，使用日立制造的分光光度计U-2010测定在30℃的条件下通过反应产生的吸光度420nm的上升。另外，为了试验稳定性而在反应液中的酶中包含加入的各pH的缓冲液。反应全部在统一的pH下进行，因此，反应液中加入比通常的反应液组成更多的磷酸钾缓冲液(pH8.0)，反应在pH8.0的条件下稳定。(表13)
[表13]
1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)100μl过氧化物酶(10units/ml)100μl10mM ABTS100μl0.5M D-甘露糖醇100μl酶溶液100μlH2O500μl总计1ml
1.5反应最适温度的探讨
反应液组成与温度稳定性的检测同样地进行。分别测定了在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下10分钟的吸光度420nm的上升。吸光度的测定中使用了日立制造的分光光度计U-3208。
1.6反应最适pH的探讨
将反应液组成示于表14中。各pH的缓冲液使用了与pH稳定性的检测同样的缓冲液。调制反应液使其总量为1ml，以反应溶液中的缓冲液浓度成为最终浓度为50mM的方式调制。活性使用了日立制造的分光光度计U-2010测定在30℃的条件下通过反应产生的吸光度420nm的上升。另外，反应溶液中含有作为酶的过氧化物酶。为了不会受到因为该过氧化物酶产生的pH的影响，比通常多加入过氧化物酶。
[表14]
过氧化物酶(10units/ml)100μl10mM ABTS100μl0.5M D-甘露糖醇100μl酶溶液100μl1ml的50mM各缓冲液中
2.结果和考察
进行了本酶的各种性质的探讨，得到如下的结果。
2.1纯度的检测
如图12所示，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)中大致检测出1根蛋白质带，其位置与能够用活性染色确认的带的位置一致。由该结果，暗示本酶基本被均匀地精制。但是，尽管基本被均匀地精制，可是精制倍率极低至3倍被认为是因为受蛋白酶的影响等导致精制过程中的失活。因此，认为在本酶的精制中需要使用蛋白酶阻碍剂等的处理。
2.2分子量和亚单元结构的探讨
如图13所示，本酶的分子量在凝胶过滤柱色谱分析中算出约为113kDa，在SDS-PAGE中在约50kDa和60kDa的位置处检测出2根带。由这些结果，暗示本酶是由分子量约50kDa和60kDa的亚单元构成的异二聚体(Heterodimer)酶。由于在已知的多元醇氧化酶中没有异二聚体酶的报告，因此，可以说该酶的新颖性高。
2.3温度稳定性的探讨
在10℃～60℃下，试验了各自的稳定性，其结果如图14所示，可知本酶在30℃以下稳定。另外，在40℃下残留活性为约80％，在50℃以上完全失活。
2.4pH稳定性的探讨
在pH2.0～10.0时测定了酶活性，结果如图15所示，pH在6.0以上稳定。另外，在pH9.0处Tris-HCl缓冲液中的酶活性显著提高，与同样的pH9.0的甘氨酸-NaOH缓冲液相比较有约2倍的差异。由此暗示Tris-HCl缓冲液对本酶活性产生一些影响。
2.5反应最适温度的探讨
在10℃～60℃下如图16所示测定了酶活性，可知40℃为反应最适 温度。
2.6反应最适pH的探讨
