基于PAMAM的联合携载阿霉素及耐药逆转剂的纳米递送系统的制备方法技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种靶向联载药纳米粒的制备方法，具体涉
及一种基于PAMAM的联合携载阿霉素及耐药逆转剂的纳米递送系统的制备方法。
背景技术
我国肿瘤发病率和死亡率多年持续上升，已成为一个必须高度重视的公共卫生问
题乃至社会问题。目前，化疗是治疗癌症的主要手段之一，在临床应用中，单独的药物不但
不能发挥有效的抗肿瘤作用，而且还伴随着严重的毒副作用。此外，化疗药物的滥用又会引
起肿瘤的多药耐药，为肿瘤的治疗增添难度。因此，发展新型递药系统、探索有效给药方式
已经迫在眉睫。具有载药高效性、条件响应性以及被动靶向性的新型递药系统已经成为当
前癌症治疗中炙手可热的领域，新型递药系统将为癌症患者带来福音。
肿瘤的多药耐药(multidrug resistance，MDR)的出现最终导致恶性肿瘤化疗的
失败。寻找有效的耐药逆转剂及逆转措施克服MDR，已成为国内外的研究热点。其中，联合用
药对MDR的逆转以及恶性肿瘤的治疗都具有良好的应用前景。
P-糖蛋白(P-glycoprotein，P糖蛋白)是ABC超家族中的一员，是一种外排蛋白，也
是最为常见导致MDR的原因之一。P糖蛋白是一种相对分子量为170000的跨膜糖蛋白。P糖蛋
白由两个相同的结构组成，同时具有ATP结合位点，可通过水解两分子ATP提供能量，实现两
次P糖蛋白构象改变，泵出胞内药物而弱化药物作用。肿瘤细胞P糖蛋白高表达是其产生耐
药性的关键因素。
单一药物的肿瘤化疗易导致化疗失败并产生MDR，但多种作用方式不同的药物联
用可有效提高化疗成功率。究其原因，单一药物作用机理单一，而多种药物可从多个途径抑
制肿瘤生长。因此，作用方式不同的药物联合用于逆转MDR已经成为当前研究热点。联合用
药主要有三种形式：①两种作用方式不同的化疗药物联合使用。临床上，多种化疗药物联合
使用有助于抗肿瘤作用发挥的同时还可以有效预防多药耐药的产生。②化疗药物与基因类
药物联合使用。
基因支持着生命的基本构造和性能。因此可针对肿瘤发生与发展中特有的基因，
从源头上减少MDR的产生，提高化疗药物的疗效。③化疗药物与MDR逆转剂联合使用。MDR逆
转剂往往可以直接遏制药物的外排，从而提高药物在细胞内的有效浓度。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于PAMAM的联合携载阿霉素及耐药逆转剂的纳米递送
系统的制备方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种基于PAMAM的联合携载阿霉素及耐药逆转剂
的纳米递送系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)制作PAMAM靶向给药载体的甲醇溶液；
(2)制作盐酸阿霉素的甲醇溶液，并向其中加入三乙胺中和盐酸，使阿霉素游离出
来制得阿霉素的甲醇溶液；
(3)制作耐药逆转剂的三氯甲烷溶液；
(4)边搅拌边将阿霉素的甲醇溶液、耐药逆转剂的三氯甲烷溶液和PAMAM靶向给药
载体的甲醇溶液混合并在氮气保护下油浴；
(5)去有机溶剂；
(6)用蒸馏水溶解；
(7)离心后取上层清液。
在一些实施方式中，PAMAM靶向给药载体的通式结构为：
其中，n为20-1000，m为1-4096。
在一些实施方式中，耐药逆转剂为依克立达。
在一些实施方式中，阿霉素与依克立达的摩尔比为20-5:1。
在一些实施方式中，油浴的时间为12-36h。
在一些实施方式中，有机溶剂通过旋转蒸发仪去除。
其有益效果为：(1)本发明的阿霉素和耐药逆转剂是包埋在PAMAM空腔中，阿霉素
在不断搅拌的条件下进入到PAMAM中，制得载药纳米粒。
(2)本发明耐药逆转剂依克立达的作用位点是细胞膜上的P糖蛋白，可以使进入细
胞的阿霉素量增加，不被泵出。本发明改善耐药逆转剂依克立达水溶性差的缺陷，将耐药逆
转剂依克立达包埋于PAMAM中，可以提高其生物利用度。
(3)聚酰胺-胺树状大分子(Polyamidoamine dendrimer，PAMAM)作为一种阳离子
聚合物，表面带有大量正电荷，常用于基因的包载。PAMAM具有“质子海绵效应”可在溶酶体
实现药物或基因的快速释放。此外，PAMAM内部空腔具有较强的疏水性，可以用于疏水性药
物的包载。同时PAMAM的特殊树状结构使其具有一定的pH敏感性，即在低pH条件下外枝收
缩，内核暴露，形成“致密外壳”结构，而在高pH条件下形成“致密内核”结构。
(4)本发明具有pH和还原敏感性的PAMAM靶向给药载体用于阿霉素和依克立达的
同时递送。该载体以本身具有酸敏感特性的聚酰胺-胺为母核，聚乙二醇通过还原敏感键
(二硫键)对PAMAM进行修饰，由此构建具有双重敏感性的载体PAMAM-SS-PEGm。通过物理包
埋法同时将阿霉素和依克立达包入载体内核PAMAM的疏水空腔中。利用肿瘤细胞内溶酶体
的酸环境及细胞质中的高还原环境进行药物的释放，保证外周血液循环中较低的药物释放
量，从而减少毒副作用的产生。同时，阿霉素和依克立达联用可实现乳腺癌多药耐药的逆
转，增强多柔比星的化疗效率。再者，联载纳米粒可预防或抑制肿瘤化疗期间耐药转变，遏
制肿瘤药物外排应激反应，降低肿瘤治疗的难度，具有良好的临床应用前景。
(5)本发明的PAMAM靶向给药载体通过在PAMAM和PEG之间引入还原敏感的二硫键，
形成PAMAM-SS-PEGm聚合物，该聚合物能在血液循环中保持稳定，而一旦到达肿瘤细胞内，
在溶酶体的酸环境和细胞质中的高GSH环境中药物释放。其中依克立达作用于P糖蛋白，抑
制P糖蛋白的外排，阻止阿霉素的外排，增加阿霉素在胞内的蓄积量，尤其是细胞核内的相
对含量，进而增强抗肿瘤作用和多药耐药逆转的效果。
(6)本发明基于PAMAM靶向给药载体携载阿霉素和依克立达的纳米粒可有效逆转
乳腺癌多药耐药，增强阿霉素对肿瘤细胞的毒性，同时有效遏制一般肿瘤化疗出气有耐药
转变引起的药物外排应激反应，降低肿瘤治疗的难度，减少毒副作用的发生。
附图说明
图1为PAMAM、mPEG5000-SH和PAMAM-SS-PEG115的1H-NMR图谱。
图2为PAMAM、mPEG5000-SH和PAMAM-SS-PEG115的FTIR图谱。
图3为投药比对载药纳米粒PAMAM-SS-PEG115/DOX/ELC中DOX(A)和ELC(B)的载药
量、包封率的影响柱状图；
图4为实施例3制得的PAMAM-SS-PEG115/DOX/ELC体外释放柱状图；
图5为PAMAM-SS-PEG115和游离ELC体外抗肿瘤活性柱状图。
图6为DOX、实施例4制得的PAMAM-SS-PEG115/DOX、实施例1制得的PAMAM-SS-PEG115/
DOX/ELC、实施例2制得的PAMAM-SS-PEG115/DOX/ELC和实施例3制得的PAMAM-SS-PEG115/DOX/
ELC的体外抗肿瘤活性柱状图。
具体实施方式
聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子：末端带有氨基，以乙二胺为核，0-10.0代(购自
Sigma-Aldrich)；N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPD)购自梯希爱上海化成工业
发展有限公司；单甲氧基聚乙二醇(mPEG115-SH)购自北京键凯科技有限公司；依克立达
(ELC)购自上海瀚香生物科技公司；盐酸阿霉素(DOX·HCl)购自北京华奉联博科技技术有
限公司；三乙胺、甲醇、三氯甲烷等购自国药集团化学试剂有限公司；水为双蒸水。
用Unity Inova 400MHz核磁共振仪(1H-NMR)对PAMAM-SS-PEG115进行结构确证；用
ProStarLC240红外光谱仪(FTIR)对PAMAM-SS-PEG115进行表征。
PAMAM-SS-PEG115的1H-NMR和FTIR表征
采用Unity Inova 400MHz核磁共振仪，以重水(D2O)为溶剂分别对PAMAM、
mPEG5000-SH和PAMAM-SS-PEG115进行1H-NMR分析，将纯化后的PAMAM-SS-PEG115进行1H-NMR核
磁分析，表征结果如图1所示。分别称取少量PAMAM、mPEG5000-SH、PAMAM-SS-PEG115用
ProStarLC240红外光谱仪进行FTIR分析(扫描范围600-4000cm-1)，表征结果如图2所示。
实施例1
称取3mg冻干载体PAMAM-SS-PEG115溶于1mL甲醇中；称取1mg的DOX·HCl溶于甲醇
1mL，加入三乙胺30μL中和盐酸，使DOX游离出来，与PAMAM-SS-PEG115溶液混合；再称取1mg的
ELC溶于三氯甲烷1mL中。以DOX和ELC摩尔比20:1量取30μL的DOX和30μL的ELC投入上述反应
瓶中，氮气保护，30℃油浴24h。旋蒸除去有机溶剂，用蒸馏水2mL溶解，离心(3600g)10min。
离心后取上清液储存备用，DOX和ELC的摩尔比为20:1。
实施例2
称取3mg冻干载体PAMAM-SS-PEG115溶于1mL甲醇中；称取1mg的DOX·HCl溶于甲醇
1mL，加入三乙胺30μL中和盐酸，使DOX游离出来，与PAMAM-SS-PEG115溶液混合；再称取1mg的
ELC溶于三氯甲烷1mL中。以DOX和ELC摩尔比10:1量取30μL的DOX和30μL的ELC投入上述反应
瓶中，氮气保护，30℃油浴24h。旋蒸除去有机溶剂，用蒸馏水2mL溶解，离心(3600g)10min。
离心后取上清液储存备用，DOX和ELC的摩尔比为10:1。
实施例3
称取3mg冻干载体PAMAM-SS-PEG115溶于1mL甲醇中；称取1mg的DOX·HCl溶于甲醇
1mL，加入三乙胺30μL中和盐酸，使DOX游离出来，与PAMAM-SS-PEG115溶液混合；再称取1mg的
ELC溶于三氯甲烷1mL中。以DOX和ELC摩尔比5:1量取30μL的DOX和30μL的ELC投入上述反应
瓶中，氮气保护，30℃油浴24h。旋蒸除去有机溶剂，用蒸馏水2mL溶解，离心(3600g)10min。
离心后取上清液储存备用，DOX和ELC的摩尔比为5:1。
实施例4
称取3mg冻干载体PAMAM-SS-PEG115溶于1mL甲醇中；称取1mg的DOX·HCl溶于甲醇
1mL，加入三乙胺30μL中和盐酸，使DOX游离出来，与PAMAM-SS-PEG115溶液混合；再称取1mg的
ELC溶于三氯甲烷1mL中。以DOX和ELC摩尔比1:0量取30μL的DOX和30μL的ELC投入上述反应
瓶中，氮气保护，30℃油浴24h。旋蒸除去有机溶剂，用蒸馏水2mL溶解，离心(3600g)10min。
离心后取上清液储存备用，DOX和ELC的摩尔比为1:0。
投药比对载药纳米粒PAMAM-SS-PEG115/DOX/ELC中DOX以及ELC载药量、包封率的影
响
实施例1、2、3中DOX和ELC载药量和包封率分别利用紫外分过光度法和HPLC进行测
