一种鸡贫血病毒凋亡素融合重组蛋白及其制备方法和应用技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种鸡贫血病毒凋亡素融合重组蛋白及
其制备方法和应用。
背景技术
细胞凋亡是一种程序性进程，在发育分化及维持机体恒定等都发挥着重要作用，
而肿瘤的发生、发展与细胞的过度增殖和凋亡的减少有关。凋亡素（apoptin）是由鸡贫血病
毒（CAV）编码的一种功能蛋白，可诱导所感染的靶细胞凋亡。随后的研究发现，凋亡素可选
择性诱导肿瘤细胞凋亡，但是对正常的二倍体细胞无损伤影响。
凋亡素除了具有广谱抗肿瘤的特性之外还有其他引起关注的优势：其诱导肿瘤细
胞凋亡时不依赖于p53的介导，这样就不会因为肿瘤细胞因P53发生突变而产生耐药性；同
时该过程也不被Bcl-2过度表达所抑制，一些研究表明共表达Bcl-2甚至可以提高凋亡素的
诱导凋亡作用。随着研究的深入，凋亡素与Bcl-2的功能互做被证实与核孤儿受体Nur77相
关，凋亡素可促进Nur77从细胞核转位到胞浆中，从而促进细胞色素C的释放，并启动一系列
诱导基因的表达。而凋亡素的特异性诱导肿瘤细胞凋亡的机制，主要因为自身羧基端所包
含的核定位信号，核定位信号只有在其108位丝氨酸残基被激酶磷酸化后才具备活性。因
此，凋亡素是一种胞内蛋白，不能直接透过细胞膜，只有进入肿瘤细胞内部才能表现出诱导
凋亡活性，即凋亡素只有在肿瘤细胞中才能定位于细胞核，并发挥抗肿瘤活性。凋亡素所具
有的这些特点，使其成为一种极具潜力的肿瘤抑制剂，具有广阔的研究和应用前景。
公开号为CN101081871A的中国专利公开了一种治疗肿瘤的蛋白转导域4-凋亡素
融合蛋白，其具有良好的穿透生物膜效应且能够诱导肿瘤细胞凋亡，对肿瘤细胞具有较大
杀伤力且不损伤正常细胞，不会发生导入外源基因的危险，该发明融合蛋白利用PTD4直接
将凋亡素Apoptin蛋白导入细胞，继而利用凋亡素Apoptin特异性地诱导肿瘤细胞凋亡。但
是，该专利使用pET-28a进行诱导表达，需要至少8小时的诱导时间，且诱导产物为包涵体，
表达量不高，为获得有活性的重组凋亡素，需要经过繁琐的复性变性等步骤，以完成后续的
蛋白纯化，增加了制备成本，且反复的操作过程中容易引起重组蛋白的降解。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的缺陷，提供一种鸡贫血病毒凋亡素融合重
组蛋白（msyB-Apoptin-TAT）及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种鸡贫血病毒凋亡素融合重组蛋白（msyB-Apoptin-TAT），所述鸡贫血病毒凋亡素融
合重组蛋白（msyB-Apoptin-TAT）的表达基因具有SEQ ID No.1的核苷酸序列和SEQ ID
No.2的氨基酸序列。
作为对上述技术方案的改进，本发明并提供了一种鸡贫血病毒凋亡素融合重组蛋
白（msyB-Apoptin-TAT）的制备方法，包括如下步骤：
S1、序列组装与优化：基于Genbank中鸡贫血病毒GD-12强毒株的VP3的氨基酸序列作为
凋亡素氨基酸序列，序列号为JX260426，于凋亡素氨基酸序列羧基端加入HIV-Tat蛋白的穿
透肽序列“YGRKKRRQRRR”，并在凋亡素与穿透肽之间加入柔性氨基酸接头序列“GGGGS”，将
组装好的所有序列进行密码子优化，在基因两端分别加上EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点合成并连
接至pUC19质粒，获得pUC19-Apoptin-TAT；
S2、重组质粒构建与菌株转化：将EcoR I和Xho I双酶切获得的pUC19-Apoptin-TAT基
因片段与同样双酶切回收的表达载体pBCX使用T4 DNA-ligase进行连接，将连接产物转化
E. coli BL21(DE3)菌株，使用检测上游引物5'-TGTCGTGGTGACTGCTTCTG-3'和下游引物5'-
TGGTCGGTACGCAAATCC-3'进行PCR菌液鉴定，经抗性筛选和质粒酶切鉴定检测分别筛选出重
组子BL21/pBCX-Apoptin-TAT，将得到的重组子进行测序分析；
S3、重组凋亡素的诱导表达：将经测序鉴定后的BL21/pBCX-Apoptin-TAT菌液接种至4
mL的LB液体培养基中，37℃，220 r/min下摇床培养，当OD600为0.6～0.8时，加入终浓度为1
mmol/L的IPTG进行诱导表达，以2 h为间隔，取0～6 h菌液，加入蛋白上样缓冲液，沸水中煮
7～8 min后进行SDS-PAGE电泳；
