一种精氨酸利用能力提高的解淀粉芽孢杆菌及其应用技术领域
本发明涉及一种精氨酸利用能力提高的解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于食品微生
物技术领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种致癌物质，被人体持续过量摄入可能
会引发肺癌、肝癌等严重肿瘤疾病，并且对人体的免疫系统造成伤害。
酱油是食品工业广泛使用的一种发酵调味品，是具有独特色、香、味的营养丰富的
功能性食品，在中国已有2500年的生产历史。近年的研究结果表明，潜在的致癌物质氨基甲
酸乙酯(EC)，在酱油中尤其是日式工艺所生产的酱油中广泛存在，这严重的影响了酱油的
食品安全性。
酿造酱油中氨基甲酸乙酯的主要前体物质是瓜氨酸与乙醇。因此降低酱油中瓜氨
酸的含量是我们降低酱油中氨基甲酸乙酯有效措施之一。在酱油生产前期，原料水解出大
量精氨酸，这些精氨酸在一大类厌氧或兼性厌氧的乳酸菌的作用下，被转化为瓜氨酸。如果
这些精氨酸被一些具有完整精氨酸脱亚氨基途径的菌株利用，将精氨酸转化成鸟氨酸，就
能降低酱油中的瓜氨酸积累。因此，筛选一株能够耐受高盐，并且能够高效利用精氨酸且不
积累瓜氨酸的菌株，对于降低酱油中精氨酸含量，从而降低氨基甲酸乙酯的含量有重要应
用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种可高效利用精氨酸和瓜氨酸的解淀粉芽孢杆菌
(Bacillus amyloliquefaciens)JY06-A8，已于2016年10月20日保藏于中国典型培养物保
藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016580，保藏地址为中国武汉武汉大学。
本发明的第二个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌JY06-A8的培养方法，是将所述
的解淀粉芽孢杆菌接种至培养基中，在37℃下培养24～48h。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基为含NaCl的LB培养基，其中NaCl含量为
80～180g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基含有酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨
5g/L，NaCl 180g/L，葡萄糖0.5g/L，Tween-801g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O
0.05g/L，FeSO40.4g/L，柠檬酸三胺2g/L，CaCO30.1g/L，吡哆醛-5-磷酸0.05g/L，K2HPO42g/
L，精氨酸5g/L，pH 6.0。
在本发明的一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌JY06-A8培养条件为：将保藏的
诱变菌株在含100g/L NaCl的LB固体培养基上划线，于37℃静置培养2d，挑取单菌落接入含
100g/LNaCl的LB液体培养基，37℃静置培养36h，离心1min(8000rpm，4℃)后去上清，所获得
菌体的用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.0)重悬浮。
本发明的第三个目的是提供一种降低精氨酸含量的方法，是将所述的解淀粉芽孢
杆菌JY06-A8接种至含精氨酸的液体、半固体或固体中，30～37℃培养至少24h。
本发明的第四个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌JY06-A8在降低食品中精氨酸含
量方面的应用。
本发明还提供所述解淀粉芽孢杆菌JY06-A8在制备发酵食品、调味品、保健品中的
应用。
有益效果：本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JY06-A8能
够在高盐条件下高效利用精氨酸和瓜氨酸，其对精氨酸的利用率达到了96％，且不积累瓜
氨酸，该菌株传代200代后精氨酸利用能力仍高于初始菌株2.01倍，具备良好的传代稳定
性。
生物材料保藏
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JY06-A8，已于2016年10月20日
