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1、(10)申请公布号 CN 102864198 A (43)申请公布日 2013.01.09 CN 102864198 A *CN102864198A* (21)申请号 201110186944.9 (22)申请日 2011.07.05 C12P 21/06(2006.01) C07K 14/62(2006.01) C07K 1/16(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (71)申请人 上海泰龙生物医药科技有限公司 地址 201203 上海市浦东新区张江高科技园 区蔡伦路 780 号 716 室 (72)发明人 郭颀然 许必雄 (74)专利代理机构 上海光华专利事务所 312。
2、19 代理人 许亦琳 余明伟 (54) 发明名称 一种重组人胰岛素原转肽方法及其在重组人 胰岛素下游纯化中的应用 (57) 摘要 本发明提供了一种重组人胰岛素原转肽方法 及其在重组人胰岛素下游纯化中的应用， 本发明 的重组人胰岛素原转肽方法为将纯化的重组人胰 岛素原经转肽反应生成重组人胰岛素， 其中， 转肽 反应的反应体系包括 ： 重组人胰岛素原 10-30g/ L、 二甲基亚砜 （DMSO） 100-200ml/L、 叔丁醚苏氨 酸 叔 丁 酯 63-103g/L、 1,4- 丁 二 醇 600-800ml/ L、 胰蛋白酶 2-6g/L、 Ca2+0.2-100mmol/l、 Mg2+0.。
3、2-100mmol/l 和水 ,pH 为 6.5-7.0 ； 转肽反 应的反应条件为 ： 温度27-47， 搅拌反应2-10小 时。本发明的重组人胰岛素原转肽方法可用于重 组人胰岛素的下游纯化。本发明的转肽方法不仅 缩短了转肽反应的时间、 提高了生产效率， 还能减 少副产物的产生。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 6 页 1/1 页 2 1. 一种重组人胰岛素原转肽方法， 为将纯化的重组人胰岛素原经转肽反应生成重组人 胰岛素， 其特征在于， 所述转肽反。
4、应的反应体系包括 ： 重组人胰岛素原 10-30g/L、 二甲基亚 砜(DMSO)100-200ml/L、 叔丁醚苏氨酸叔丁酯63-103g/L、 1， 4-丁二醇600-800ml/L、 胰蛋白 酶 2-6g/L、 Ca2+0.2-100mmol/l、 Mg2+0.2-100mmol/l 和水， pH 为 6.5-7.0 ； 所述转肽反应的反 应条件为 ： 温度 27-47， 搅拌反应 2-10 小时。 2. 如权利要求 1 所述重组人胰岛素原转肽方法， 其特征在于， 所述转肽反应的反应体 系中， Ca2+为 2-10mmol/l、 Mg2+为 2-10mmol/l。 3. 如权利要求 1 。
5、所述重组人胰岛素原转肽方法， 其特征在于， 所述转肽反应的温度为 37。 4. 如权利要求 1 所述重组人胰岛素原转肽方法， 其特征在于， 所述转肽反应的时间为 2-5 小时。 5. 如权利要求 1 所述重组人胰岛素原转肽方法， 其特征在于， 所述 Ca2+ 来源于氯化钙 或硫酸钙， 所述 Mg2+ 来源于氯化镁或硫酸镁。 6. 如权利要求 1-5 任一权利要求所述重组人胰岛素原转肽方法的用途， 为将所述转肽 方法应用于酵母发酵生产的重组人胰岛素的下游纯化。 7. 一种重组人胰岛素的下游纯化方法， 包括下列步骤 ： 1) 从分泌表达重组人胰岛素原的酵母发酵产物中分离纯化重组人胰岛素原 ； 2)。
6、 利用权利要求 1-5 任一权利要求所述重组人胰岛素原转肽方法将纯化的重组人胰 岛素原经转肽反应获得转肽产物 ； 3) 转肽产物经脱脂反应去除叔丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团后纯化得到胰岛素成品 ； 8. 如权利要求 7 所述重组人胰岛素的下游纯化方法， 其特征在于， 步骤 1) 从发酵产物 中分离纯化重组人胰岛素原的方法包括下列步骤 ： A. 将发酵产物离心收集上清 ； B. 阳离子交换层析纯化重组人胰岛素原 ； C. 将经步骤 B 纯化的产物经葡聚糖凝胶层析脱盐获得纯化的重组人胰岛素原 ； 9. 如权利要求 7 所述重组人胰岛素的下游纯化方法， 其特征在于， 步骤 3) 所述转肽产 物脱脂反应去。