同时，设立空质粒pBCX/BL21诱导表达6 h菌液作为对照；
S4、表达产物纯化与可溶性分析：以4%的接种量将测序鉴定后的BL21/pBCX-Apoptin-
TAT菌液转接至100 mL新鲜的LB液体培养基中，以步骤3同样条件使用 IPTG诱导4 h，随后
取出菌液，3000 r/min，4℃离心10 min，收集菌泥加入3 mL PBS0悬浮菌体，然后于冰浴中
超声破碎，超声5 s，间隔8 s，功率250w，超声50次，共重复6次，4℃于10000 r/min离心20
min，裂解上清液经一站式His标记蛋白质微量纯化套装获得纯化后的鸡贫血病毒凋亡素融
合重组蛋白（msyB-Apoptin-TAT），所述鸡贫血病毒凋亡素融合重组蛋白（msyB-Apoptin-
TAT）的表达基因具有SEQ ID No.1的核苷酸序列和SEQ ID No.2的氨基酸序列。
作为对上述技术方案的改进，优选地，所述表达载体pBCX为pET32a经融合表达伴
侣msyB改造而成。
作为对上述技术方案的改进，优选地，所述表达载体pBCX的改造步骤如下：
S5、采用1对特异性引物msyBup（5’-ATT CAT ATG GTG ATG ACC ATG TAC GCA ACG-
3’）/msyBdn（5’-ATT CTA GTG ACG TTC ATC CCA CTC ATC ACG TTC -3’）从大肠杆菌基因
组中扩增msyB基因；
S6、在引物msyBup/ msyBdn两端分别加上NdeⅠ/SpeⅠ酶切位点；
S7、在msyB基因的3’端后有6 x His标签，在msyB基因和目的基因之间有肠激酶的作用
位点；
S8、将msyB基因插入pET32a质粒的NdeⅠ/SpeⅠ位点，得到新的表达载体pBCX。
作为对上述技术方案的改进，优选地，mysB基因片段的理论跨幅为378bp。
作为对上述技术方案的改进，本发明并提供了所述的鸡贫血病毒凋亡素融合重组
蛋白（msyB-Apoptin-TAT）在制备肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的优点和积极效果是：
1、本发明以CAV来源的apoptin基因为研究对象，在基因全序列3’端加入HIV-Tat蛋白
的穿透肽序列，以利于蛋白的转位和发挥作用，根据大肠杆菌密码子的偏爱性进行优化与
合成，克隆入原核表达PBCX质粒并利用大肠杆菌BL21中进行诱导表达，借助msyB作为融合
表达伴侣，获得高效可溶表达的凋亡素蛋白，为更好的利用凋亡素作为抗肿瘤药物奠定基
础。
2. 本发明使用的表达载体pBCX载体携带有msyB作为融合表达的标签，msyB是大
肠杆菌中的一种酸性蛋白，它是一种非常有效的蛋白可溶性标签，有助于重组蛋白高效可
溶性表达，并有效地帮助靶蛋白的正确结构折叠以维持生物学活性，且分子量相对较小，可
以在不降低诱导温度的同时促进目的蛋白的高效可溶表达，且不影响目的蛋白的生物学活
性，为使用原核表达系统制备生物活性蛋白提供了前提。
3. 本发明成功构建大肠杆菌表达载体pBCX-Apoptin-TAT，在37℃正常培养条件
下的大肠杆菌中得到大量可溶性表达产物，融合蛋白质分子量大小约为42 kD，50 mL菌液
即可获得1.5 mg左右的纯化重组蛋白，表达效率高，融合重组msyB-Apoptin-TAT高效可溶
表达；CCK-8实验结果显示纯化后的重组蛋白作用36 h后可对套氏淋巴瘤JEKO-1、REC-1细
胞生长产生超过60%的抑制率，对人脐静脉内皮细胞系HUVEC没有明显抑制的作用；显微镜
观察与DNA ladder实验证明重组蛋白可诱导JEKO-1、REC-1细胞的凋亡，对HUVEC没有诱导
凋亡的作用，表达产物具有特异抗肿瘤活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本
发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可
以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明凋亡素基因的融合表达模式图；
图2为本发明重组质粒的构建与鉴定的电泳图；
图3为本发明融合重组msyB-Apoptin-TAT的SDS-PAGE与免疫印迹分析结果图；
图4为本发明细胞生长抑制率效果图；
图5为本发明重组凋亡素对JEKO-1、REC-1和HUVEC细胞形态的影响的效果图；
图6为本发明重组凋亡素处理JEKO-1,REC-1和HUVEC细胞的DNA电泳图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他
