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1、(10)申请公布号 CN 103038361 A (43)申请公布日 2013.04.10 CN 103038361 A *CN103038361A* (21)申请号 201180024021.1 (22)申请日 2011.05.13 1050473-6 2010.05.14 SE C12Q 1/48(2006.01) C12N 9/12(2006.01) (71)申请人 P斯托尔汉德斯克 地址 瑞典克尼夫斯塔 申请人 J伦纳斯特兰德 (72)发明人 P斯托尔汉德斯克 J伦纳斯特兰德 (74)专利代理机构 永新专利商标代理有限公司 72002 代理人 左路 林晓红 (54) 发明名称 试剂盒和。
2、方法 (57) 摘要 本发明涉及包含 DNA 依赖性 DNA 聚合酶和 至少一种天然的脱氧核苷的试剂盒， 并涉及包含 DNA 依赖性 DNA 聚合酶和检测系统的试剂盒， 所 述检测系统包含 DNA 模板分子、 DNA 引物分子和 荧光部分， 所述荧光部分能够被置换出或能够结 合至所述 DNA 依赖性聚合酶合成的 dsDNA。其还 涉及用于测量样品中脱氧核糖核苷激酶活性的方 法， 其特征在于 ； (i) 使样品在容器中与反应混合 物接触， 所述反应混合物包含 DNA 依赖性 DNA 聚 合酶、 至少一种脱氧核糖核苷和检测系统， 所述检 测系统包含DNA模板分子、 DNA引物分子和荧光部 分， 所。
3、述荧光部分能够掺入所述 DNA 依赖性聚合 酶合成的dsDNA、 从所述DNA依赖性聚合酶合成的 dsDNA 中被置换出或结合至所述 DNA 依赖性聚合 酶合成的 dsDNA ； (ii) 孵育所述容器 ； (iii) 测量 来自所述荧光部分的信号 ； 和使来自所述荧光部 分的信号与所述样品中的脱氧核糖核苷激酶活性 相关联。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.11.14 (86)PCT申请的申请数据 PCT/SE2011/050605 2011.05.13 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/142719 EN 2011.11.17 (51)Int.Cl.。
4、 权利要求书 2 页 说明书 22 页 序列表 4 页 附图 13 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 22 页 序列表 4 页 附图 13 页 1/2 页 2 1. 包含 DNA 依赖性 DNA 聚合酶和至少一种天然的脱氧核糖核苷的试剂盒。 2.包含DNA依赖性DNA聚合酶和检测系统的试剂盒， 所述检测系统包含DNA模板分子、 DNA引物分子和荧光部分， 所述荧光部分能够从所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA中被置 换出或结合至所述 DNA 依赖性聚合酶合成的 dsDNA。 3. 权利要求 1 或 2 的试剂盒， 还包含至少一种磷酸转。
5、移酶。 4.权利要求1至3中任一项的试剂盒， 还包括至少一种天然的或修饰的脱氧核糖核苷。 5. 权利要求 1 至 4 中任一项的试剂盒， 其中所述至少一种天然的脱氧核糖核苷选自脱 氧胸苷和 / 或脱氧胞苷或其混合物。 6. 权利要求 1 至 5 中任一项的试剂盒， 其中所述至少一种修饰的脱氧核糖核苷选自修 饰的胸苷和修饰的胞苷， 例如 BrdU 和 / 或 IdU， 或其混合物。 7. 权利要求 1 至 6 中任一项的试剂盒， 其中所述荧光部分偶联至单链 DNA 探针。 8. 权利要求 7 的试剂盒， 其中所述荧光部分和一猝灭部分偶联至单链 DNA 探针。 9. 权利要求 2 至 6 中任一项。
6、的试剂盒， 其中所述荧光部分是双链 DNA 表面结合或嵌入 分子， 例如 PicoGreen、 Eva 染料或 SYBR GreenI。 10.权利要求7或8的试剂盒， 其中结合至所述单链DNA探针的荧光部分在所述探针处 于其完整形式时是猝灭的。 11. 权利要求 9 的试剂盒， 其中所述 DNA 依赖性 DNA 聚合酶具有 5 至 3 核酸外切酶活 性， 例如 Taq DNA 聚合酶或 Tth 聚合酶。 12.权利要求7或8的试剂盒， 其中结合至所述单链DNA探针的荧光部分当处于其完整 形式并杂交至其靶模板时达到最大荧光。 13. 用于测量样品中脱氧核糖核苷激酶活性的方法， 其特征在于 ： 。