7、除叔丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团后纯化得到胰岛素成品包括下列步骤 ： I、 转肽产物用反相柱层析纯化 ； II、 将步骤 I 获得的纯化产物冻干后采用三氟乙酸 (TFA) 与转肽产物反应脱脂去除叔 丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团 ； III、 脱脂产物冻干后， 再经反相柱层析纯化得到胰岛素成品。 10.如权利要求7所述重组人胰岛素的下游纯化方法， 其特征在于， 将步骤3)获得的胰 岛素成品经冻干获得胰岛素冻干粉。 权 利 要 求 书 CN 102864198 A 2 1/8 页 3 一种重组人胰岛素原转肽方法及其在重组人胰岛素下游纯 化中的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及重组。
8、人胰岛素下游纯化， 更具体的， 本发明涉 及重组人胰岛素原转肽方法及其在重组人胰岛素下游纯化中的应用。 背景技术 0002 糖尿病是仅次于肿瘤和心血管疾病的世界第三大致死疾病， 现今世界上已经有超 过 2 亿人的糖尿病患者， 胰岛素是治疗糖尿病的特效药， 尤其是治疗 I 型糖尿病和 II 型糖 尿病晚期患者时还没有其他的药物能够代替。胰岛素在临床应用上已经有 80 多年的历史， 随着生物技术的发展， 重组人胰岛素已经逐渐取代了动物胰岛素。能够在重组人胰岛素生 产中提高生产效率， 提高产品质量也就有了现实的意义。分离纯化是基因工程药物生产中 极其重要的一环， 在重组人胰岛素的基因工程生产中同样面。
9、临着下游纯化工艺处理复杂的 问题， 目前基因重组人胰岛素的生产通常有两种， 一种是通过大肠杆菌表达胰岛素原包含 体， 纯化经过胰岛素原纯化， 复性， 酶切转化， HPLC纯化来得到最后的天然人胰岛素。 另外一 种方式是通过酵母分泌表达胰岛素原， 纯化过程首先是胰岛素原纯化， 纯化后利用胰蛋白 酶转肽， 转肽后去保护利用 RP-HPLC 纯化得到最终的天然胰岛素。胰岛素原转换成天然的 胰岛素， 也就是转肽过程已经有很多报导， 例如Chandrasekhar Gurramkonda等在文章中报 导利用胰蛋白酶， 叔丁醚苏氨酸叔丁酯， 和氯化钙进行转肽， 12 度 24 小时反应， 转肽率接近 90。
10、(Gurramkonda et al.Application of simple fed-batch technique to high-level secretory production of insulin precursor using Pichia pastoris with subsequent purification and conversion to human insulin Microbial Cell Factories 2010， 9 ： 31)。 但由于转肽反应比较复杂， 时间比较长， 通常转肽过程会带来一些难以去除的副产物， 主要副产物是转肽过程中酶切下来的 Th。
11、r(B30)( 胰岛素 B 链上的第 30 个氨基酸苏氨酸 )， 这样就会增加胰岛素纯化的难度。现有的重组人胰岛素在分离纯化过程中转肽反应时间 长， 副产物多。 发明内容 0003 本发明的目的是克服现有技术中重组人胰岛素在分离纯化过程中转肽反应时间 长， 副产物多的缺陷， 提供一种转肽反应时间短， 转肽率高， 副产物少的重组人胰岛素下游 纯化方法。 0004 本发明一方面提供了一种重组人胰岛素原转肽方法， 为将纯化的重组人胰岛素 原经转肽反应生成重组人胰岛素， 其中， 所述转肽反应的反应体系包括 ： 重组人胰岛素原 10-30g/L， 二甲基亚砜 (DMSO)100-200ml/L、 叔丁醚。