定。采用间接法计算DOX和ELC的载药量和包封率，即计算未包载进入PAMAM-SS-PEG115的游
离DOX和ELC的量。以ELC为例，未能包载的游离ELC主要有两种来源：首先PAMAM-SS-PEG115/
DOX/ELC用水复溶，离心产生的沉淀中未包载进入载体的游离ELCa，溶解后测定吸光度。然
后精密量取纳米粒溶液500μL，置超滤离心管(Mw 3500)中，离心(6700g)30min，滤液为溶解
在水中而未包载入载体的游离ELCb，紫外测定滤液中游离ELCa和ELCb的含量。两部分游离
ELC的含量相加作为总的游离的药量，通过下式计算载药量和包封率。DOX采用相同方法计
算包封率、载药量。
载药量的计算公式为：
包封率的计算公式为：
如图3所示，ELC和DOX载药量和包封率均较高，通过计算可知，投药摩尔比为20:1
时，实际所得摩尔比依次为13.8:1；投药摩尔比为10:1，实际所得摩尔比依次为9.4:1；投药
摩尔比为5:1时，实际所得摩尔比依次为4.9:1。
通过物理包埋的方法将DOX和ELC同时包入载体，制备DOX:ELC不同摩尔比的联载
纳米粒。对于三种摩尔比的纳米粒，两种药物的载药量及包封率均较高。但载体载药具有一
定的饱和性，两药联合携载表现出载药量此消彼长的特点，若提高给药系统中DOX含量，则
会导致ELC浓度过低不能逆转MDR；相反，若降低给药系统中DOX的含量，虽然可以实现低浓
度MDR逆转，但会降低载药系统整体的抗肿瘤效率。
载药纳米粒PAMAM-SS-PEG115/DOX/ELC体外释放考察
实施例3中纳米粒通过三种释放条件考察，分别为：(1)PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)；
(2)含10mM谷胱甘肽(GSH)的PBS(0.1M，pH 7.4)；(3)含10mMGSH的乙酸缓冲液(pH 5.0)。具
体操作为：采用动态透析法进行考察。精密吸取实施例3所制备溶液2ml，置透析袋(Mw
3500)中，随即投入20mL不同的释放介质中，置37℃、100r/min摇床中孵育。分别于0.5、1、2、
4、6、8、10、12和24h取样3ml(同时补充同温等量的新鲜释放介质)，0.22μm滤膜过滤，续滤液
中DOX用紫外分光光度法测定含量，ELC用高效液相法测定含量，按照以下公式分别计算
DOX、ELC的累计释放率。10mM GSH是用于模拟肿瘤细胞内的还原环境。
式中：Er为DOX或ELC的累计释放率；Ve为PBS缓冲液的置换体积；V0为释放介质的
总体积；m为纳米粒中DOX的含量；Ci为第i次置换取样时释放出的药物浓度。
从图4结果可知，DOX、ELC同时释放没有明显的相互干扰，与单独包载和释放时相
比其释放行为均表现出还原、pH敏感性。在pH 7.4的介质中，DOX、ELC释放均缓慢且没有突
释，24h累积释放率ELC低于10％，而DOX的释放相对较快。在含有10mM GSH的pH 7.4的介质
中两种药物释放均略有提高，分别为46.35％、19.20％。在含有10mM GSH的pH 5.0的介质
中，DOX释放迅速，24h累积释放率为64.45％，对于ELC而言则相对较低，为51.32％。以上结
果表明，构建的PSSP/DOX/ELC具有明显的pH和还原敏感性。同时DOX、ELC分子量相近，两者
同时通过物理包埋的方式进入载体内核，其释放行为没有明显的相互干扰。同时两者在生
理条件下，释放率均较低，递药系统表现出良好的稳定性。而一旦到达肿瘤部位，两药能在
细胞内的还原、pH环境刺激下同时迅速释放。由于ELC可在20nM的低浓度条件下即可发挥作
用，且作用维持时间较长，所以两药同时包载同时释放更有利于在释放的初期就达到抑制P
糖蛋白的外排作用，增加DOX的胞内蓄积。
PAMAM-SS-PEG115/DOX/ELC体外抗肿瘤活性
称取一定量空白载体PAMAM-SS-PEG115，溶解于培养基中配成1mg/mL母液，再用新
鲜培养基稀释至终浓度为50、100、200、400、600、800μg/mL。称取一定量的游离ELC，溶解于
DMSO中配成1mg/mL母液，再用新鲜培养基稀释至终浓度为0.1、1、2.5、5、10、15μM。取对数生
长期的MCF-7和MCF-7/ADR细胞，以1×104个/孔的密度接种于96孔板中，37℃下培养24h。然
后，弃去旧培养基，每孔加入不同浓度的上述溶液100μL，每个浓度组设置4个复孔，同时于
同一块板设置空白对照组，于相同培养条件下继续孵育48h。孵育结束后，吸去含药培养基，
再用PBS清洗两次，每孔加入0.5mg/mL的MTT溶液各100μL。继续孵育4h，吸去MTT溶液，每孔
加入100μL DMSO溶液，振荡至结晶溶解，用酶标仪记录每孔在492nm处的吸光度值(OD)。
利用以下公式分别计算细胞存活率、耐药指数(RI)和逆转因子(RF)，公式如下：
细胞存活率＝实验组OD值/对照组OD值×100％RI＝IC50(MCF-7/ADR)/IC50(MCF-
7)
RF＝IC50(DOX)/IC50(Nanoparticles)
其中半数致死量IC50可以利用统计学软件SPSS计算获得。
取DOX和实施例子1、2、3、4分别稀释成系列浓度(DOX终浓度为0.1、1、2.5、10、25和
50μM)，按照上述方法，考察联载纳米粒的细胞毒性以及对MDR的逆转作用，同时考察不同摩
尔比对逆转效果的影响。
从图5可以得出:空白PAMAM-SS-PEG115(PSSP)及ELC在实验浓度范围内基本无细胞
毒性，具有良好的安全性。从图6数据计算实施例1至实施例4、单独DOX对MCF-7和MCF-7/ADR
细胞的IC50值如下：
从上表可以看出，纳米粒的细胞毒性受给药剂量、纳米粒构成及配比和细胞类型
的影响。对于MCF-7和MCF-7/ADR细胞，DOX的IC50值分别为(1.72±0.19)和(59.62±3.48)μ
M，耐药倍数(RI)34.66，MCF-7/ADR细胞表现出较强的耐药性。而DOX与ELC联用后，MCF-7/
ADR细胞的存活率明显下降，PAMAM-SS-PEG115/DOX/ELC纳米粒中DOX:ELC摩尔比分别为20:
1、10:1、5:1时，DOX的IC50值依次为(1.50±0.16)、(1.01±0.08)和(0.82±0.04)μM，相应
的逆转因子(RF)值为39.75、59.03和72.71，即随着药物配比中ELC比例的增加，耐药逆转程
度增加。对于实施例3所制备纳米粒而言，其RI值仅为1.34，即该纳米粒的抗肿瘤效果与游
离DOX相近。而相同DOX浓度下，对于MCF-7/ADR细胞，实施例4所制备纳米粒与游离DOX相比
细胞存活率明显下降，但与联载纳米粒比较抗肿瘤活性较低。产生这种现象的主要原因可
能是实施例4所制备纳米粒通过主动运输的方式进入细胞，游离DOX主要通过扩散的形式进
入细胞，两种入胞途径造成了实施例4所制备纳米粒可绕开P糖蛋白后再释药，由此有一部
分DOX可进入细胞核发挥抗肿瘤作用，而游离DOX大部分在进入细胞核之前就被P糖蛋白外
排。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域普通技术人员来讲，在不脱
离本发明创造性构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范
围。