7、a.使样品在容器中与反应混合物接触， 所述反应混合物包含DNA依赖性DNA聚合酶、 至 少一种脱氧核糖核苷和检测系统， 所述检测系统包含 DNA 模板分子、 DNA 引物分子和荧光部 分， 所述荧光部分能够掺入所述 DNA 依赖性聚合酶合成的 dsDNA、 从所述 DNA 依赖性聚合酶 合成的 dsDNA 中被置换出或结合至所述 DNA 依赖性聚合酶合成的 dsDNA ； b. 孵育所述容器 ； c. 测量来自所述荧光部分的信号 ； d. 使来自所述荧光部分的信号与所述样品中的脱氧核糖核苷激酶活性相关联。 14. 权利要求 13 的方法， 其中所述至少一种脱氧核糖核苷是天然的或修饰的脱氧核糖 。
8、核苷或其混合物。 15.权利要求13或14中任一项的方法， 其中所述至少一种天然脱氧核糖核苷选自脱氧 胸苷和 / 或脱氧胞苷或其混合物。 16.权利要求13或14中任一项的方法， 其中所述至少一种修饰的脱氧核糖核苷选自修 饰的胸苷和修饰的胞苷， 例如 BrdU 和 / 或 IdU， 或其混合物。 17. 权利要求 13 至 16 中任一项的方法， 其中所述荧光部分偶联至单链 DNA 探针。 18. 权利要求 13 至 17 中任一项的方法， 其中所述荧光部分和一猝灭部分偶联至单链 DNA 探针。 19.权利要求13至16中任一项的方法， 其中所述荧光部分是双链DNA表面结合或嵌入 分子， 例如。
9、 PicoGreen、 Eva 染料或 SYBR Green I。 权 利 要 求 书 CN 103038361 A 2 2/2 页 3 20.权利要求13至18中任一项的方法， 其中结合至所述单链DNA探针的荧光部分在所 述探针处于其完整形式时是猝灭的。 21. 权利要求 20 的方法， 其中所述 DNA 依赖性 DNA 聚合酶具有 5 至 3 核酸外切酶活 性， 例如 Taq DNA 聚合酶或 Tth 聚合酶。 22.权利要求17或18的方法， 其中结合至所述单链DNA探针的荧光部分当处于其完整 形式并杂交至其靶模板时达到最大荧光。 权 利 要 求 书 CN 103038361 A 3 1。
10、/22 页 4 试剂盒和方法 技术领域 0001 本发明涉及实时地均质(即非固相)测定样品中的一或几种脱氧核糖核苷激酶的 试剂盒和方法， 其用于诊断疾病、 失调、 感染 ( 病毒性和细菌性 ) 或癌症。 0002 发明背景 0003 脱氧核糖核苷激酶 0004 真核细胞中存在至少三种脱氧核糖核苷激酶， 胸苷激酶1和2(TK1和TK2)、 脱氧胞 苷激酶 (dCK) 和脱氧鸟苷激酶 (dGK)。 0005 存在着编码两种不同胸苷激酶的两种人类基因座。 可以在细胞的胞浆中发现胸苷 激酶。胸苷激酶 2 定位于线粒体并参与线粒体 DNA 合成。TK2 具有与胸苷激酶 1 不同的氨 基酸序列、 底物特异。
11、性和表达谱。 0006 从细胞周期的 G1 期末期开始和贯穿 S 期， 胸苷激酶 1 的活性最为明显。TK 和 dCK 负责通过补救途径调节细胞中的 TTP 和 dCTP 池。所述 TK 酶在三磷酸腺苷 (ATP) 的存在下 催化胸苷向单磷酸胸苷 (TMP) 转化。 0007 在整个细胞周期都发现脱氧胞苷激酶的活性， 并且主要在淋巴来源的细胞中鉴定 到其活性。TK2 定位于线粒体中并与 dCK 具有对 dC 几乎相等的亲和力。 0008 疾病的诊断 0009 在 20 世纪 80 年代早期， 表明胸苷激酶活性不仅可以从受各种肿瘤疾病影响的患 者的血清中检测到， 而且与健康人类个体 ( 其中通常。
12、表现出非常低的 TK 活性 ) 有广泛的差 异。 0010 目前广泛接受使用 TK 作为血液癌症疾病诊断和预后的单一肿瘤标记物。在某些 情况下， TK 已显示出直接的诊断能力。 0011 TK和其他脱氧核糖核苷激酶的活性早已与疾病相关联， 这由Eriksso等人(2002) 和由 Topolcan 与 Holubec(2008) 在综述中有所总结。 0012 已将 TK2 和线粒体疾病相联系。 0013 检测脱氧核糖核苷激酶的测定 0014 放射性底物， 如 3H- 胸苷， 已被广泛用于在过滤结合测定中确定 TK 和 dCK 的活性。 对于常规的临床诊断， 基于放射性的测定不是个有吸引力的选择。
