《一种黑曲霉菌株及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种黑曲霉菌株及其应用.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102796670 A (43)申请公布日 2012.11.28 CN 102796670 A *CN102796670A* (21)申请号 201210259744.6 (22)申请日 2012.07.25 CGMCC No.6152 2012.05.23 C12N 1/14(2006.01) C12N 9/18(2006.01) C12R 1/685(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 陈启和 徐腾洋 董亚晨 方若思 何国庆 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 332。
2、24 代理人 胡红娟 (54) 发明名称 一种黑曲霉菌株及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种黑曲霉菌株及其应用， 该 菌 株 命 名 为 黑 曲 霉 (Aspergillus niger) ZJUQH2012147， 已于 2012 年 05 月 23 日保藏在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏编号为CGMCC No.6152。 本发明还公 开了所述菌株生产阿魏酸酯酶的方法， 包括 ： (1) 将黑曲霉 ZJUQH201217 接入种子培养基进行增殖 培养， 获得种子液 ； (2) 将种子液接入发酵培养基 进行发酵培养。本发明黑曲霉菌株产阿魏酸酯酶 活性。
3、高， 易于实现阿魏酸酯酶的工业化生产。 本发 明生产阿魏酸酯酶的工艺采用豆粕、 麦麸等粗原 料作为发酵原料， 该粗原料无需进行前处理， 生产 成本低。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 1/1 页 2 1. 一种黑曲霉菌株， 其特征在于， 命名为黑曲霉 (Aspergillus niger)ZJUQH2012147， 保藏编号为 CGMCC No.6152。 2. 如权利要求 1 所述的黑曲霉 ZJUQH2012147 。
4、在生产阿魏酸酯酶中的应用。 3. 如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (1) 将黑曲霉 ZJUQH2012147 接入种子培养基进行增殖培养， 获得种子液 ； (2) 将种子液接入发酵培养基进行发酵培养。 4.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述增殖培养的条件为 ： 温度为2530， 时间 100 200 小时。 5.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述发酵培养的条件为 ： 温度为2530， 时间为 100 200 小时。 6. 如权利要求 3 所述的应用， 其特征在于， 所述发酵培养为摇床振荡培养， 摇床转速为 100 200r/min。 7. 如权。
5、利要求 3 所述的应用， 其特征在于， 以 1L 体积计， 所述发酵培养基包括 ： 碳源 20 40g， 无机盐 5 10g， 氮源 5 20g， 所述碳源为豆粕、 麦麸、 玉米棒和玉米杆中的至少 一种。 8. 如权利要求 3 所述的应用， 其特征在于， 所述的氮源为蛋白胨、 硫酸铵、 酵母粉、 氯化 铵或硝酸钠。 权 利 要 求 书 CN 102796670 A 2 1/4 页 3 一种黑曲霉菌株及其应用 技术领域 0001 本发明属于发酵工程与生物技术领域， 尤其涉及一种高产阿魏酸酯酶的黑曲霉菌 株及其应用。 背景技术 0002 阿魏酸酯酶， 包括肉桂酸酯酶和肉桂酸水解酶， 是羧酸酯酶的一。