12、苏氨酸叔丁酯 63-103g/L、 1， 4- 丁二醇 600-800ml/L、 胰蛋白酶2-6g/L、 Ca2+0.2-100mmol/l优选2-10mmol/l、 Mg2+0.2-100mmol/l优 选 2-10mmol/l 和水， pH 为 6.5-7.0 ； 所述转肽反应的反应条件为 ： 温度 27-47， 最适温度 为 37， 搅拌反应 2-10 小时， 较佳为 2-5 小时。 说 明 书 CN 102864198 A 3 2/8 页 4 0005 本发明的关键在于转肽条件的优化， 发明人意外地发现， 2 价金属离子镁离子与钙 离子的复合作用能够提高了胰蛋白酶的酶切反应速度和专一性。
13、， 大大缩短转肽时间， 转肽 时间缩短到 2 个小时以内， 转肽的副产物 ( 主要为 Thr(B30) 的相对减少， 这样可以提高重 组人胰岛素生产的效率和胰岛素的质量。 0006 在本发明所述转肽反应的反应体系中， 所述的水为超纯水。 0007 超纯水是指将水中的导电介质几乎完全去除， 又将水中不离解的胶体物质、 气体 及有机物均去除至很低程度的水， 电阻率大于 18M*cm， 或接近 18.3M*cm 极限值。 0008 在本发明所述转肽反应的反应体系中， Ca2+和 Mg2+可来源于钙或镁的无机盐 ( 如 氯化钙、 氯化镁、 硫酸镁、 硫酸钙 )。 0009 本发明的转肽方法可应用于酵母。
14、发酵生产重组人胰岛素的下游纯化。 0010 本发明还进一步提供了一种重组人胰岛素的下游纯化方法， 包括下列步骤 ： 0011 1) 从发酵产物中分离纯化重组人胰岛素原 ； 0012 2) 利用前述转肽方法将纯化的重组人胰岛素原经转肽反应获得转肽产物 ； 0013 3) 转肽产物经脱脂反应去除叔丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团后纯化得到胰岛素成 品 ； 0014 本发明的步骤 1) 及步骤 3) 均可利用现有技术完成。 0015 步骤 1) 中， 所述发酵产物为分泌表达重组人胰岛素原的酵母工程菌的发酵产物， 如分泌表达胰岛素原的毕赤酵母的发酵产物。 分泌表达重组人胰岛素原的酵母工程菌的构 建及其发酵均为。
15、现有技术。 0016 较佳的， 步骤 1) 从发酵产物中分离纯化重组人胰岛素原的方法包括下列步骤 ： 0017 A. 将发酵产物离心收集上清 ； 0018 B. 阳离子交换层析纯化重组人胰岛素原 ； 0019 C. 将经步骤 B 纯化的产物经葡聚糖凝胶层析脱盐获得纯化的重组人胰岛素原。 0020 进一步的， 阳离子交换层析采用 SP 阳离子交换层析柱 ； 葡聚糖凝胶层析采用 G25 凝胶层析柱。 0021 较佳的， 步骤 3) 所述转肽产物脱脂反应去除叔丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团后纯 化得到胰岛素成品包括下列步骤 ： 0022 I、 转肽产物用反相柱层析纯化 ； 0023 II、 将步骤 I 获。
16、得的纯化产物冻干后采用三氟乙酸 (TFA) 与转肽产物反应脱脂去 除叔丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团 ； 0024 III、 脱脂产物冻干后， 再经反相柱层析纯化得到胰岛素成品。 0025 所述反相柱层析可采用 C18 反相制备柱进行 HPLC 纯化。 0026 所述胰岛素成品具有天然胰岛素的结构和功能。 0027 进一步的， 纯化后的胰岛素成品还可进一步冻干以获得胰岛素冻干粉。 0028 现有的重组人胰岛素生产技术在转肽过程中时间一般较长， 文献报道中未发现有 低于 8 个小时的转肽反应， 而且一般的转肽反应都未考虑过副产物 Thr(B30) 的产生， 而该 副产物在一般的纯化过程难以除去， 与天。
17、然的胰岛素不同， 对人体用药可能会有未知的影 响。本发明的纯化方法， 通过转肽过程中加入二价金属离子钙和镁复合作用不仅缩短了转 肽反应的时间， 从 10 小时缩短到 2 小时， 提高了生产效率， 而且还能减少副产物 Thr(B30) 说 明 书 CN 102864198 A 4 3/8 页 5 的产生， 解决了现有重组人胰岛素生产中转肽反应时间长， 副产物多的缺点。 附图说明 0029 图 1 本发明纯化重组人胰岛素的工艺流程图 0030 图 2 实施例 1 转肽前 HPLC 监测图谱 0031 图 3 实施例 1 转肽 2 小时后 HPLC 监测图谱 0032 图 4 实施例 1 没有添加钙。