13、。 0015 在最近几年中， 已作过几种尝试以开发不基于放射性的测定， 所有这些测定在一 个方面或其他方面更好。以下是在不同的脱氧核糖核苷激酶的检测中所使用的一组方法、 测定和试剂组合物。 0016 在 EP1385005 中， 提出基于叠氮胸苷 (AZT) 的竞争性单磷酸化的不基于放射性的 TK 活性测定。这项技术已由 Diasorin S.r.l. 进一步开发成自动的两步骤的 发光诊断测定。在该两步的测定中， 首先由样品中存在的 TK 将 AZT 磷酸化为单磷酸化的 AZTMP。接着从缀合至异氨基苯二酰肼 (AZTMP ABEI) 的 AZTMP 检测发光， 所述缀合至异氨 基苯二酰肼的 。
14、AZTMP 与固体表面底物上的 TK 磷酸化 AZTMP 竞争结合抗 AZTMP 抗体。该两 步骤测定的主要缺点是动态读取受限。另一缺点是使用修饰的核苷底物代替天然的胸苷。 说 明 书 CN 103038361 A 4 2/22 页 5 0017 在 WO2009/063254 中公开了通过使用单磷酸化的 Br-dU 的用于确定样品中 TK 活 性的半均质方法， 所述单磷酸化的 Br-dU 通过 HPLC 分离并通过 UV 检测。该方法的缺点是 用修饰的底物进行所述反应和以分离步骤进行检测。 0018 US2008/248472 公开了固相测定， 其通过试剂混合物中的脱氧核糖核苷激酶互补 样品。
15、中 TK 活性以产生 Br-dUTP( 天然 TTP 的衍生物 )。随后使用 RNA 依赖的 DNA 聚合酶通 过引物延伸掺入所述 Br-dUTP。固相结合的 RNA 模板由单体 rA 建成， 长 200-400 个单体， 并被连至固相。在 ELISA 中使用碱性磷酸酶缀合的抗 BrdU 抗体在第二步骤检测掺入的 BrU来最终确定TK活性。 用许多手动交互步骤进行这个两步骤的测定是繁琐的并且执行 所述测定花费过长的时间。 0019 尚未提出用于测量样品中 dCK 活性的可靠的检测。 0020 附图简述 0021 图 1 显示了产生 TTP 和 dCTP 的补救途径 0022 图 2 显示了根据。
16、本发明的方法的检测系统 2 的原理 0023 图 3 显示了根据本发明的方法的检测系统 3 的原理 0024 图 4 显示了根据本发明的方法的检测系统 1 的原理 0025 图 5 通过实时荧光捕获获得的荧光曲线获得实施例 3 的 hrTK1 标准点的阈值水平 Ct。 0026 图 6 实施例 3 的 hrTK1 标准点的平均 Ct 值在对数标度上的线性回归。 0027 图 7 实施例 4 的 hrdCK 标准点的平均 Ct 值在对数标度上的线性回归。 0028 图 8 实施例 7 多重 hrTK1 与 hrdCK 在对数标度上的线性回归。 0029 图 9 犬血清样品中的 TK1 测量和实施。
17、例 8 中使用的 hrTK1 标准点在对数标度上的 线性回归。 0030 图 10 通过实时荧光捕获获得的线性归一化的荧光曲线获得实施例 9 的阈值水平 Ct。 0031 图 11 实施例 9 的致病性犬血清和 hrTK1 标准点的平均 Ct 值在对数标度上的线性 回归。 0032 图12通过实时荧光捕获获得的线性和动态管归一化的荧光获得实施例10的阈值 水平 Ct。 0033 图 13 实施例 10 的 hrTK1 标准点的平均 Ct 值在对数标度上的线性回归。 0034 定义 ： 0035 本说明书中的所有术语和词语应当按照其正常含义和在相关领域中的使用来解 释。为了明确起见， 以下更具体。
18、地讨论一些术语。 0036 除非另有说明， 在整个发明中互换地使用胸苷和脱氧胸苷。 0037 均质测定是非固相测定， 其在延伸引物 - 模板系统时产生信号， 需要最少的引物 延伸后操作。这些测定无需分离步骤。所述反应完全在溶液中发生， 没有珠或固相附着 干扰低亲和力的相互作用。均质测定方法对药物发现中所需的通量和测定小型化是必要 的。在任何均质测定中， 在测量过程中存在所述测定的所有组分。排除分离步骤是这些测 定方法的主要优点， 但由于测定成分的非特异性测量这也存在困难 ( 来源 ： http:/www. 年 4 月 28 日检索 )。 说 明 书 CN 103038361 A 5 3/22。