6、个亚类， 指能水 解阿魏酸甲酯、 低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键， 将阿魏酸游离出来的酶， 有利 于植物细胞壁的降解和多糖的释放。MackenzieC R 等于 1987 年在培养橄榄色链霉菌 (Streptomyces olivochromogenes) 时第一次观测到阿魏酸酯酶可以使麦麸释放阿魏酸。 从那以后， 人们认识到阿魏酸酯酶是半纤维素水解酶。研究表明真菌和细菌都能分泌阿魏 酸酯酶， 但到现在为止， 大多数的阿魏酸酯酶都是从真菌而不是细菌中分离的。 包含大量酯 化阿魏酸的复合碳源如去淀粉麦麸、 玉米皮、 啤酒糟和甜菜渣等最适合用来产生阿魏酸酯 酶。 在哺乳类动物的细胞中也检测到。
7、阿魏酸酯酶的活性， 但这些酶还没有被分离纯化， 蛋白 序列需要与微生物酶进一步的比较。用阿魏酸酯酶处理植物性原料在食品、 饲料和造纸等 工业中有着光明的前景。 0003 植物细胞壁是一个由多糖网络组成的三维结构图， 这些多糖包括纤维素， 半纤维 素， 木质素等， 它们之间通过羟基肉桂酸类酯键相连， 所以在植物细胞壁中存在大量的酚酸 化合物。 在食品工业通过阿魏酸酯酶降解植物细胞壁， 可以得到大量酚酸化合物。 酚酸化合 物由于具有强大的抗氧化功能， 已愈发的受到人们的关注， 尤其是阿魏酸， 它不仅可以作为 抗氧化剂， 还具有一些生理作用， 如抗血栓， 抗癌等， 同时它还可以作为合成香兰素的前体。。
8、 0004 在饲料工业中阿魏酸酯酶可以打破半纤维素和木质素之间相互的交联， 从而使细 胞壁的机构变得疏松， 可以作为添加剂加快动物对食物的降解速度， 同时还能加深动物对 饲料的利用程度， 减少营养物质的流失。 在造纸工业可以部分地去除木质素， 减少化学漂白 剂的使用量， 增加了纸浆的白度， 使纸的质量进一步提高。 0005 目前国内也有利用微生物发酵产阿魏酸酯酶的报道， CN102286442A 公开了利用烟 曲霉发酵生产阿魏酸酯酶， 并取得了一定效果， 但总体来说现有工艺产酶水平较低， 发酵原 料需要经过特殊的前处理， 对产酶微生物的发酵特性、 营养特性和发酵技术并未进行系统 的研究， 这也。
9、就限制了阿魏酸酯酶在实际工业中的应用。 因此探索酶活高、 安全的阿魏酸酯 酶产生菌显得很有必要， 具有极大的研究和开发价值。 发明内容 0006 本发明提供了一种黑曲霉菌株， 解决现有工艺产酶水平低， 发酵原料需经特殊前 处理的问题。 0007 一种黑曲霉菌株， 命名为黑曲霉 (Aspergillus niger)ZJUQH2012147， 该菌株已于 2012年05月23日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心 ( 简称为 CGMCC)， 保藏编号为 CGMCC No.6152。 说 明 书 CN 102796670 A 3 2/4 页 4 0。
10、008 该菌株属半知菌亚门， 丝孢纲， 丝孢目， 曲霉属， 在麦芽汁琼脂培养基 (MEA) 上 生长较快， 25黑暗条件下培养 7 天， 菌落直径 58-61mm， 质地绒状 ； 分生孢子头黑褐 色， 初期球形， 后期开裂， 菌落背面无任何色素 ； 菌株具有足细胞， 分生孢子梗高大， 宽 7.5-12.8m， 壁光滑， 顶囊球形， 大部分表面可育， 产孢结构双层， 分生孢子近球形， 浅到褐 色， 具小刺， 3.0-5.5m。未见有性孢子。 0009 本发明还提供了所述黑曲霉 ZJUQH2012147 在生产阿魏酸酯酶中的应用。 0010 具体可以包括以下步骤 ： 0011 (1) 将黑曲霉 Z。
11、JUQH2012147 接入种子培养基进行增殖培养， 获得种子液 ； 0012 (2) 将种子液接入发酵培养基进行发酵培养。 0013 培养条件影响菌株的繁殖能力以及产酶能力， 所述增殖培养条件选择为 ： 温度 25 30， 时间 100 200 小时 ； 更优选为， 温度 28， 时间 144 小时。 0014 所述发酵培养条件可以为 ： 温度 25 30， 时间 100 200 小时 ； 更优选为， 温度 28， 时间 120 小时。 0015 发酵完成后， 阿魏酸酯酶存在发酵液中， 通过常规酶分离方法即可实现分离纯化。 0016 所述发酵培养可以是摇床培养， 也可以是利用发酵罐工业化大规。
12、模培养， 当采用 摇床培养时， 摇床转速优选为 100 200r/min。 0017 以1L体积计， 所述发酵培养基包括 ： 碳源2040g， 无机盐510g， 氮源520g， 所述碳源为豆粕、 麦麸、 玉米棒和玉米杆中的至少一种， 优选为豆粕、 麦麸或它们的混合物。 该些复合碳源含有大量酯化阿魏酸， 适于生产阿魏酸酯酶。 0018 所述的氮源可以是有机氮源、 无机氮源或它们的混合物， 有机氮源可以选择蛋白 胨、 酵母粉或它们的混合物， 无机氮源可以选用铵盐， 如硫酸铵、 氯化铵、 硝酸钠等。 0019 无机盐主要包括细菌细胞生长所需的各种元素， 如 P、 Na、 K、 Mg、 Ca 等， 其。