实施例，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明的鸡贫血病毒凋亡素融合重组蛋白（msyB-Apoptin-TAT）的融合表达制备
方法，包括如下步骤：
S1、序列组装与优化：本发明使用凋亡素（apoptin）序列是基于Genbank中鸡贫血病毒
GD-12强毒株的VP3 (GenBank序列号：JX260426)的氨基酸序列，为了利于表达蛋白穿过作
用细胞的细胞膜，于凋亡素氨基酸序列羧基端加入HIV-Tat蛋白的穿透肽序列
“YGRKKRRQRRR”，并在凋亡素与穿透肽之间加入柔性氨基酸接头序列“GGGGS”，将组装好的
所有序列根据Codon Usage Database中E.coli K12的密码子使用频率表，利用OPTIMIZER
（http://genomes.urv.cat/OPTIMIZER/）服务器进行密码子优化，在基因两端分别加上
EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点进行合成并连接至pUC19质粒，获得pUC19-Apoptin-TAT。
S2、重组质粒构建与菌株转化：将EcoR I和Xho I双酶切获得的pUC19-Apoptin-
TAT基因片段与同样双酶切回收的表达载体pBCX使用T4 DNA-ligase进行连接，将连接产物
转化E.coli BL21(DE3)菌株，使用检测上游引物5'-TGTCGTGGTGACTGCTTCTG-3'和下游引物
5'-TGGTCGGTACGCAAATCC-3'进行PCR菌液鉴定，经抗性筛选和质粒酶切鉴定检测分别筛选
出重组子BL21/pBCX-Apoptin-TAT，将得到的重组子送上海生工进行测序分析。融合表达的
蛋白序列结构如图1所示，msyB为融合表达伴侣。
其中pBCX载体改造步骤如下：1、采用1对特异性引物msyBup（5’-ATT CAT ATG GTG
ATG ACC ATG TAC GCA ACG-3’）/msyBdn（5’-ATT CTA GTG ACG TTC ATC CCA CTC ATC ACG
TTC -3’）从大肠杆菌基因组中扩增msyB基因。msyB基因片段的理论跨幅为378bp。2、在引物
msyBup/ msyBdn两端分别加上NdeⅠ/SpeⅠ酶切位点。3、在msyB基因的3’端后有6 x His标
签。4、在msyB基因和目的基因之间有肠激酶的作用位点。将msyB基因插入pET32a质粒的Nde
Ⅰ/SpeⅠ位点，由此构建成功新的表达载体pBCX。
S3、重组凋亡素的诱导表达：将经测序鉴定后的BL21/pBCX-Apoptin-TAT菌液接种
至4 mL的LB液体培养基中，37℃，220 r/m下摇床培养；当OD600为0.6～0.8时，加入终浓度
为1 mmol/L IPTG进行诱导表达，以2 h为间隔，取0～6 h菌液，加入蛋白上样缓冲液进行
SDS-PAGE电泳；同时，设立空质粒pBCX/BL21诱导表达6 h菌液作为对照以确定蛋白诱导表
达的最合适时间。
S4、表达产物纯化与可溶性分析：以4%的接种量将BL21/pBCX-Apoptin-TAT菌种转
接至100 mL新鲜的LB液体培养基中，以步骤3同样条件使用IPTG诱导4 h。随后取出菌液，
3000 r/m，4℃离心10 min，收集菌泥加入3 mL PBS，悬浮菌体；然后于冰浴中超声破碎，超
声5 s, 间隔8 s，功率250w，超声50次，共重复6次，4℃于10,000 r/m离心20 min；上清进行
SDS-PAGE检测并经一站式His标记蛋白质微量纯化套装获得纯化后的融合重组msyB-
Apoptin-TAT。
表达产物的Western-blot鉴定：将表达菌裂解上清进行SDS-PAGE检测，随后使用
转膜仪进行半干转，15 V转膜20 min，用5%脱脂奶粉室温封闭1小时，采用6×His标签单抗
完成Western-blot分析，以进一步验证融合重组msyB-Apoptin-TAT的阅读框正确表达。
重组质粒的构建：分别将pBCX与含有密码子优化后凋亡素序列的pUC19-Apoptin-
TAT质粒用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果参见图2A（M：
marker，分子量标准，从大到小依次为5000，3000, 2000, 1500，1000, 750, 500, 250,
100bp；1: pUC19--Apoptin-TAT 经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切；2：pBCX经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切）。由