19、 页 6 0038 脱氧核糖核苷是包括连接至五碳糖脱氧核糖的含氮碱基的分子。 脱氧核糖核苷通 常被简单地称为结合至脱氧核糖的碱基。 天然的脱氧核糖核苷被定义为未修饰的脱氧核糖 核苷。这些的实例包括胞苷、 尿苷、 腺苷、 鸟苷、 胸苷和肌苷。 0039 天然的脱氧核糖核苷是在野生型活生物体(如人类)中存在的形式的脱氧核糖核 苷。 0040 修饰的脱氧核糖核苷也称为核苷类似物， 是在葡基胺或核酸碱基 (nucleobase) 上有任何种类修饰的脱氧核糖核苷。在医药中， 几种核苷类似物用作抗病毒剂或抗癌剂。 修饰的脱氧核糖核苷的实例是叠氮胸苷 (AZT)、 溴 - 脱氧尿苷 (Br-dU)、 碘 -。
20、 脱氧尿苷、 乙烯 基 - 脱氧胸苷和氟 - 脱氧尿苷。 0041 DNA 依赖性 DNA 聚合酶是催化脱氧核糖核苷三磷酸以单链 DNA 为模板组装为脱氧 核糖核酸的酶。在一些文献中， DNA 依赖性 DNA 聚合酶也可称为 DNA 指导的 DNA 聚合酶。 0042 DNA依赖性DNA聚合酶可以具有三种不同的酶活性 ： (a)5至3聚合酶活性， 在模 板 DNA 指导下催化由脱氧核糖核苷 5- 三磷酸产生的单核苷酸单元添加至引物链的 3- 羟 基末端 ； (b) 仅在双链体 DNA 上的 5 至 3 核酸外切酶的活性 ； (c) 主要在单链 DNA 上有活 性的 3 至 5 核酸外切酶， 其。
21、可以选择性地去除不匹配的末端核苷酸。注意除 DNA 聚合酶 I 外， Taq DNA 聚合酶和来自 Thermus thermofilus 的 Tth 聚合酶是至今鉴定的仅有的具有 5 3 核酸外切酶活性的 DNA 依赖性聚合酶。 0043 DNA 模板分子是作为 DNA 依赖性 DNA 聚合酶的模板的 ssDNA 分子。 0044 DNA 引物分子是短的 DNA 分子， 其与 DNA 模板分子的区段互补并作为 DNA 依赖性 DNA 聚合酶的 DNA 聚合的引物。 0045 完整的形式 ： 当本发明中所使用的 DNA 探针是根据本发明进行的任何聚合酶反应 之前的形式时， 称其为完整的形式。 。
22、0046 补救合成途径示于图 1， 是合成 TTP 和 dCTP 的途径之一。 0047 TTP 和 dCTP 是胸苷和脱氧胞苷的相应的脱氧核糖核苷三磷酸。这些首先通过在 脱氧核糖核苷激酶的帮助下从例如 ATP 转移一个磷酸基团 ( 会产生相应的单磷酸 TMP 或 dCMP) 来产生。 0048 dTMP激酶和胞嘧啶核苷酸(cytidylate)激酶催化形成相应的二磷酸核苷， TDP和 dCDP。 0049 核苷二磷酸激酶转变二磷酸盐为最终的三磷酸核苷。 0050 RNA 依赖性 DNA 聚合酶是催化脱氧核糖核苷三磷酸在第一链合成过程中以单链 RNA 为模板组装为脱氧核糖核酸的酶。 0051 。
23、所用的缩写 0052 ATP 腺苷 5- 三磷酸 0053 AZTMP 叠氮 - 胸苷单磷酸 0054 BrdU 溴脱氧尿苷 0055 dCDP 脱氧胞苷二磷酸 0056 dCK 脱氧胞苷激酶 ： EC 2.7.1.21 ； ATP: 胞苷 -5- 磷酸转移酶 0057 dCMP 脱氧胞苷单磷酸 0058 dCMPK 胞嘧啶核苷酸激酶 ： EC 2.7.4.14 ； ATP:dCMP 磷酸转移酶 说 明 书 CN 103038361 A 6 4/22 页 7 0059 dsDNA 双链 DNA 0060 hrdCK 人重组脱氧核糖核苷激酶 0061 hrTK1 人重组胸苷激酶 1 0062 M。
24、MX MasterMix 无样品的试剂混合物 0063 NdPK 核苷二磷酸激酶 ： EC 2.7.4.6 ； ATP: 核苷二磷酸磷酸转移酶 0064 hrTK1 人重组胸苷激酶 1 0065 ssDNA 单链 DNA 0066 TDP 脱氧胸腺嘧啶二磷酸 0067 TK 胸苷激酶 ： EC 2.7.1.21 ； ATP: 胸苷 -5- 磷酸转移酶 0068 TMPK dTMP 激酶 ： EC 2.7.4.9 ； ATP:TMP 磷酸转移酶 0069 TMP 脱氧胸苷单磷酸 0070 发明概述 0071 本发明旨在提供用于检测脱氧核糖核苷激酶活性的通用的和改进的方法和试剂 盒。本发明人已发现。