18、、 镁离子的转肽分析图谱 0033 图 5 实施例 1F3 峰液相检测结果 0034 图 6 实施例 1 脱酯反应检测图谱 具体实施方式 0035 以下列举具体实施例以进一步阐述本发明， 应理解， 实例并非用于限制本发明的 保护范围。 0036 本发明实施例采用的胰岛素纯化工艺主要物料来源出自毕赤酵母分泌表达胰岛 素原， 对胰岛素原纯化后优化了转肽反应， 转肽过程中添加了二价金属离子镁离子与钙离 子共同作用提高了胰蛋白酶的酶切反应速度和专一性， 转肽时间大大缩短， 减少了副产物 产生， 之后继续利用 RP-HPLC 纯化天然胰岛素， 得到合格的胰岛素产品。 0037 实施例纯化重组人胰岛素的工。
19、艺流程图如图 1 所示。 0038 实施例 1 重组人胰岛素的纯化 0039 工艺步骤 ： 0040 A， SP 阳离子交换层析纯化毕赤酵母表达的胰岛素原 0041 重组人胰岛素原酵母发酵液 4 升 ( 参考 Kjeldsen T， Pettersson AF， Hach M ： Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris. Biotechnol Appl Biochem 1999， 29 ： 79-86 记载的方法制备获得 )， 7000RPM 离心后收集 上清液。SP Sepharose F。
20、F(GE 公司购买 ) 装柱 XK50/30 层析柱 200 毫升， 首先 SP 柱经过 25mmol 醋酸 - 醋酸纳 PH3.5 缓冲液平衡 5 个柱体积， 平衡后调节离心上清液 PH 至 3.5 上 样， 上样结束后， 利用平衡液清洗柱子到基线， 大概3个柱体积。 洗脱采用pH7.4的磷酸二氢 钠 / 磷酸氢二钠缓冲溶液且添加 1M 氯化纳洗脱， 收集洗脱峰大约 150 毫升即为胰岛素原， 准备下一步脱盐。 0042 B， G25 脱盐层析 0043 G25凝胶(GE公司)50ml装填2610柱， 先用去离子水洗涤5倍柱体积， 后用1.0M NaOH 洗涤两个柱体积， 再用去离子水洗涤 。
21、5 倍柱体积， 最后用 0.1M 碳酸氢铵溶液 (pH8.0) 平衡 5 个柱体积。SP 洗脱液上样 G25 脱盐柱， 上样量 10 毫升， 多次上样收集洗脱峰。 0044 C， 转肽反应 ： 0045 称取脱盐后的胰岛素原200mg， 依次加入1.5ml二甲基亚砜(DMSO)、 叔丁醚苏氨酸 叔丁酯 0.83g、 1， 4- 丁二醇 7ml、 胰蛋白酶 40mg， 2.2mg 无水氯化钙 (2mmol/l) 和 1.9mg 无 水氯化镁(2mmol/l)调节pH6.5-7.0， 用超纯水定容至10ml， 在小烧杯中利用搅拌子低速搅 拌， 37 度下反应 2h， 反应结束后 8000rpm， 。
22、离心 5min。 0046 转肽产物经过 HPLC 分析发现 2 小时后转肽基本完成， 转肽率超过 90。 说 明 书 CN 102864198 A 5 4/8 页 6 0047 转肽分析的条件和结果如下 0048 分析型 HPLC 监测转肽反应 ： 0049 A 相 ： 0.15 TFA+ 超纯水。超声脱气 20min。 0050 B 相 ： 0.125 TFA+60乙腈 + 超纯水。超声脱气 20min。 0051 上样量皆为 10l， 检测波长为 280nm， 柱温 30。 0052 time(min) 0 1 5 35 36 39 40 B 相 0 0 40 80 100 100 0 。
23、0053 (1) 转肽前如图 2 所示 ( 胰岛素原 ) 0054 (2)2 小时转肽后如图 3 所示 0055 从图中可以看出， 转肽在 2 小时后基本完成， 将此峰收集下来做质谱分析， 得到的 分子量为 5919.4Da， 而转肽成功的胰岛素酯的理论分子量为 5919.97Da， 说明转肽成功， 大 约有 90的转肽率。而没有添加 2 价钙离子和 2 价镁离子的转肽反应， 转肽时间一般要超 过 10 个小时， 而且转肽率不是很高， 副产物比例较大， 如图 4 为没有添加钙， 镁离子的转肽 分析图谱， 转肽时间 10 小时。我们也做了在其余条件一致的情况下单独添加钙离子和镁离 子的实验， 单。