13、用量可参 考常规细菌培养基的配方。 0020 最优选的， 所述发酵培养基选用如下任一培养基 ： 0021 培养基 1 ： 豆粕 35.0g， Na2HPO47H2O 4g， NaCl 0.2g， 蛋白胨 15g， MgSO47H2O 0.3g， CaCl20.05g， 蒸馏水 1000ml， pH 自然 ； 0022 培养基 2 ： 豆粕 20.0g， KH2PO4 3g， Na2HPO47H2O 6g， NaCl 0.1g， (NH4)2SO4 8g， MgSO47H2O 0.2g， CaCl2 0.05g， 蒸馏水 1000ml， pH 自然 ； 0023 培养基 3 ： 豆粕 20.0g。
14、， 麦麸 20.0g， KH2PO4 3g， Na2HPO47H2O 6g， NaCl 0.1g， 酵母 粉 8g， MgSO47H2O 0.2g， CaCl2 0.05g， 蒸馏水 1000ml， pH 自然。 0024 与现有技术相比较， 本发明有益效果为 ： 0025 (1) 本发明黑曲霉菌株产阿魏酸酯酶活性高， 易于实现阿魏酸酯酶的工业化生产。 0026 (2) 本发明生产阿魏酸酯酶的工艺采用豆粕、 麦麸等粗原料作为发酵原料， 该粗原 料无需进行前处理， 生产成本低。 0027 (3) 本发明对发酵工艺进行了系统优化， 取得了较理想的产酶效果。 具体实施方式 0028 一、 培养基 0。
15、029 种子斜面培养基 ： 马铃薯 200g， 葡萄糖 20g， 琼脂 20g， 蒸馏水 1000ml， pH 自然。 说 明 书 CN 102796670 A 4 3/4 页 5 0030 初筛培养基 ： KH2PO4 3g， Na2HPO47H2O 6g， NaCl 0.1g， 蛋白胨 8g， MgSO47H2O 0.2g， CaCl2 0.05g， 琼脂 20g， 蒸馏水 1000ml， 无菌的含阿魏酸甲酯的二甲基甲酰胺溶液 ( 质量体积比为 10 )0.3ml， pH 自然。 0031 复筛培养基 ： 豆粕 20g， KH2PO4 3g， Na2HPO47H2O 6g， NaCl 0.。
16、1g， 蛋白胨 8g， MgSO47H2O 0.2g， CaCl2 0.05g， 蒸馏水 1000ml， pH 自然。 0032 种子培养基 ： 马铃薯 200， 葡萄糖 20， 琼脂 20， 蒸馏水 1000ml， pH 自然。 0033 发酵培养基 ： 0034 培养基 1 ： 豆粕 35.0g， Na2HPO47H2O 4g， NaCl 0.2g， 蛋白胨 15g， MgSO47H2O 0.3g， CaCl2 0.05g， 蒸馏水 1000ml， pH 自然 ； 0035 培养基 2 ： 豆粕 20.0g， KH2PO4 3g， Na2HPO47H2O 6g， NaCl 0.1g， (N。
17、H4)2SO48g， MgSO47H2O 0.2g， CaCl2 0.05g， 蒸馏水 1000ml， pH 自然 ； 0036 培养基 3 ： 豆粕 20.0g， 麦麸 20.0g， KH2PO4 3g， Na2HPO47H2O 6g， NaCl 0.1g， 酵母 粉 8g， MgSO47H2O 0.2g， CaCl2 0.05g， 蒸馏水 1000ml， pH 自然。 0037 二、 菌株的分离纯化 0038 从造纸厂、 豆粕加工厂、 小麦地和酒厂的土壤样品中采集到 50 份样品先经增殖培 养基培养 120h， 稀释涂布于察氏培养基平板形成单菌落， 再挑选 50 个菌落点种于初筛培养 基上。
18、， 选择显示白色透明圈的菌落进行摇瓶复筛， 得到一株产酶活最高的菌株为 W1， 测定发 酵液阿魏酸酯酶活力 ( 此菌种 28培养 120 小时酶活达到 162.84U/L)。经 - 射线诱变 (剂量700Gy)， 分别稀释菌液10倍、 102倍、 103倍， 104倍、 105倍、 106倍， 然后涂布菌液于初筛 培养基， 培养适当时间， 挑选产生白色透明圈的菌落于摇瓶复筛 ( 采用复筛培养基培养 )， 培养 168 小时后测定阿魏酸酯酶酶活， 获得一株酶活最高菌株， 命名为 ZJUQH2012147， 其酶 活达到 213.07U/L。 0039 三、 菌株的鉴定 0040 上述分离的菌株为。