25、仍有基于活性的脱氧核糖核苷激酶活性测定试剂盒和方法的需要， 所 述试剂盒和方法不仅可以检测样品中的 TK， 也可以用于 dCK 测试 ( 例如在癌症治疗中监测 药物抗性的发展 )， 并且其在性能上是稳健的、 快速、 简单、 用户友好而且对临床使用是安全 的。 0072 使用 dCK 作为诊断工具用于癌症疾病管理尚未发现其临床应用。然而， 在癌症治 疗中使用的几种核苷类似物 ( 例如阿糖胞苷和较新的吉西他汀 ) 是由 dCK 活化的， 因此找 到用于简单的确定抗性发展的有效的解决是最重要的， 因为已知抗性与 dCK 缺乏相联系。 0073 本发明在权利要求中总结。 0074 发明详述 0075 。
26、Taq DNA 聚合酶是来自嗜热水生菌 (Thermus aquaticus) 的 DNA 依赖性 DNA 聚合 酶。Taq 聚合酶 ( 或简单地 Taq) 具有 65-75的最佳温度区间。所述 Taq DNA 聚合酶也具 有 5 至 3 核酸酶活性。 0076 出乎意料地发现Taq DNA聚合酶在37下对于引物延伸和5至3核酸酶活性的 剩余活性足以从荧光双重标记的探针 ( 其一标记转移其能量 ( 猝灭 ) 至以热而不是光释放 能量的另一标记 ) 释放 5 结合的荧光标记物。 0077 与之前提出的对脱氧核糖核苷激酶的检测方法相比， 因此可以实时地测量脱氧核 糖核苷激酶的活性而不是确定终点的酶。
27、活性。 0078 核酸扩增测定系统中的实时检测除具有提高的灵敏度外， 还具有快速、 提高的分 辨率和更好的精度的优点。 0079 也认为对均质脱氧核糖核苷激酶活性测定来说， 为了与目前市场上的测定竞争， 它必须能够从健康的志愿者 ( 如 0.5U/l-7U/l) 中从测定开始的 5 小时内测量这些活性。 0080 在之前的尝试中， 使用 Taq DNA 聚合酶在 37下引物延伸和 5- 核酸酶反应不幸 地没有获得结果。因此， 认为并假设所述 Taq DNA 聚合酶的引物延伸反应和 5 核酸酶反应 可以被大肠杆菌的 DNA 依赖性 DNA 聚合酶 I 的相同的活性所替代， 从而保持均质测定的实 。
28、时方面。 令人失望的是不能使用该DNA聚合酶I， 因为该酶非特异地释放5结合的荧光团。 0081 因此， 再次认为对两种反应只使用一种孵育温度的真正的实时方法必须被放弃而 说 明 书 CN 103038361 A 7 5/22 页 8 用两步骤的改变温度的方法代替， 即 (1)TTP 或 dCTP 的产生必须在 37下发生， (2) 所述引 物延伸以及 5- 核酸酶荧光团的释放必须在更高的温度下 ( 例如在 51下 ) 孵育以支持 Taq DNA 聚合酶的活性。期望这能工作， 因为所述 Taq DNA 聚合酶在 51下应当保留其最 高活性的大约 40%。 0082 此外， 认为应当保留其工业实。
29、用性， 因为通过编程实时 PCR 仪器来执行温度改变， 可以使得温度改变的两步骤测定对测试供应商和操作者来说是不可见的。 0083 所以首先构建引物 - 模板 - 探针系统以协调至用于 51下杂交的最佳热力学特 性。考虑到 MgCl2的浓度， 计算所述探针的 Tm 将达到 69。在第一个尝试中仅测量 TK 活 性， 令人惊讶的是 37温育步骤已产生释放的和归一化的荧光的好的线性图， 其来自所包 括的两个标准点， 即分别来自 2000pg、 200pg、 20pg 和 2pg hrTK1 的活性。获得 0.9669 的 R2 值。来自 51反应的释放的和归一化的荧光的线性图甚至更差， 不过仍然可。
30、读。因此， 得 出的结论是用于检测样品中 TK 的可能的实时测定方法近在咫尺。更令人惊讶的是第一个 实验指示在 1h 内测量低至从正常的健康志愿者的血清样品中发现的 TK 活性的可能性。这 代表从最初的初步说明改进了 4h。所述 hrTK1 的比活性评估为 2.1mol/min/mg。该测定 只保留描述实时 PCR 的线性和平稳 ( 饱和 ) 阶段。在 37下实时检测 TK 活性的惊人效果 直接解决与两步骤温度改变方法相关的其他两个问题。第一， TK 显示特征性的 TTP 抑制。 这可能使两步骤测定难以对含有高 TK 活性的样品进行， 即需要稀释步骤。现在可以将其 省略， 因为所产生的 TTP。