24、独添加了 2 价钙镁离子会提高胰酶活性， 增快转肽反应速度， 但是也会增加转 肽副产物的比率。下表说明了胰岛素原在转肽反应中的副产物产生比率， 证明了钙镁离子 复合作用对于减少副产物 ( 主要是 Thr(B30) 是有效的。 0056 2 价金属离子对胰岛素原转肽反应的影响 0057 金属离子 浓度 (mmol/l) Thr(B30)胰岛素原 不添加 - 4 Ca2+ 2 7 Mg2+ 2 5 Ca2+Mg2+ 2+2 0.8 0058 * 副产物的含量检测方法 ： Thr(B30) 是采用 HPLC 检测氨基酸含量的方法检测的 Thr(B30)胰岛素原 ： 每 100g 胰岛素原中 Thr(。
25、B30) 的重量 0059 D， HPLC 制备 ： 0060 转肽反应后， 对该转肽反应通过制备型高压液相利用 C18(Kromasil100-10-C18， 250mm*10mm) 反相柱进行半制备纯化。 0061 HPLC 条件如下 ： 0062 A相 ： 0.15TFA(三氟乙酸)+超纯水。 B相 ： 0.125TFA+乙腈。 超声脱气30min。 0063 流速控制 3.0ml/min( 压力一般为 6-7MPa)， 柱子用 15的 B 平衡， 0064 转肽反应上清液直接上柱， 上样量约6ml， 压力达1800psi， 上样完毕后用15B平 衡， 然后以 15-60 B/40min。
26、 梯度洗脱， 收集目的主峰 F3， 收集后冻干。F3 峰液相检测结果 说 明 书 CN 102864198 A 6 5/8 页 7 如图 5 所示， 纯度达 98以上。 0065 E， 脱酯反应 ： 0066 去除叔丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团后才能得到与天然胰岛素结构一致的胰岛素。 0067 按10mg1mlTFA比例加入。 反相目的收集液冻干后约25mg， 取20mg加入2mlTFA， 22反应 45min 后， 冻干。 0068 脱酯反应检测 ： 通过收集转肽反应 HPLC 检测的目的峰， 用 HPLC 检测， 检测条件 同转肽反应， 图谱如图 6。从图可以看出， 原来胰岛素酯的峰几乎没有，。
27、 出现了一个新峰， 将这个峰收集下来做质谱检测， 得到的分子量为 5807.6Da， 而天然人胰岛素的分子量为 5807.69Da， 说明保护基已成功去除， 得到了与天然胰岛素结构一致的胰岛素。 0069 F， 第二次反相层析得到最终成品 ： 0070 脱脂冻干品用 15乙腈溶解后， 再次反相层析， 条件同前。收集目的蛋白， 冻干。 0071 通过半制备柱得到的完整胰岛素质谱检测分子量同样为 5807.6Da。 0072 经 HPLC 检测纯度在 98以上， 质谱和小分子量电泳检测， 分子量与理论值相一 致。ELISA 活性检测比活较高， 约为 102IU/mg， 与 Sigma 通过酵母生产。
28、的标品相一致。 0073 实施例 2 重组人胰岛素的纯化 0074 工艺步骤 ： 0075 A， SP 阳离子交换层析纯化毕赤酵母表达的胰岛素原 0076 重组人胰岛素原酵母发酵液 4 升 ( 参考 Kjeldsen T， Pettersson AF， Hach M ： Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris. Biotechnol Appl Biochem 1999， 29 ： 79-86 记载的方法制备获得 )， 7000RPM 离心后收集 上清液。SP Sepharose FF(GE 。