19、曲霉属， 自麦芽汁琼脂培养基 (MEA) 上生长较快， 25黑暗条 件下培养 7 天， 菌落直径 58-61mm， 质地绒状 ； 分生孢子头黑褐色， 初期球形， 后期开裂， 菌落 背面无任何色素 ； 菌株具有足细胞， 分生孢子梗高大， 宽 7.5-12.8m， 壁光滑， 顶囊球形， 大部分表面可育， 产孢结构双层， 分生孢子近球形， 浅到褐色， 具小刺， 3.0-5.5m。未见有 性孢子。测定的 28SrRNA D1D2 区序列如序列表 SEQ ID NO.1 所示。 0041 综合其菌落形态、 显微特征以及 rRNA 基因序列等实验数据综合分析， 可以鉴定为 黑曲霉， 并命名为黑曲霉 (As。
20、pergillus niger)ZJUQH2012147。该菌株已于 2012 年 05 月 23日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心 ( 简称为 CGMCC)， 保藏编号为 CGMCC No.6152。 0042 四、 菌株的发酵培养及阿魏酸酯酶酶活测定 0043 将黑曲霉 ZJUQH2012147 接种到种子培养基进行在 28下增殖培养 144h， 获取孢 子。将发酵培养基 ( 培养基 1、 培养 2 或培养基 3)30ml 盛于 250ml 三角瓶中， 接种生理盐 水冲洗的孢子 1ml( 孢子数约为 106个 /ml)， 28在旋转式摇。
21、床上培养 120h， 转速为 140r/ min。 0044 上述实施例中， 酶的提取及活性测定方法如下 ： 0045 将发酵步骤后所得的菌悬液置于低速离心机中 3000rpm 离心 30min， 取上清液即 说 明 书 CN 102796670 A 5 4/4 页 6 为粗酶液。用 pH6.0 柠檬酸盐缓冲液稀释一定倍数以测定酶活。用二次盐析的方法对粗酶 液进行初步纯化， 第一次加入硫酸铵浓度为 40， 4过夜后于 5000rpm 离心 30min， 取上 清， 再加入硫酸铵至70， 4过夜后再次于5000rpm离心30min， 所得沉淀即为初步纯化的 阿魏酸酯酶， 然后用 pH6.0 的柠。
22、檬酸盐缓冲液稀释， 4保存待用。 0046 阿魏酸酯酶的测定如下 ： 因底物阿魏酸甲酯不溶于水， 故用一级色谱纯甲醇溶解 并配制成 50mM。将其用 90ml、 0.1M 的 pH6.0 柠檬酸盐缓冲液稀释。取 2mL 稀释后的阿魏酸 甲酯溶液重新加热至 40， 加入 1mL 稀释 10 倍的酶液。混合物于 40下反应 30min， 再加 热至 100， 10min 后终止反应。反应混合物于室温冷却。以蒸馏水代替底物溶液体系为空 白对照。 0047 酶解反应后的阿魏酸产物采用 HPLC 法定量分析， 并在本试验中加以修改。实验中 所采用的高效液相色谱条件为 ： 采用乙腈和 0.5甲酸作为流动相。
23、， 使用前用 0.45m 微膜 过滤， 将过滤好的溶剂常温下超声波处理半小时脱气。经前期试验摸索确定色谱条件为 ： 流动相为乙腈和 0.5甲酸 ( 体积比 30 70)， C18 反相柱 (2504.6mm， 4m)， 检测温度 30， 进样量 10L， 检测波长 317nm。 0048 阿魏酸酯酶的酶活定义为在 40、 pH6.0 条件下， 每分钟水解底物阿魏酸甲酯产 生 1mol 阿魏酸所需要的酶量为一个酶活力单位。 0049 培养基 1 培养获得阿魏酸酯酶酶活为 138.3U/L， 培养基 2 培养获得阿魏酸酯酶酶 活为 116.9U/L， 培养基 3 培养获得阿魏酸酯酶酶活为 173.9U/L。 0050 李夏兰等(一株产阿魏酸酯酶青霉菌株的筛选、 鉴定及生产特征.微生物学通报， 2010， 37(11) ： 1588-1593.) 从腐烂的木质纤维中取样， 通过富集培养， 初筛和复筛得到一 株橘青霉， 其阿魏酸酯酶酶活最高达到 20.75U/L， 本发明专利所获得酶活要远远高于报道 的产酶菌株。 说 明 书 CN 102796670 A 6 1/2 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102796670 A 7 2/2 页 8 序 列 表 CN 102796670 A 8 。