31、 或 dCTP 持续地被所述 Taq DNA 聚合酶通过将 TTP 或 dCTP 掺入引 物 - 模板系统来去除。第二， Taq DNA 聚合酶在较高温度 ( 如 51 ) 下的非常高的聚合速 率(在72下35-100nt每秒)可能引起在实时解析测定结果的一些严重的问题， 因为较高 的 TK 活性值 ( 甚至低至 10U/l) 会从测定开始的几分钟内显现从而严重地限制分辨率。同 时， 由于信号分辨率的需要而仅可以使用有限量的 Taq DNA 聚合酶 U/ 反应， 健康志愿者的 活性在能检测到信号前可能需要几小时。 总之， 公开了非显而易见的发现， 现在可以将其变 为用于检测脱氧核糖核苷激酶活性。
32、的工业可应用的测定和方法， 图5。 在随后的实验中(实 施例 3) 验证了所述测定的灵敏度。 0084 总之， 现已发现天然的底物胸苷 (T) 和 / 或脱氧胞苷 (dC) 或其混合物， 和 DNA 依 赖性 DNA 聚合酶是测量脱氧核糖核苷激酶 ( 如 TK 或 dCK) 催化浓度所需要的必要的试剂。 这可以在含有用于 TK 或 dCK 活性测定的其他已知组分的均质混合物中进行。通过用反应 混合物中存在的其他核苷激酶 ( 如 dTMP 激酶或胞嘧啶核苷酸激酶 ) 和核苷二磷酸激酶的 活性互补样品中的 TK 或 dCK 催化活性， 使得该测定性能稳健、 操作快速和简单并且在临床 上是安全的。 。
33、这些试剂可以方便地纳入试剂盒和缓冲液中， 用于产生TTP或dCTP， 伴随使用 引物 - 模板 - 检测物 (detector) 系统的引物延伸， 各自有固定的浓度。在本文的剩余部分 中， 无样品的反应混合物中的试剂称为母液混合物 (master mix)， 缩写为 MMX。在 MMX 中也 可以包括 DNA 依赖性 DNA 聚合酶。表 1 总结了用于测定脱氧核糖核苷激酶的方法的试剂盒 组分的现有技术情况。总之， 之前的脱氧核糖核苷激酶试剂盒权利要求没有包括 DNA 依赖 性 DNA 聚合酶和天然的 T 和 / 或 dC 底物或其混合物， 或其使用方法。 0085 表 1: 现有技术试剂盒组分。
34、与本发明比较 0086 说 明 书 CN 103038361 A 8 6/22 页 9 0087 用于检测和测量样品中的核酸靶 ( 如来自细菌和病毒 ) 的均质 PCR 测定已成为临 床诊断中极其重要的测定方法。 0088 不同的检测技术已被应用于均质 PCR 测定。这些包括使用嵌入分子检测物的猝灭 技术， 和猝灭探针技术如双重标记的 FRET 核酸探针和利用接触猝灭核酸探针的所谓的分 子信标方法。 0089 本发明的实施应用在本领域中公知的分子生物学和酶学的技术。根据本发明， 包 含 DNA 依赖性 DNA 聚合酶和作为底物的天然 T 或 dC 的试剂盒可以与几种检测部分组合用 于测量样品中。
35、 TK 或 dCK 的催化浓度。 0090 也可以用磷酸转移酶如 TMPK 或 dCMPK 和 NdPK 完善该试剂盒。这些组分可以方便 地衍生自非重组的天然宿主或来自重组酶， 所述重组酶由携带互补酶的活性基因的真核或 细菌载体系统所表达。 0091 引物 - 模板 - 探针检测物系统的设计 0092 在本发明的所有的优选方面， 设计引物 - 模板 - 探针系统是重要的。DNA 依赖性 DNA 聚合酶的选择必须匹配所述引物 - 模板 - 检测物的选择。 0093 本发明不需要如同实时 PCR 的温度循环改变。然而， 使用双重标记的单链的和 FRET 猝灭的 DNA 探针作为检测物 ( 图 2)。
36、， 容易地实时进行该检测。本文将引物 - 模板 - 探 针系统设计为使所述探针在引物之前杂交至模板， 其通过将探针序列构建为达到比所述引 物高 3 -15的 Tm 从而比所述引物更快地结合至所述模板。更加优选的是高 5 -10 的 Tm。最优选的是高 7 -9的 TM。随后 TTP 或 dCTP 启动所述引物延伸的先决条件 (pre-requisite) 可以包括短的延迟使所述探针优选地在所述引物之前结合至所述模板。 在此检测物系统 ( 图 2)， Taq DNA 聚合酶是本发明的最优选的 DNA 依赖性 DNA 聚合酶。Taq DNA 聚合酶的浓度可以是每反应 0.01U-4U。更优选的为每。