29、公司购买 ) 装柱 XK50/30 层析柱 200 毫升， 首先 SP 柱经过 25mmol 醋酸 - 醋酸纳 PH3.5 缓冲液平衡 5 个柱体积， 平衡后调节离心上清液 PH 至 3.5 上 样， 上样结束后， 利用平衡液清洗柱子到基线， 大概3个柱体积。 洗脱采用pH7.4的磷酸二氢 钠 / 磷酸氢二钠缓冲溶液且添加 1M 氯化纳洗脱， 收集洗脱峰大约 150 毫升即为胰岛素原， 准备下一步脱盐。 0077 B， G25 脱盐层析 0078 G25凝胶(GE公司)50ml装填2610柱， 先用去离子水洗涤5倍柱体积， 后用1.0M NaOH 洗涤两个柱体积， 再用去离子水洗涤 5 倍柱体。
30、积， 最后用 0.1M 碳酸氢铵溶液 (pH8.0) 平衡 5 个柱体积。SP 洗脱液上样 G25 脱盐柱， 上样量 10 毫升， 多次上样收集洗脱峰。 0079 C， 转肽反应 ： 0080 称取脱盐后的胰岛素原100mg， 依次加入2.0ml二甲基亚砜(DMSO)、 叔丁醚苏氨酸 叔丁酯 0.63g、 1， 4- 丁二醇 6ml、 胰蛋白酶 30mg， 0.22mg 无水氯化钙 (0.2mmol/l) 和 5.7mg 无水氯化镁(6mmol/l)调节pH6.5-7.0， 用超纯水定容至10ml， 在小烧杯中利用搅拌子低速 搅拌， 27 度下反应 5h， 反应结束后 8000rpm， 离心 。
31、5min。 0081 转肽产物经过 HPLC 分析发现 5 小时后转肽基本完成， 转肽率超过 90， Thr(B30)胰岛素原为 11 ( 转肽分析及副产物检测方法同实施例 1) 0082 D， HPLC 制备 ： 0083 转肽反应后， 对该转肽反应通过制备型高压液相利用 C18(Kromasil100-10-C18， 250mm*10mm) 反相柱进行半制备纯化。 说 明 书 CN 102864198 A 7 6/8 页 8 0084 HPLC 条件如下 ： 0085 A相 ： 0.15TFA(三氟乙酸)+超纯水。 B相 ： 0.125TFA+乙腈。 超声脱气30min。 0086 流速控。
32、制 3.0ml/min( 压力一般为 6-7MPa)， 柱子用 15的 B 平衡， 0087 转肽反应上清液直接上柱， 上样量约6ml， 压力达1800psi， 上样完毕后用15B平 衡， 然后以 15-60 B/40min 梯度洗脱， 收集目的主峰 F3， 收集后冻干。F3 峰液相检测纯度 达 98以上。 0088 E， 脱酯反应 ： 0089 去除叔丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团后才能得到与天然胰岛素结构一致的胰岛素。 0090 按 10mg ： 1mlTFA 比例加入。反相目的收集液冻干后约 25mg， 取 20mg 加入 2mlTFA， 22反应 45min 后， 冻干。 0091 脱酯反应。
33、检测同实施例 1， 从检测结果判断， 保护基已成功去除， 得到了与天然胰 岛素结构一致的胰岛素。 0092 F， 第二次反相层析得到最终成品 ： 0093 脱脂冻干品用 15乙腈溶解后， 再次反相层析， 条件同前。收集目的蛋白， 冻干。 0094 通过半制备柱得到的完整胰岛素质谱检测分子量同样为 5807.6Da。 0095 经 HPLC 检测纯度在 98以上， 质谱和小分子量电泳检测， 分子量与理论值相一 致。ELISA 活性检测比活较高， 约为 98IU/mg， 与 Sigma 通过酵母生产的标品相一致。 0096 实施例 3 重组人胰岛素的纯化 0097 工艺步骤 ： 0098 A， S。
34、P 阳离子交换层析纯化毕赤酵母表达的胰岛素原 0099 重组人胰岛素原酵母发酵液 4 升 ( 参考 Kjeldsen T， Pettersson AF， Hach M ： Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris. Biotechnol Appl Biochem 1999， 29 ： 79-86 记载的方法制备获得 )， 7000RPM 离心后收集 上清液。SP Sepharose FF(GE 公司购买 ) 装柱 XK50/30 层析柱 200 毫升， 首先 SP 柱经过 25mmol 醋酸 。