如图17所示，在pH2.0～10.0时测定了各酶反应液中的反应，结果可知pH8.0是反应最适pH。另外，确认了pH6.0以下时完全没有活性。另外，与pH稳定性的探讨同样地，在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中的酶活性显著高，与相同的pH8.0的甘氨酸-NaOH缓冲液相比较也有约2倍的差。由此，暗示了Tris-HCl缓冲液对本酶活性产生一些影响。进一步，发现pH9.0处活性急剧降低。这认为是不是由于虽然相比于通常的反应液组成多加入过氧化物酶，防止了由过氧化物酶产生的pH的影响，但是过氧化物酶活性在pH9.0以上时急剧降低，因此，仍然会受到其影响。
2.7本氧化酶和已知氧化酶的各特性中的比较
进行了本酶和已知的多元醇氧化酶或者小麦麸皮培养基中特异地生产的氧化酶的酶学上、蛋白质化学上的各性质的比较。
将已知的多元醇氧化酶的各性质和本酶的各性质示于表15中。本酶与其它的多元醇氧化酶相比分子量非常大，温度稳定性低。进一步，至今没有作为异二聚体酶的报告例。这些方面成为更强有力地支持本酶的新颖性的结果。另外，将已知的小麦麸皮培养基中特异地生产的氧化酶的各性质和本酶的各性质示于表16中。pH稳定性或者反应最适温度类似，但是在与已知的多元醇氧化酶相比较时同样地温度稳定性比其它的氧化酶低。然而，在与本酶相同的来自青霉菌(Penicillium)属菌的谷胱甘肽氧化酶和甘油氧化酶为异二聚体酶，由此，在分子量大这一方面相类似。这样，认为青霉菌(Penicillium)属菌在小麦麸皮培养中是不是比其它菌种在菌体外分泌生产更多的异二聚体酶。另外，报告有在来自青霉菌(Penicillium)属菌的甘油氧化酶中，该酶是结合于细胞表面的酶，因此，通过在酶提取时向缓冲液中添加表面活性剂，从而使得酶活性变得非常高。
[表15]

N.D.：没有确定(not determined)
[表16]

N.D.：没有确定(not determined)
[8.酶的底物特异性]
1底物特异性
使用部分精制酶测定的本酶的底物特异性成为以下所示的表17那样。在检测的多元醇中，依照D-阿拉伯糖醇、赤藓糖醇、D-甘露糖醇、 D-山梨糖醇的顺序活性提高，在其它的多元醇中没有发现高的活性。
将多元醇D体的结构示于图18中。比较检测的全部的多元醇结构，确认了活性高的4种多元醇中有共同的结构。如图18所示，本酶表现出Fischer结构式，暗示了2位和3位的OH基特异地识别向右的L-赤型。但是，该结构在活性低的核糖醇、蒜糖醇、D-塔罗糖醇中也有发现。如果比较活性高的4种多元醇和这些的结构，可知其区别在于4位的OH基是向右的L-核糖型的结构。由此认为由于本酶4位的OH基不能识别L-核糖型的结构，所以在这些核糖醇、蒜糖醇、D-塔罗糖醇中不能引起氧化反应。
底物特异性、底物识别机构都与现有报告的多元醇氧化酶不同，因此，本酶是新型的氧化酶。
[表17]

2由HPLC进行的反应生成物的检测
通过HPLC对多元醇氧化酶的反应生成物进行分析。其结果，判明以D-甘露糖醇、D-阿拉伯糖醇、D-山梨糖醇为底物时的生成物。赤藓糖醇是四碳糖，由于现阶段难以进行生成物的辨別，因此本次没有进行分析。确认了由D-甘露糖醇生产甘露糖。虽然没有针对光学活性 进行测定，但是如果考虑到底物是D-甘露糖醇，则认为结构上生成物是D-甘露糖。
根据以D-阿拉伯糖醇作为底物时的酶反应液的HPLC分析结果，可知由D-阿拉伯糖醇的生成物是来苏糖。这也没有进行生成物的光学活性测定，但是在结构上认为反应生成物是D-来苏糖。将该反应的结构式示于图19中。在至今报告的多元醇氧化酶中D-阿拉伯糖醇的1位的羟基受到氧化生成D-阿拉伯糖。在此列举链霉菌(Streptomyces)属生产的山梨糖醇氧化酶作为例子。另一方面，暗示本酶催化D-阿拉伯糖醇的6位的羟基的氧化，生成稀有糖D-来苏糖。在此，在HPLC结果中发现在D-阿拉伯糖醇的峰的附近有一个峰，但是由于在酶反应前也在任意的底物中都确认有该峰，因此认为该峰是来自菌体的糖以外的成分。