保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016580，保藏地址为中国武汉，
武汉大学。
附图说明
图1为菌株驯化流程图；
图2为解淀粉芽孢杆菌遗传稳定性比较；JY06，解淀粉芽孢杆菌JY06；A8，解淀粉芽
孢杆菌JY06-A8。
具体实施方式
氨基酸检测培养基：酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl 180g/L，葡萄
糖0.5g/L，Tween-801g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 0.05g/L，FeSO40.4g/L，柠檬酸
三胺2g/L，CaCO30.1g/L，吡哆醛-5-磷酸0.05g/L，K2HPO42g/L，pH 6.0。用于检测特定氨基酸
时，添加氨基酸6g/L。
解淀粉芽孢杆菌JY06-A8培养方法：将保藏的诱变菌株在含100g/LNaCl的LB固体
培养基上划线，于30℃静置培养2d，挑取单菌落接入含100g/LNaCl的LB液体培养基，30℃静
置培养36h，离心1min(8000rpm，4℃)后去上清，所获得菌体的用磷酸盐缓冲液(PBS，pH
7.0)重悬浮。
实施例1解淀粉芽孢杆菌的筛选
根据如下步骤进行筛选：将解淀粉芽孢杆菌JY06接种至LB液体培养基，37℃，
220rpm/min摇床培养至对数生长期(10～12h)。
(2)取2mL活化好的JY06菌液接种至含有不同浓度精氨酸(10～100g/L)的驯化培
养基中，在37℃，220rpm/min的条件下摇床培养。
(3)驯化培养要达到200～300代，如图1所示：
(4)将活化菌液稀释至10-4～10-6三个浓度，取稀释液涂布于筛选培养基中，置于
37℃恒温培养箱中培养24～36h，每个处理重复三次。
(5)挑取菌落进行高通量复筛
移取50μL满足初筛条件的菌株所对应的上清液于1.5mL的离心管中，然后再分别
向离心管中加入40g/LNaOH溶液、80g/L甲萘酚正丙醇溶液和0.5mL/L双乙酰正丙醇溶液各
1mL，震荡摇匀后，放入30℃水浴锅中显色15min。取出冷却一段时间后，在分光光度计上测
吸光值OD540，以未接种的培养基作为对照。吸光值OD540较小的菌株即为高效利用精氨酸的
菌株。
实施例2解淀粉芽孢杆菌JY06-A8利用精氨酸能力分析
分别挑取平板上活化好的原始菌株解淀粉芽孢杆菌JY06和经驯化的菌株解淀粉
芽孢杆菌JY06-A8的单菌落接种于100g/LNaCl的LB液体培养基中，37℃静置培养36小时，取
5mL菌液离心1min(8000rpm，4℃)弃上清，所获菌体加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.0)重悬
浮。
向5mL离心管中加入4mL含10g/L的精氨酸的氨基酸检测培养基，接种500μL的悬浮
菌液，接种后OD600为7.8。30℃静置培养3天后用HPLC的方法检测培养基中精氨酸和瓜氨酸
以及鸟氨酸含量
表1精氨酸代谢相关氨基酸含量
注：ΔArg(g/L)：精氨酸的消耗量；ΔCit(g/L)：瓜氨酸的生成量；ΔOrn(g/L)：鸟
氨酸的生成量
由表1可知，经驯化的JY06-A8代谢精氨酸的能力与对照相比提高了18.4％，并且
精氨酸向鸟氨酸的转化率也提高了53.8％。
实施例3：解淀粉芽孢杆菌JY06-A8传代稳定性
分别将解淀粉芽孢杆菌JY06和经驯化的JY06-A8接种至LB液体培养基培养，37℃，
220rmp/min培养，每隔24h转接至新的LB液体培养基中，培养20d后，取4mL菌液离心去上清，
用无菌水清洗菌体两遍，加入等体积的精氨酸利用培养基，30℃静置培养3～5d。
取1mL样品，离心后取上清。用5％的三氯乙酸将上清液稀释20倍后，经孔径为0.22
μm的滤膜过滤。用高效液相色谱法测定样品中精氨酸含量。如图1所示，JY06-A8对精氨酸利
用情况的遗传稳定性良好。传代200代后，JY06-A8代谢精氨酸并转化成鸟氨酸的能力依然
高于原始菌株(JY06)2.01倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技
术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范
围应该以权利要求书所界定的为准。