35、- 醋酸纳 PH3.5 缓冲液平衡 5 个柱体积， 平衡后调节离心上清液 PH 至 3.5 上 样， 上样结束后， 利用平衡液清洗柱子到基线， 大概3个柱体积。 洗脱采用pH7.4的磷酸二氢 钠 / 磷酸氢二钠缓冲溶液且添加 1M 氯化纳洗脱， 收集洗脱峰大约 150 毫升即为胰岛素原， 准备下一步脱盐。 0100 B， G25 脱盐层析 0101 G25凝胶(GE公司)50ml装填2610柱， 先用去离子水洗涤5倍柱体积， 后用1.0M NaOH 洗涤两个柱体积， 再用去离子水洗涤 5 倍柱体积， 最后用 0.1M 碳酸氢铵溶液 (pH8.0) 平衡 5 个柱体积。SP 洗脱液上样 G25 。
36、脱盐柱， 上样量 10 毫升， 多次上样收集洗脱峰。 0102 C， 转肽反应 ： 0103 称取脱盐后的胰岛素原300mg， 依次加入1.0ml二甲基亚砜(DMSO)、 叔丁醚苏氨酸 叔丁酯 1.03g、 1， 4- 丁二醇 8ml、 胰蛋白酶 20mg， 110mg 无水氯化钙 (100mmol/l) 和 0.19mg 无水氯化镁(0.2mmol/l)调节pH6.5-7.0， 用超纯水定容至10ml， 在小烧杯中利用搅拌子低 速搅拌， 47 度下反应 8h， 反应结束后 8000rpm， 离心 5min。 0104 转肽产物经过 HPLC 分析发现 8 小时后转肽基本完成， 转肽率超过 9。
37、0， Thr(B30)胰岛素原为 2.3 ( 转肽分析及副产物检测方法同实施例 1) 说 明 书 CN 102864198 A 8 7/8 页 9 0105 D， HPLC 制备 ： 0106 转肽反应后， 对该转肽反应通过制备型高压液相利用 C18(Kromasil100-10-C18， 250mm*10mm) 反相柱进行半制备纯化。 0107 HPLC 条件如下 ： 0108 A相 ： 0.15TFA(三氟乙酸)+超纯水。 B相 ： 0.125TFA+乙腈。 超声脱气30min。 0109 流速控制 3.0ml/min( 压力一般为 6-7MPa)， 柱子用 15的 B 平衡， 0110 。
38、转肽反应上清液直接上柱， 上样量约 6ml， 压力达 1800psi， 上样完毕后用 15B 平 衡， 然后以 15-60 B/40min 梯度洗脱， 收集目的主峰 F3， 收集后冻干。F3 峰液相检测纯度 达 98以上。 0111 E， 脱酯反应 ： 0112 去除叔丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团后才能得到与天然胰岛素结构一致的胰岛素。 0113 按 10mg ： 1mlTFA 比例加入。反相目的收集液冻干后约 25mg， 取 20mg 加入 2mlTFA， 22反应 45min 后， 冻干。 0114 脱酯反应检测同实施例 1， 从检测结果判断， 保护基已成功去除， 得到了与天然胰 岛素结构一致。
39、的胰岛素。 0115 F， 第二次反相层析得到最终成品 ： 0116 脱脂冻干品用 15乙腈溶解后， 再次反相层析， 条件同前。收集目的蛋白， 冻干。 0117 通过半制备柱得到的完整胰岛素质谱检测分子量同样为 5807.6Da。 0118 经 HPLC 检测纯度在 98以上， 质谱和小分子量电泳检测， 分子量与理论值相一 致。 0119 ELISA 活性检测比活较高， 约为 95IU/mg， 与 Sigma 通过酵母生产的标品相一致。 0120 实施例 4 重组人胰岛素的纯化 0121 工艺步骤 ： 0122 A， SP 阳离子交换层析纯化毕赤酵母表达的胰岛素原 0123 重组人胰岛素原酵母。
40、发酵液 4 升 ( 参考 Kjeldsen T， Pettersson AF， Hach M ： Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris. Biotechnol Appl Biochem 1999， 29 ： 79-86 记载的方法制备获得 )， 7000RPM 离心后收集 上清液。SP Sepharose FF(GE 公司购买 ) 装柱 XK50/30 层析柱 200 毫升， 首先 SP 柱经过 25mmol 醋酸 - 醋酸纳 PH3.5 缓冲液平衡 5 个柱体积， 平衡后调节离心上清液 。