接下来，根据以D-山梨糖醇为底物时的反应生成物的HPLC分析结果，确认了由D-山梨糖醇生成了古洛糖。这也没有对光学活性进行测定，但是由于是从D-山梨糖醇生成的，因此在结构上认为生成了L-古洛糖。将该反应的结构式示于图20中。在此也列举作为已知的多元醇氧化酶的山梨糖醇氧化酶为例。结合之前的以D-甘露糖醇、D-阿拉伯糖醇作为底物时的结果，认为本酶是将多元醇的6位的羟基氧化的酶。至今报告的多元醇氧化酶中没有报告有将6位的羟基氧化的酶，因此再次暗示了本酶是新型的氧化酶。
在此，从本酶催化多元醇的6位的羟基的氧化的观点出发，预测本次没有进行HPLC分析的以赤藓糖醇为底物的氧化反应。如果赤藓糖醇的6位的羟基受到氧化，则预测生成L-赤藓糖。由此强烈地暗示通过本酶的氧化反应，生成D-来苏糖、L-古洛糖、L-赤藓糖这3种稀有糖。
调查这些稀有糖的现有的生产方法，D-来苏糖是经过从D-葡萄糖到D-阿拉伯糖醇、D-木糖的多阶段的反应生产的(非专利文献2)。而且，由于是异构酶，难说能以高收率得到生产的D-来苏糖。L-古洛糖也通过由L-山梨糖使用异构酶生产。L-赤藓糖是将赤藓糖醇用存在于葡糖杆菌(Gliconobacter)属的菌株的细胞膜外表层上的膜结合型中赤藓糖醇(meso-Erythritol)脱氢酶通过氧化发酵生成L-赤藓酮糖 (L-erythrulose)之后，使用异构酶生产L-赤藓糖。这样，这些稀有糖的生产包含多阶段的反应体系，并且由于是使用异构酶的反应，因此不能期待100％的收率。在这一点上本酶是一个阶段的反应，而且由于氧化反应是不可逆反应，因此，期待能够以大致100％的收率大量生产这些稀有糖。
[9.多元醇氧化酶生产菌的鉴定]
为了进行多元醇氧化酶生产菌的鉴定，想要确定18S rDNA的序列。18S rDNA是在真菌微生物中特异地发现的结构，并且是在放线菌或者细菌中不存在的结构。将该18S rDNA的结构示于图21中。
1.实验方法
1.1引物的制作
将本次制作的引物的碱基序列示于表18中。
(1)18S_F1引物的制作参考用于丝衣霉属(Byssochlamys spp.)鉴定的基因指标的评价(非专利文献3、4)来进行。
(2)18S_F2和ITS_R1引物参考BEX株式会社的主页(http://www.bexnet.co.jp/product/microbialprimer.html)来制作
[表18]

18S_F1在处于18S rDNA的下游在广泛的真菌中共有的序列的区域中以成为相同的序列的方式制作，18S_F2是在将要进入ITS区域之前的18S rDNA的序列的区域中以成为相同的序列的方式制作，ITS_R1是位于5.8S的大致中间的区域中以成为相同的序列的方式制作(图21)。
1.2PCR和测序反应
(1)基因组的调制方法
1)将液体培养的菌体加入到研钵中，加入液氮磨碎移至微管中。
2)加入600μl的2％CTAB溶液，颠倒混合。
3)将管移至加热至65℃的微量恒温仪(Heat Block)，加热30分 钟，在12,000r.p.m.下离心10分钟。
4)回收上清液，向其中加入等量的氯仿/异戊醇(24:1)，温和地搅拌5分钟。
5)在12,000r.p.m.下离心15分钟之后，回收上部的水相。
6)再次重复4、5，将水相移至新的管中。
7)加入1～1.5vol.的1％CTAB溶液，颠倒混合之后，在室温下静置1小时，在8,000r.p.m.下离心10分钟。