图2A可知：pUC19-Apoptin-TAT酶切产物有两条清晰的条带，一条为pUC19质粒的片段，另一
条为417 bp的目的基因的片段。
将Apoptin-TAT条带与双酶切后的pBCX切割回收后用T4 DNA-ligase进行连接，转
化BL21感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选后，再进行PCR菌液鉴定，结果如图2B 所示，（
M：marker，分子量标准，从大到小依次为2000，1000,750,500,250,100bp；1~5, BL21/
pBCX-Apoptin-TAT克隆子经PCR鉴定结果；N: 阴性对照）。由电泳图可以看出：5个克隆菌均
为阳性。
为了进一步确定结果，对阳性菌落进行扩大培养，质粒抽提后进行酶切鉴定，鉴定
结果如图2C（M：marker，分子量标准，从大到小依次为2000，1000, 750, 500, 250, 100bp；
1~4, BL21/ pBCX-Apoptin-TAT克隆子经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定结果）所示，结果显示利
用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，包括417 bp目的基因的片段和空质粒片段，表明挑取的菌落均为阳
性重组子，送苏州鸿迅进行测序鉴定，结果与预期的相符。
重组蛋白的表达、纯化及免疫原性分析：将挑取的阳性重组子BL21/pBCX-
Apoptin-TAT进行诱导剂诱导表达，BL21/pBCX作为阴性对照，分别于诱导后0、2 h、4 h与6
h取1 mL菌液进行SDS-PAGE分析。最终收集50 mL发酵液中的菌体经碱裂解及中和后收集裂
解上清，用一站式His标记蛋白质微量纯化套装进行纯化，最终分容至5 mL。将裂解上清液
和纯化后的产物一并进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示（M：蛋白预染marker，分子量标准，
从大到小依次为170，130, 100,70,55,40,35， 25，15，10bp；图3A，1~4泳道, BL21/ pBCX-
Apoptin-TAT 诱导 0~6 h 的表达产物；5,expressed products of BL21/pBCX。图3B，1,
BL21/ pBCX-Apoptin-TAT在裂解菌体上清中的表达产物；2, 纯化的融合重组msyB-
Apoptin-TAT；图3C，1, 融合重组msyB-Apoptin-TAT的免疫印迹分析）。
结果显示，重组子BL21/pBCX-Apoptin-TAT在37℃正常培养条件下的大肠杆菌中
得到大量可溶性表达产物，融合蛋白质分子量大小约为42 kDa，同时，结果也表明经过His
标签亲和层析后，获得了电泳纯的融合重组蛋白。利用考马斯亮蓝法测得纯化后的msyB-
Apoptin-TAT的浓度为0.3 mg/mL，50 mL菌液获得的重组蛋白总量约为1.5 mg，说明融合重
组msyB-Apoptin-TAT高效可溶性表达。免疫印迹实验结果表明重组表达的蛋白表达框正
确，有免疫原性。
表达产物的抗肿瘤活性：JEKO-1、REC-1、HUVEC细胞均使用RPMI-1640培养基（含
10%胎牛血清），置37℃、5％CO2培养箱中培养。处理前将各组细胞接种于96孔板，培养24 h
后分别加入纯化后的融合蛋白药物 50μL，使融合重组msyB-Apoptin-TAT终浓度为 100μg/
mL，同时设置纯化蛋白透析所用PBS缓冲液作为处理对照。随后将各组细胞置培养箱中继续
培养，药物处理24 h后使用光学显微镜拍摄细胞凋亡形态，同时分别于12 h、24h及36 h按
照CCK-8检测试剂盒说明书操作步骤加CCK-8，使每孔CCK-8 终浓度为10％，继续培养1.5小
时后用酶标仪在450nm 波长下测定每孔的吸光度（A）值，并计算抑制率，抑制率=（对照组A
值-实验组A值/对照组A值）×100%。同时收获药物处理48 h的细胞抽提DNA，以1.2%琼脂糖
凝胶电泳分析不同处理组染色体碎裂的片段化情况，为了有利于分析实验结果，使用依托
泊苷（20μg/mL）处理JEKO细胞48 h作为凋亡阳性对照，鉴定结果见图5。
由图4可知，纯化后的重组蛋白作用36 h后可对套氏淋巴瘤JEKO-1、REC-1细胞生
长产生超过60%的抑制率，对人脐静脉内皮细胞系HUVEC没有明显抑制的作用，说明随着药