41、PH 至 3.5 上 样， 上样结束后， 利用平衡液清洗柱子到基线， 大概3个柱体积。 洗脱采用pH7.4的磷酸二氢 钠 / 磷酸氢二钠缓冲溶液且添加 1M 氯化纳洗脱， 收集洗脱峰大约 150 毫升即为胰岛素原， 准备下一步脱盐。 0124 B， G25 脱盐层析 0125 G25凝胶(GE公司)50ml装填2610柱， 先用去离子水洗涤5倍柱体积， 后用1.0M NaOH 洗涤两个柱体积， 再用去离子水洗涤 5 倍柱体积， 最后用 0.1M 碳酸氢铵溶液 (pH8.0) 平衡 5 个柱体积。SP 洗脱液上样 G25 脱盐柱， 上样量 10 毫升， 多次上样收集洗脱峰。 0126 C， 转肽。
42、反应 ： 0127 称取脱盐后的胰岛素原250mg， 依次加入1.5ml二甲基亚砜(DMSO)、 叔丁醚苏氨酸 叔丁酯 1.03g、 1， 4- 丁二醇 6ml、 胰蛋白酶 60mg， 11mg 无水氯化钙 (10mmol/l) 和 95mg 无水 说 明 书 CN 102864198 A 9 8/8 页 10 氯化镁(100mmol/l)调节pH6.5-7.0， 用超纯水定容至10ml， 在小烧杯中利用搅拌子低速搅 拌， 37 度下反应 2h， 反应结束后 8000rpm， 离心 5min。 0128 转肽产物经过 HPLC 分析发现 2 小时后转肽基本完成， 转肽率超过 90， Thr(B。
43、30)胰岛素原为 1.5 ( 转肽分析及副产物检测方法同实施例 1) 0129 D， HPLC 制备 ： 0130 转肽反应后， 对该转肽反应通过制备型高压液相利用 C18(Kromasil100-10-C18， 250mm*10mm) 反相柱进行半制备纯化。 0131 HPLC 条件如下 ： 0132 A相 ： 0.15TFA(三氟乙酸)+超纯水。 B相 ： 0.125TFA+乙腈。 超声脱气30min。 0133 流速控制 3.0ml/min( 压力一般为 6-7MPa)， 柱子用 15的 B 平衡， 0134 转肽反应上清液直接上柱， 上样量约6ml， 压力达1800psi， 上样完毕后。
44、用15B平 衡， 然后以 15-60 B/40min 梯度洗脱， 收集目的主峰 F3， 收集后冻干。F3 峰液相检测纯度 达 98以上。 0135 E， 脱酯反应 ： 0136 去除叔丁醚苏氨酸叔丁酯保护基团后才能得到与天然胰岛素结构一致的胰岛素。 0137 按10mg1mlTFA比例加入。 反相目的收集液冻干后约25mg， 取20mg加入2mlTFA， 22反应 45min 后， 冻干。 0138 脱酯反应检测同实施例 1， 从检测结果判断， 保护基已成功去除， 得到了与天然胰 岛素结构一致的胰岛素。 0139 F， 第二次反相层析得到最终成品 ： 0140 脱脂冻干品用 15乙腈溶解后， 。
45、再次反相层析， 条件同前。收集目的蛋白， 冻干。 0141 通过半制备柱得到的完整胰岛素质谱检测分子量同样为 5807.6Da。 0142 经 HPLC 检测纯度在 98以上， 质谱和小分子量电泳检测， 分子量与理论值相一 致。ELISA 活性检测比活较高， 约为 100IU/mg， 与 Sigma 通过酵母生产的标品相一致。 说 明 书 CN 102864198 A 10 1/6 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 102864198 A 11 2/6 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 102864198 A 12 3/6 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 102864198 A 13 4/6 页 14 图 4 说 明 书 附 图 CN 102864198 A 14 5/6 页 15 图 5 说 明 书 附 图 CN 102864198 A 15 6/6 页 16 图 6 说 明 书 附 图 CN 102864198 A 16 。