8)舍弃上清液，加入400μl的1M的CsCl，使之完全溶解。
9)加入800μl的100％乙醇，颠倒混合之后，在-20℃下静置20分钟以上，在12,000r.p.m.下离心5分钟。
10)舍弃上清液，向沉淀中加入400μl的70％乙醇，在12,000r.p.m.下离心5分钟。
11)舍弃上清液，将沉淀用真空干燥机风干，溶解于20μl的TE缓冲液中，在37℃下进行1小时处理。
12)分别添加各100μl乙醇和氯仿，在12,000r.p.m.下离心10分钟，回收上清液。
13)加入等量的氯仿，在12,000r.p.m.下离心10分钟，回收上清液。
14)进行乙醇沉淀，在12,000r.p.m.下离心10分钟，离心之后用30μl的TE缓冲液溶解。
(2)PCR
使用18S_F1引物和ITS_R1引物，将(1)中得到的多元醇氧化酶生产菌的基因组DNA作为模板进行PCR。PCR的条件为在95℃下使之改性3分钟之后，进行了95℃、50℃、75℃33次循环。使用了表19所记载的PCR反应液。
[表19]
模板DNA0.8μl10×Ex TaqTM缓冲液1.0μldNTP混合物(2.5mM)0.4μl18S_F1(10pmol/μl)0.8μlITS_R1(10pmol/μl)0.8μlEx Taq聚合酶*H2O6.2μl
*Ex Taq是尖端上蘸上的微管内的悬浊
(3)测序反应
将通过PCR扩增的片断进行电泳之后，进行了凝胶提取。之后，使用各自的引物进行了测序反应(图21)。测序反应的条件进行95℃、50℃、75℃25次循环。在表20中示出了测序反应液的组成。
[表20]
模板DNA2.0μl循环序列混合物2.5μl引物(2pmol/μl)5.5μl
2.结果和考察
PCR之后，用琼脂糖凝胶电泳的结果确认有目标尺寸片断的扩增(图22)。因此，判断本菌是真核的丝状菌。
测序反应之后进行分析，其结果可知使用了18S_F1的测序反应中为250bp的碱基序列，使用了ITS_R1的反应中为180bp的碱基序列。另外，通过(2)18S_F2的测序反应确定有159bp的序列。各分析的结果中，不能解读多元醇氧化酶生产菌的PCR扩增片断的总长。但是，检索了与分别得到的序列同源性高的菌，发现使用18S_F1引物得到的250bp与青霉菌(Penicillium)属(图23)为94％的同源性，与曲霉属(Aspergillus)为93％的同源性。使用ITS_R1引物得到的180bp发现与青霉菌(Penicillium)为90％的同源性(图23)。另外，使用18S_F2得到的159bp中与青霉菌(Penicillium)属以100％的同源性碱基序列一致(图23)。因此，强烈暗示本菌是青霉菌(Penicillium)属菌。
图24中表示多元醇氧化酶生产菌的照片和用光学显微镜(×1000)的照片。根据这些形态也暗示了本菌是青霉菌(Penicillium)属。
在至今报告的微生物生产的多元醇的氧化酶中，基本没有报告菌体外酶。从这一点来看，也认为本酶为新颖性高的酶。
产业上利用的可能性
本发明提供新型的多元醇氧化酶，特别是，以对稀有糖具有底物特异性为特征。稀有糖是在自然界中不存在或者只存在微量的糖。对其生产技术或者生理作用、化学性质等有很多不清楚的地方，但是，近些年来随着确立关于几种稀有糖的大量生产技术，期待在阐明其生理活性的甜味剂、农药、试剂、工业材料等广泛的领域中的实用化。本发明的多元醇氧化酶的提供是回应这样的产业界的期待完成的，成为对稀有糖的计量、其高效的生产方法的新的发展有用的技术手段。