37、反应 0.1U-2U。更加优选的是每 反应 0.3U-1U 的 Taq DNA 聚合酶。最优选的是每反应 0.5U 的 Taq 聚合酶。所述引物的设 计必须考虑所述猝灭剂和使用 5 核酸酶测定的 5- 荧光团之间的福斯特半径。 0094 使用荧光双重标记的单链 DNA 探针 ( 其在完整和非杂交形式是猝灭的， 如分子信 标探针， 图 3) 作为检测物， 对杂交步骤利用了相同的温度策略。引物 - 模板 - 探针系统 设计为使所述探针在引物之前杂交至模板， 其通过将探针序列构建为达到比所述引物高 说 明 书 CN 103038361 A 9 7/22 页 10 3 -15的 Tm 从而比所述引物更。
38、快地结合至所述模板。更加优选的是高 5 -10的 Tm。 最优选的是高 7 -9的 TM。随后 TTP 或 dCTP 启动所述引物延伸的先决条件可以包括短 的延迟使所述探针优选地在所述引物之前结合至所述模板。为进行根据本发明的如图 3 中 所描述的检测， 所述 DNA 依赖性 DNA 聚合酶必须具有 DNA 链置换活性。对本发明的该检测 物系统， 置换 DNA 聚合酶的浓度可以根据所使用的 DNA 聚合酶在每反应 0.01U-5U 范围内。 更优选的是每反应 0.1U-3U。 0095 对于最后一种检测物系统 ( 图 4)， 通过引物延伸产生的双链 DNA 允许表面结合或 嵌入荧光分子的结合，。
39、 从而通过结合被检测 ( 图 4)。用于该检测系统的 DNA 聚合酶可以优 选地是 3 5 外切 -DNA 依赖性 DNA 聚合酶， 例如 Klenow 外切 -DNA 聚合酶。所述 DNA 聚 合酶的浓度可以根据优选的酶为每反应 0.01U-4U。更优选的是每反应 0.1U-2U。 0096 检测来自不同检测物系统的信号 0097 用于信号检测的仪器可以优选地是实时 PCR 仪器。本发明的方法对所述仪器的加 热 - 冷却原理或光激发和发射检测原理没有偏好性。 0098 根据本发明的方法可以使用 Ct值， 其随后转变为催化浓度定义， 如每升单位酶活 性 (U/l)。应当理解根据本发明的方法可以。
40、选择 Ct 值和信号取样中的时间单位。该方法使 用约定的催化浓度定义。 0099 优选地由任何检测方法通过关联所述循环数来确定样品中TK或dCK的量， 在所述 循环数荧光总和的增加或减少 ( 取决于所使用的检测系统 ) 达到可检测阈值水平。 0100 试剂盒设计 0101 所述 DNA 依赖性 DNA 聚合酶和天然 T 或 dC 底物可以分配至一或多个反应容器。 0102 适 于 在 荧 光 检 测 仪 器 进 行 本 发 明 的 方 法 的 反 应 容 器 优 选 地 能 够 容 纳 20l-200l 的总体积。更加优选的反应容器能够容纳 25l 或 50l 的体积。根据 本发明的方法的反应。
41、体积可以优选地在 5l-100l 范围内。更加优选的反应体积为 25l-50l。 0103 使用所述试剂盒的样品处理 0104 在所述 MMX 添加至反应容器后， 将样品添加至所述容器。盖上该容器并放入所述 测量仪器并孵育。开始荧光取样并持续选定数目的循环。所述 TK/dCK 样品可以优选地包 括血清或血浆。更优选的是血清和柠檬酸盐血浆。所述反应体积中样品的比例应优选地为 1%-20%。 0105 根据本发明的方法将TTP或dCTP产生与引物延伸和荧光信号显现相偶联， 用于检 测和确定样品中TK或dCK催化浓度。 简而言之， 由来自所述样品的TK或dCK与所述试剂盒 包含的 TMPK 或 dC。
42、MPK 以及 NdPK 互补活性一起产生 TTP 或 dCTP。TMPK 或 dCMPK 以及 NdPK 优选地以超过样品中 TK 或 dCK 的最高疑似浓度 ( 例如 3000U/l) 存在于所述反应中。对 于 NdPK， 为由 2000pg hrTK1(ca.10000U/l) 所代表的催化浓度的 1X-1000X。更优选的是由 2000pg hrTK1 所代表的催化浓度的 50X-1000X 的 NdPK 的浓度。对于 TMPK 或 dCMPK， 优选 为由2000pg hrTK1所代表的催化浓度的1X-1000X。 更优选的是由2000pg hrTK1所代表的 催化浓度的 50X-10。
43、0X 的浓度。 0106 所述 DNA 依赖性 DNA 聚合酶 ( 方便地包含于所述试剂盒 ) 连续地利用 TTP 或 dCTP 来根据三种检测系统其中任一种进行引物延伸反应以产生荧光信号， 所述荧光信号随后可 说 明 书 CN 103038361 A 10 8/22 页 11 以与样品中 TK 或 dCK 的催化浓度相关联。对所有三种检测系统， 优选所述模板在引物结合 互补序列下游的模板核苷酸序列中 ( 即在模板序列的 5 方向 ) 具有一或多个 “A” 或 “G” ， 取决于所要测量的脱氧核糖核苷激酶。在检测脱氧鸟苷激酶 (dGK) 的情况下， 所述模板在 所述引物下游需要一或多个 “C”。