物作用时间的延长，重组蛋白对肿瘤细胞系JEKO-1、REC-1有明显的抑制作用，而对正常细
胞系HUVEC没有明显抑制的作用。
重组蛋白诱导细胞凋亡：于显微镜下观察融合重组msyB-Apoptin-TAT处理24 h后
的各组细胞，如图5所示。结果表明，200×放大光镜下，JEKO-1和REC-1都出现了细胞破碎、
膨大以及颗粒裂解物，而各对照组细胞以及药物处理的HUVEC细胞都没有明显改变，说明融
合重组msyB-Apoptin-TAT只诱导肿瘤细胞系JEKO-1、REC-1出现凋亡，而对正常细胞系
HUVEC没有影响。
多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，细胞核DNA随机地在核小体的连
接部位被酶切断，降解为180~200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电
泳，可显示以180~200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。本发明抽提重组Apoptin-
TAT处理48 h后的各组细胞DNA并进行琼脂糖凝胶电泳分析，如图6所示（M：marker，分子量
标准，以100 bp为间隔直到10000 bp；1, JEKO-1细胞经 PBS缓冲液处理；2, JEKO-1 细胞
经融合重组msyB-Apoptin-TAT处理；3, REC-1细胞经 PBS缓冲液处理；4, REC-1细胞经融
合重组msyB-Apoptin-TAT处理；5. HUVEC 细胞经 PBS缓冲液处理；6, HUVEC细胞经融合重
组msyB-Apoptin-TAT处理；7, JEKO-1细胞经依托泊苷处理）。结果表明，与依托泊苷处理的
JEKO-1细胞相类似，融合重组msyB-Apoptin-TAT诱导JEKO-1和REC-1都出现了染色体断裂
的核小体DNA ladders特征电泳图像，而各对照组细胞以及药物处理的HUVEC细胞没有出
现，说明msyB-Apoptin-TAT只诱导肿瘤细胞系JEKO-1、REC-1出现凋亡，而对正常细胞系没
有影响。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通
技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案
的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQ ID No.1。
ATGAACGCGCTGCAAGAAGATACCCCGCCGGGTCCAAGCACCGCTTTCCGTCCGCCGACCAGCAGCCGTCCAT
TGGAAACCCCGCACTGCCGTGAGATTCGTATCGGTATTGCGGGTATCACCATTACCCTGAGCTTGTGCGGTTGTGCT
AATGCGCGTGCTCCAACCCTGCGTAGCGCTACCGCTGATAACAGCGAAAGCACCGGTTTTAAGAATGTTCCGGATTT
GCGTACCGACCAGCCGAAACCGCCGAGCAAGAAACGTAGCTGCGACCCGAGCGAGTACCGTGTTAGCGAACTGAAGG
AGAGCTTGATCACCACCACCCCGAGCCGTCCACGTACCGCTCGTCGTTGTATTCGTCTGGGTGGTGGTGGTAGCTAC
GGTCGTAAGAAACGTCGTCAACGTCGTCGT
SEQ ID No.2。
MetAsnAlaLeuGlnGluAspThrProProGlyProSerThrAlaPheArgProProThrSerSerArgProL
euGluThrProHisCysArgGluIleArgIleGlyIleAlaGlyIleThrIleThrLeuSerLeuCysGlyCysAla
AsnAlaArgAlaProThrLeuArgSerAlaThrAlaAspAsnSerGluSerThrGlyPheLysAsnValProAspLe
uArgThrAspGlnProLysProProSerLysLysArgSerCysAspProSerGluTyrArgValSerGluLeuLysG
luSerLeuIleThrThrThrProSerArgProArgThrAlaArgArgCysIleArgLeuGlyGlyGlyGlySerTyr
GlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg