《从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方法.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102796190 A (43)申请公布日 2012.11.28 CN 102796190 A *CN102796190A* (21)申请号 201210260866.7 (22)申请日 2012.07.26 C07K 14/465(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/18(2006.01) (71)申请人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 (72)发明人 马美湖 武小芬 邱宁 黄西 (74)专利代理机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 代理人 樊戎。
2、 (54) 发明名称 从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种从鸡蛋清中提取核黄素结 合蛋白的方法， 通过硫酸铵分级沉淀蛋白质， 然后 采用 DEAE-Toyopearl650M 阴离子交换层析进行 分离。 本发明获得的核黄素结合蛋白纯度高， 回收 率较好， 通过分级沉淀， 能去除蛋清中几乎所有的 卵黏蛋白及部分卵白蛋白和卵转铁蛋白， 降低了 蛋清粘度， 从而使后续的阴离子交换层析仅需采 用一种层析填料即可获得高纯度的核黄素结合蛋 白， 无需更换填料， 提高了填料的利用率， 同时还 简化了操作步骤， 缩短了提取时间。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明。
3、书 4 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一种从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 蛋清预处理 ： 向蛋清稀释液中加入核黄素， 使核黄素浓度为 3-3.5g/g， 得到饱和 核黄素的蛋清稀释液 ； （2） 提取核黄素结合蛋白 ： 向饱和核黄素的蛋清稀释液中加入硫酸铵， 使硫酸铵饱和度 为 55%， 搅拌后离心， 得到上清液， 向上清液中继续添加硫酸铵， 使硫酸铵饱和度为 85%， 搅 拌后离心， 得到沉淀， 将沉淀用少量水溶解， 透析后冷冻。
4、干燥， 即为核黄素结合蛋白粗品 ； （3） 分离纯化 ： 将核黄素结合蛋白粗品用 pH 值为 6.5、 浓度为 0.1mol/L 的磷酸钠缓冲 液配制成浓度为 20mg/mL， 用 DEAE-Toyopearl 色谱柱分离， 用含 0.25mol/L 氯化钠的 pH 值 为 6.5、 浓度为 0.1mol/L 的磷酸钠缓冲液洗脱， 洗脱液用蒸馏水透析后冷冻干燥获得成品。 2. 如权利要求 1 所述的从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方法， 其特征在于， 所述蛋 清稀释液是由鸡蛋清与等体积水组成。 权 利 要 求 书 CN 102796190 A 2 1/4 页 3 从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方。
5、法 技术领域 0001 本发明涉及蛋白质分离纯化技术领域， 具体涉及一种从鸡蛋清中提取核黄素结合 蛋白的方法。 背景技术 0002 研究发现鸡蛋中含有大量生物活性成分， 如卵转铁蛋白、 免疫球蛋白、 卵粘蛋白、 溶菌酶等。核黄素结合蛋白 (riboflavin binding protein， RBP) 又叫卵黄素蛋白或核黄 素转运蛋白， 可结合和转运核黄素 （维生素B2） ， 在鸡胚胎发育过程中发挥着重要的作用。 此 外， 核黄素结合蛋白还具有多种生理功能， 如作为毛细管电泳和高效液相色谱手性选择物、 甜味和苦味抑制剂、 储存和转运铜离子等。 因此， 核黄素结合蛋白在食品和医药行业具有广 阔。
6、的应用前景。 0003 1958 年 Rhodes 等采用 DEAE-Cellulose 和 CM-Cellulose 离子交换层析第一次 从蛋清中分离获得核黄素结合蛋白。此后多种方法应用于蛋清核黄素结合蛋白的分离纯 化， 如 Miller 等采用盐沉淀和多步离子交换层析从蛋清中分离该蛋白 ； Piskarev 等人采用 盐沉淀和有机溶剂沉淀进行粗提， 阳离子交换 （TSK SP-5P） 高效液相色谱制备获得核黄素 结合蛋白 ； 李永茂等采用 DE-32 纤维素离子交换层析、 CM-Sephadex C-25 阳离子交换层析 和 Sephadex G-100 凝胶过滤也从蛋清中纯化获得了该蛋白。
7、。但这些工艺均需采用多步层 析， 在各步层析之间需要更换缓冲液或对溶液进行浓缩， 操作复杂， 工艺耗时漫长， 可达 35 天。此外， 在分离过程中， 每一步骤的操作都将不可避免地导致目标蛋白不同程度的损失， 由于操作步骤繁多， 因此产品得率很低， 一般仅为 30% 以下。 0004 蛋清因含卵粘蛋白使其具有较高粘度， 直接进行离子交换层析会影响填料的使用 寿命与分离效果， 而核黄素结合蛋白仅占蛋清蛋白质的 0.8%， 因此必须采用适当的工艺对 鸡蛋清进行前处理和初步分离， 才能使一步层析纯化核黄素结合蛋白成为可能。 发明内容 0005 本发明针对目前核黄素结合蛋白分离纯化中存在的问题， 采用硫。
8、酸铵盐析技术对 鸡蛋清溶液进行处理， 获得富含核黄素结合蛋白的组分， 并进一步使用阴离子交换层析技 术对其进行纯化， 从而实现了核黄素结合蛋白的提取。具体技术方案如下 ： 一种从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方法， 包括以下步骤 ： （1） 蛋清预处理 ： 向蛋清稀释液中添加核黄素， 使核黄素浓度达到 3-3.5g/g， 得到饱 和核黄素的蛋清稀释液 ； （2） 提取核黄素结合蛋白 ： 向饱和核黄素的蛋清稀释液中， 加入硫酸铵使其饱和度为 55%， 搅拌后离心， 得到上清液， 向上清液中继续添加硫酸铵使其饱和度为 85%， 搅拌后离心， 得到沉淀， 将沉淀用少量水溶解， 用水透析后冷冻干燥， 即。
9、为核黄素结合蛋白粗品 ； （3） 分离纯化 ： 将核黄素结合蛋白粗品用 pH 值为 6.5、 浓度为 0.1mol/L 的磷酸钠缓冲 液配制成浓度 20mg/mL， 用 DEAE-Toyopearl 色谱柱分离， 用含 0.25mol/L 氯化钠的 pH 值为 说 明 书 CN 102796190 A 3 2/4 页 4 6.5、 浓度为 0.1mol/L 的磷酸钠缓冲液洗脱， 洗脱液用蒸馏水透析后冷冻干燥获得成品。 0006 所述蛋清稀释液是将鸡蛋清与等体积水组成。 0007 本发明的有益效果是 ： 1、 本发明采用硫酸铵盐析法提取核黄素结合蛋白， 通过分级沉淀， 能去除蛋清中几乎 所有的卵。
10、黏蛋白及部分卵白蛋白和卵转铁蛋白， 降低了蛋清粘度， 从而使后续的阴离子交 换层析仅需采用一种层析填料即可获得高纯度的核黄素结合蛋白， 无需更换填料， 提高了 填料的利用率， 同时还简化了操作步骤， 缩短了提取时间 ； 2、 本发明提取的核黄素结合蛋白产品纯度高， 回收率好。 附图说明 0008 图 1 为不同饱和度 (NH4)2SO4对核黄素结合蛋白盐析效果的影响试验结果图 ； 图 2 为不同 PH 值的磷酸钠缓冲液离子交换层析图谱 ； 图 3 为不同 PH 值的磷酸钠缓冲液层析后各洗脱峰样品的的 SDS-PAGE 电泳图 ； 图 4 为不同浓度的磷酸钠缓冲液离子交换层析图谱 ； 图 5 为。
11、不同浓度的磷酸钠缓冲液层析后各洗脱峰的 SDS-PAGE 电泳图 ； 图 6 为不同浓度 NaCl 洗脱对核黄素结合蛋白纯化效果的影响 ； 图 7 为不同上样量对核黄素结合蛋白纯化回收率和纯度影响试验结果图 ； 图 8 为核黄素结合蛋白样品 （A） 和其标准品 （B） 的高效液相色谱图。 具体实施方式 0009 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。 0010 实施例 1 一种从鸡蛋清中提取核黄素结合蛋白的方法， 包括以下步骤 ： 1、 蛋清预处理 ： （1） 将新鲜的鸡蛋打蛋， 使用蛋黄分离器分离蛋清和蛋黄， 收集蛋清 ； （2） 取 500g 蛋清， 边搅拌边向蛋清中加入等体。
12、积的蒸馏水稀释 ； . （3） 添加浓度为 25g/mL 核黄素溶液 125mL 使核黄素结合蛋白结合核黄素达饱和状 态， 磁力搅拌 30min， 得到饱和核黄素的蛋清稀释液。 0011 2、 提取核黄素结合蛋白 ： 向饱和核黄素的蛋清稀释液中分别添加 (NH4)2SO4至饱和度为 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%， 搅拌1h， 4、 10000 r/min离心30min。 将沉淀用蒸馏水溶解后 透析 24h（更换 4 次透析水） ， 定容至 1250mL， 以相同条件离心， 取上清液于 455nm 处测吸光 值， 以蒸。
13、馏水为空白， 结果如图 1 所示。 0012 由图 1 可知， 核黄素结合蛋白主要存在于 55%85% 的 (NH4)2SO4沉淀中， 因此通过 55%/85% 两步盐析可以较大程度地保留核黄素结合蛋白， 同时去除大部分的卵白蛋白、 卵转 铁蛋白和几乎所有的卵粘蛋白， 利于后续试验的顺利开展。 0013 3、 分离纯化 ： DEAE-Toyopearl 650M （70mL） 预先用磷酸钠缓冲液平衡。 取一定质量盐析冻干粗品， 用 pH 值为 6.5、 浓度为 0.1mol/L 的磷酸钠缓冲液配制成浓度 20mg/mL， 采用恒流泵注入 200mL 说 明 书 CN 102796190 A 4。
14、 3/4 页 5 于离子交换柱 （1.6cm40cm） 中。 磷酸钠缓冲液冲洗去除与填料未结合的蛋白， 至280nm处 吸光值基线趋于平稳， 再用含 0.25mol/L 氯化钠的 pH 值为 6.5、 浓度为 0.1mol/L 的磷酸钠 缓冲液洗脱， 最后用含 1mol/L NaCl 的磷酸钠缓冲液进行填料再生， 流速均为 1mL/min。收 集洗脱峰对应洗脱液， 蒸馏水透析 24h（更换 4 次透析水） 后， 冷冻干燥获得核黄素结合蛋 白。 0014 实施例 2 阴离子交换层析纯化条件的确定 1、 缓冲液 pH ： 0.05mol/L 磷酸钠缓冲液， pH 值分别为 4.5、 5.5 和 6。
15、.5， 上样量 50mL。不 同 pH 层析效果如图 2 所示， 各洗脱峰对应的电泳条带如图 3 所示。由图 3 可知， A-a、 B-a 和 C-a 样品的分子量在 35 kDa80 kDa 之间， 主要为卵转铁蛋白和卵清蛋白 ； A-b、 B-b 和 C-b 样品的分子量约为 38 kDa， 应为卵清蛋白 ； A-c、 B-c 和 C-c 样品的分子量约为 28 kDa， 与核黄素结合蛋白的一致， 为目标蛋白。由上分析可知， pH4.5、 5.5、 6.5 图中峰 a、 b 主要为 卵转铁蛋白 (OTf) 和卵白蛋白 (OVA)、 峰 c 为核黄素结合蛋白。根据层析图峰型分析得出， 随 p。
16、H 升高， 峰 b 面积逐渐减小， 峰 c 面积增加， 说明随 pH 升高， 填料对 OTf 和 OVA 结合能力 减弱， 对核黄素结合蛋白结合能力增强。据 Becvar 等人报道， 通过测定核黄素饱和核黄素 结合蛋白 （Holo-RBP） 在 276nm 和 455nm 吸光度的比值 (A276/A455) 可判定 Holo-RBP 样品 的相对纯度， 比值越小表明样品纯度越高， 对A、 B、 C图中峰c对应的洗脱液进行紫外扫描测 得A276/A455比值分别为6.74、 7.03和5.17， 可知缓冲液pH值为6.5时， 样品纯度最高， 故 缓冲液 pH 值选择 6.5 为宜。 0015 。
17、2、 缓冲液浓度 ： 磷酸钠缓冲液浓度分别为 0.05mol/L 和 0.1mol/L， 上样量 50mL。 图 4 中 A、 B 分别为 0.05mol/L、 0.1mol/L 磷酸钠缓冲液离子交换层析图谱， 由图可知， 采用 0.05mol/L 缓冲液时出现了两个洗脱峰 A-b 和 A-c， 而采用 0.1mol/L 缓冲液时仅有一个洗 脱峰 B-c。对各峰样品进行 SDS-PAGE 电泳分析， 结果如图 5 所示。由图分析可知， 峰 A-c 和 B-c 分子量约 28 kDa， 与核黄素结合蛋白分子量一致， 且两个样品均显示为单一条带， 表明纯度均较高。进一步 A-c 和 B-c 样品溶。
18、液进行紫外扫描， 得 A276/A455比值分别为 5.26 和 4.84， 说明采用 0.1mol/L 缓冲液层析分离获得样品的纯度较高。以上结果表明， 采用 0.1mol/L 缓冲液冲洗时， 分离的核黄素结合蛋白纯度更高， 且高浓度的缓冲液具有较高的 缓冲能力， 可减少平衡所需要的时间。因此， 缓冲液浓度以选择 0.1mol/L 为宜。 0016 3、 NaCl 洗脱液浓度 ： 上样量均为 50mL， 分别采用 0.05mol/L、 0.10mol/L、 0.15mol/ L、 0.20mol/L、 0.25mol/L、 0.30mol/L NaCl 进行洗脱。对不同浓度 NaCl 洗脱层。
19、析图谱和目 标洗脱峰溶液进行分析， 计算目标洗脱峰的峰面积并计算其溶液的 A276/A455比值， 结果如图 6 所示 ： 随着 NaCl 浓度升高， 洗脱获得样品量增加， 当浓度上升至 0.25mol/L 时洗脱峰面积 不再变化。此外， 随着 NaCl 浓度升高， 洗脱获得样品 A276/A455比值呈下降趋势， 说明高浓度 盐洗脱获得产物的纯度较高， 可能是由于使用低浓度 NaCl 可将少量杂蛋白全部洗脱下来， 却只能洗脱部分核黄素结合蛋白， 导致分离获得样品中核黄素结合蛋白的相对含量降低， 从而导致其纯度降低。 当NaCl浓度达0.25mol/L时， 样品纯度和峰面积基本不再发生变化。 。
20、因此， NaCl 洗脱浓度以选择 0.25mol/L 为宜。 0017 4、 上样量 ： 分别设置上样量为 50mL、 100mL、 150mL、 200mL、 250mL、 300mL、 350mL、 400mL， 对不同上样量下的洗脱层析图谱和目标洗脱峰溶液进行分析， 计算目标洗脱峰的峰 面积并计算其溶液的 A276/A455比值， 结果如图 7 所示。由图分析可知， 上样量 200mL， 产品 说 明 书 CN 102796190 A 5 4/4 页 6 回收率基本处于 55% 左右， 当上样量 200mL， 样品回收率快速下降， 说明随着上样量的增 加， 填料对核黄素结合蛋白结合效率下。
21、降。 此外， 上样量200mL， A276/A455比值稍有升高， 当 上样量200mL， A276/A455比值也急剧增大， 说明样品的纯度降低。 因此， 上样量以选择200mL 为宜。 0018 5、 SDS- 聚丙酰胺凝胶电泳鉴定 ： 浓缩胶浓度 5%， 分离胶浓度 12%。样品 (2mg/mL) 溶于上样缓冲液， 上样量10L， 浓缩胶电泳恒压80V， 分离胶电泳恒压120V。 凝胶用50%乙 醇和 10% 冰醋酸固定 30min， 0.1% 考马斯亮蓝 R-250 染色 30min， 温度 40， 25% 乙醇和 8% 冰醋酸混合液进行脱色。 0019 实施例 3 核黄素结合蛋白纯度。
22、测定及回收率计算 1、 蛋白质产品纯度测定 核黄素结合蛋白样品和标准品浓度均为 1mg/mL， 色谱柱为赛分 SRT SEC-300 柱 (4.6mm300mm， 5m)， 柱温 25， 流动相为 0.15mol/L 磷酸钠 pH 7.0 缓冲液， 流速 0.4mL/ min， 进样量 10L， 运行时间 15min， 检测波长 280nm。结果如图 8 所示。其中 A 为本试验分 离获得的核黄素结合蛋白样品的高效液相色谱图， B 为核黄素结合蛋白标准品的高效液相 色谱图， 由图可知， 样品与标准品保留时间一致， 进一步说明了获得的蛋白确为核黄素结合 蛋白。进一步由软件对峰面积进行积分， 根据。
23、峰面积比对核黄素结合蛋白产品纯度进行定 量计算， 计算结果为 95.32%。 0020 2、 蛋白质产品中的蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白含量。分离获得的蛋白产品中的蛋白含量测定结果 为 42.99%。 0021 3、 回收率计算 根据从100 g鸡蛋清中纯化所得核黄素结合蛋白的质量、 蛋白含量和纯度， 使用以下公 式计算所得的各个蛋白质的回收率， 。 0022 100g 蛋清分离获得核黄素结合蛋白的样品干重为 112mg， 样品蛋白含量为 42.99%， 蛋白纯度为 95.32%， 因此计算获得纯核黄素结合蛋白质量为 45.89 mg ； 蛋清中蛋 白质理论含量约为 。
24、10%， 核黄素结合蛋白占蛋清蛋白质 0.8%， 因此 100g 蛋清中总核黄素结 合蛋白含量为 80 mg， 计算可得核黄素结合蛋白回收率高达 57.36%。 0023 综上所示， 采用本发明所述的从鸡蛋清中高效提取多种蛋白质的方法， 获得了较 好的回收率， 产品纯度高。 说 明 书 CN 102796190 A 6 1/4 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102796190 A 7 2/4 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102796190 A 8 3/4 页 9 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102796190 A 9 4/4 页 10 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102796190 A 10 。