44、 。为了清楚起见， 在此注明每种引物 - 探针 - 检测物组至少 对于模板和旨在检测的脱氧核糖核苷激酶是特异的， 与所使用的检测系统无关。使用 5 核 酸酶检测系统的多重检测(即在相同的反应容器中检测多种脱氧核糖核苷激酶)也需要特 异性探针序列和标记。 0107 在一种所述检测系统 ( 图 2， 也称为检测系统 1) 中， 通过动态猝灭或 FRET 的作用 猝灭来自单链寡核苷酸探针的荧光， 所述单链寡核苷酸探针具有 5- 共价结合的荧光团和 在 3- 方向共价结合至相同探针的猝灭荧光团。在使用预先确定的量的引物、 模板和探针 的引物延伸反应期间， 通过所述 DNA 指导的 DNA 聚合酶的 5。
45、 3 核酸外切酶活性从所述 探针释放 ( 即水解掉 )5- 共价结合的荧光团。 0108 在另一种检测系统 ( 也称为检测系统 2， 图 4) 中， 来自嵌入或表面结合的荧光分 子 ( 例如但不限于 SYBR和 Eva Green的荧光在其游离或 未结合的状态下被猝灭。在使用预先确定的量的模板和一种引物的引物延伸反应期间， 荧 光分子被嵌入或表面结合至所产生的双链 DNA， 在此所述荧光分子开始发荧光。 0109 在第三种检测系统(也称为检测系统3， 图3)中， 来自单链寡核苷酸探针的荧光通 过接触猝灭或静态猝灭作用被猝灭， 所述单链寡核苷酸探针包含所谓的分子信标， 所述分 子信标具有 5- 。
46、共价结合荧光团、 共价结合至相同探针在所述 5- 结合荧光团的 3- 远端 的猝灭荧光团。 0110 在所述孵育和实时循环开始前使所述分子信标探针变性并允许其杂交至靶模板。 当杂交至模板时， 所述接触猝灭被释放并在零时刻达到最大荧光。在使用预先确定量的引 物、 模板和探针的引物延伸期间， 通过 29DNA 聚合酶或 Bsm 大片段 DNA 聚合酶或 Bst 大片 段 DNA 聚合酶的作用置换所述探针。后两种 DNA 聚合酶缺乏 3 5 核酸外切酶活性。当 所述分子信标被置换后， 其保持它的茎 - 环结构形式， 接触猝灭相对于每单位时间 TTP 或 dCTP 的产生而熄灭荧光。使用 Dabcyl。
47、 吸收来自 5 荧光团的荧光。在所有 3 种检测系统中 实时地进行检测 0111 与检测系统 1 有关的试剂盒可以包含 DNA 依赖性 DNA 聚合酶和天然的 T 或 dC 底 物， 或 Br-dU 或 dC， 最优选地为天然的 T 或 dC 底物。优选地， 所述 DNA 依赖性 DNA 聚合酶缺 乏 3 5 核酸外切酶。 0112 优选地， 该试剂盒包括 TMPK 或 dCMPK， 其浓度为 0.001ng/ 反应 -100ng/ 反应， 更 优选地 0.01ng-10ng、 0.02U/L-0.002U/LNdPK/ 反应 ； 0.5mM-15mM 的 - 磷酸供体 ( 如 ATP、 UT。
48、P、 CTP 或 GTP)， 更优选地 3mM-6mM， 最优选地 4mM-5mM ATP。 0113 引物， 长度为 10-20 个核苷酸， 更优选长度为 10-15 个核苷酸。所述引物可以是小 沟结合的修饰引物。引物的实例是 SEQ ID:9。 0114 模板， 50-1000 个核苷酸， 更优选地 75-250 个核苷酸， 具有与所述引物序列互补的 3- 近端序列 ； 优选地所述模板序列在用于检测 TK 或 dCK 时， 在所述引物结合位点的下游 (即所述模板的5-方向)1-10个核苷酸处， 更优选地在与所述引物序列互补的3-末端的 紧接着的下游位置， 具有一或多个 “A” 或 “G” 。最优选地， 一个 A 或一个 G 定位于与所述引 说 明 书 CN 103038361 A 11 9/22 页 12 物序列互补的 3- 末端的紧接着的下游位置。形成其余的模板序列的核苷酸组合物用于检 测 TK 活性时优选地是 T、 C 和 G 的混合物， 用于检测 dCK 活性时用 A 代替 G， GC 比例优选为 60%-40%。模板的实例是 SEQ ID:7。 0115 嵌入或表面结合荧光分子， 例如。