一种含有聚组氨酸的抗癌多肽及其制备与应用技术领域
本发明涉及抗肿瘤多肽药物领域，具体涉及的是一种含有聚组氨酸的抗癌多肽及
其制备与应用。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁人类的健康与生命，其中卵巢癌是一种常见的妇科癌症，发病
率继乳腺癌和子宫体癌位居第三，且恶性程度高，致死率仅次于乳腺癌，严重威胁着妇女的
生命。目前的大多数抗肿瘤药物存在选择性低、毒副作用强、易产生耐药性等缺点，迫切需
要研究和开发新的抗肿瘤药物。
肿瘤的耐药性一直是困扰癌症治疗的一个重大障碍。而高效抗癌多肽，作为一种
直接强效破坏肿瘤细胞的候选药物，由于其特殊的作用机理，不易发生肿瘤耐药性，正受到
越来越多人的关注。开发具有药用价值的抗肿瘤多肽具有广泛的市场前景。然而，抗癌多肽
也有自身的局限性，主要是选择性差。
人们通过实验发现许多实体瘤的细胞外pH值比正常组织要低。肿瘤组织的酸性主
要来源于肿瘤脉管系统的混乱、肿瘤细胞增加的糖酵解、质子输出的增加、肿瘤组织间液缓
冲能力的降低及扩散减缓等因素。基于这样的机理，设计具有pH响应的生物活性多肽，使之
能区分正常组织和肿瘤；用这类多肽选择性地在酸性环境中杀死肿瘤细胞，而不影响生理
pH条件下的正常组织，是非常有意义的。
His标签是蛋白质重组技术中经常用到的一种标签，其序列为六个组氨酸HHHHHH，
组氨酸由于它的特殊侧链，pKa值大约6.05，这意味着pH在6左右偏移很少一点就会改变它
的电荷。多肽中组氨酸侧链的pKa值与自由组氨酸的侧链略有不同。当周围环境的pH从中性
变为酸性，多肽的电荷就可以朝正电方向转化，使多肽更易与靶细胞结合。具有疏水的烷基
链和带正电的氨基酸残基的多肽具有两亲性，在疏水环境中，可以使疏水的氨基酸残基和
带正电的氨基酸残基分别处于分子的两侧；即可诱导形成α-螺旋或β-折叠结构。这些多肽
通过插入、裂解细胞膜，增加了其通透性，导致了癌细胞活性降低和死亡。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题和实际需求，本发明的目的在于提供一种选择性
高、毒副作用弱、不易产生耐药性的抗癌多肽及其制备与应用，该抗癌多肽是一类新型的用
于多种癌症治疗的药物，特别是对卵巢癌治疗效果明显，在体外对人肺癌细胞、人卵巢癌细
胞及乳腺癌细胞均具有杀灭作用，在体内对小鼠体内卵巢癌SKOV-3肿瘤的生长具有抑制作
用，证明了聚组氨酸多肽对多种癌症具有很好的治疗效果，为实现人肺癌、人卵巢癌及乳腺
癌的临床治疗提供了重要的参考。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种抗癌多肽由组氨酸、连接基团通过酰胺键连接而成。
本发明提供一种抗癌多肽的结构如下所示：
所述聚组氨酸多肽序列中含有4-8个组氨酸，优选6个组氨酸；多肽序列可以是一
条或多条，优选一条或两条。
本发明所述的抗癌多肽，多肽序列优选H6多肽序列。一是为了增强肽链的水溶性，
二是为了增强癌细胞对多肽H6的摄入，增强抗癌多肽在肿瘤组织中的积累。
根据本发明所述的抗癌多肽，所述连接基团为烷基链或聚乙二醇链。
具体地说，本发明所述连接基团优选的是：
其中：烷基酸含有0-16个碳，聚乙二醇含有0-5个乙二醇单体。
本发明所述的抗癌多肽的制备，包括以下步骤：
(1)将Rink酰胺树脂和连接基团置于反应瓶中，加入有机碱和缩合剂，在DMF溶液
中反应后，再脱除Fmoc保护基团，得到与连接基团偶联的树脂；
(2)将步骤(1)得到的树脂和Fmoc-His(Trt)-OH置于反应瓶中，加入有机碱和缩合
剂，在DMF溶液中反应后，再脱除Fmoc保护基团；
(3)依次重复步骤(2)3-7次，最终得到与上述所需氨基酸依次偶联的树脂；
(4)将步骤(3)得到的与上述所需氨基酸依次偶联的树脂与连接基团，置于反应瓶
中，加入有机碱和缩合剂，在DMF溶液中反应后，得到进一步与带有连接基团偶联的树脂；
(5)重复步骤(1)、(2)、(3)零到一次；
(6)重复步骤(4)；
(7)切割步骤(6)所得到的与氨基酸依次偶联的树脂，得到抗癌多肽。
进一步，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺，所述耦合剂为六氟磷酸苯并三唑-1-
基-氧基三吡咯烷基。
本发明所述的抗癌多肽为白色粉末状固体。
本发明公开的抗癌多肽，进一步优选的多肽I-II分别为：
多肽I：H6-C12-H6-C16，如多肽1结构式为：
其中H6代表含有6个组氨酸的多肽，C12代表含有12个碳的烷基链，C16代表含有16个
碳的棕榈酸。
多肽II：H6-PEG5-H6-C16，如多肽2结构式为：
其中H6代表含有6个组氨酸的多肽，PEG5代表含有5个乙二醇单体的连接基团，C16
代表含有16个碳的棕榈酸。
多肽III：C12-H6-C16，如多肽3结构式为：
其中C12代表含有12个碳的烷基链，H6代表含有6个组氨酸的多肽，C16代表含有16个
碳的棕榈酸。
多肽IV：H6-C16，如多肽4结构式为：
其中H6代表含有6个组氨酸的多肽，C16代表含有16个碳的棕榈酸。
本发明还提供所述含有聚组氨酸的抗癌多肽或所述方法制备的多肽用于抗肿瘤
方面的应用。
进一步，所述含有聚组氨酸的抗癌多肽或所述方法制备的多肽用于抗肺癌、人卵
巢癌及乳腺癌上的应用。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种含有聚组氨酸的抗癌多肽及其制备和应用。本发明采用多肽固
相合成技术，构建了一系列富含组氨酸且具有膜裂解和抗肿瘤活性的多肽，它们对人卵巢
癌SKOV-3细胞、肺癌A549细胞和人乳腺癌MCF-7细胞均具有杀伤作用；抗肿瘤多肽在相同剂
量下，只能杀死肿瘤细胞，对正常细胞无毒副作用。本发明合成的多肽由天然组氨酸和烷基
链组成，结构简单，人工合成方便；显示其在抗肿瘤药物开发方面具有重要的应用价值。
附图说明
图1为多肽1和2的高效液相色谱(HPLC)和飞行时间质谱分析谱图；
图2为多肽3和4的高效液相色谱(HPLC)和飞行时间质谱分析谱图；
图3为多肽1-4对卵巢癌SKOV-3细胞的MTT毒性分析；
图4为多肽1-4对肺癌A549细胞的MTT毒性分析；
图5为多肽1-4对乳腺癌MCF-7细胞的MTT毒性分析；
图6为多肽1对卵巢癌SKOV-3荷瘤小鼠实体瘤抑制效果图；
图7为多肽1对卵巢癌SKOV-3荷瘤小鼠体重的影响。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合附图和实施例进一步阐明本发明的内容，但本
发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
本发明所用试剂：
本发明所用仪器：
仪器
厂家
高效液相色谱仪
GE,AKTA
微波多肽合成仪
CEM
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪
ABSCIE,4800Plus
制备实施例1：
所述的抗癌多肽1的制备，包括以下步骤：
(1)将Rink酰胺树脂(309mg,0.810mmol/g,0.25mmol,1equiv)加入DMF/DCM(v/v＝
1/1；10mL)溶胀3h，用DMF清洗树脂，然后用哌啶/DMF(v/v＝1/4；10mL)脱除Fmoc保护基团，
反应20分钟；用DMF清洗树脂，将Fmoc-His(Trt)-OH(0.75mmol,3.0equiv)置于反应瓶中，加
入有机碱(2.5mmol,10equiv)和缩合剂(0.75mmol,3.0equiv)，在DMF溶液中反应3小时后，
再脱除Fmoc保护基团，得到与组氨酸偶联的树脂；
(2)将与第一个组氨酸反应后的Rink酰胺树脂与Fmoc-His(Trt)-OH(0.75mmol,
3.0equiv)置于反应瓶中，加入有机碱(2.5mmol,10equiv)和缩合剂(0.75mmol,3.0equiv)，
在DMF溶液中，室温条件下反应3小时。反应完毕后，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，然后用
哌啶/DMF(v/v＝1/4；10mL)脱除保护基团，反应20分钟，得到与两个组氨酸偶联的树脂；
(3)依次重复步骤(2)4次，最终得到与上述氨基酸依次偶联的树脂；
(4)将步骤(3)得到的与上述氨基酸依次偶联的树脂和Fmoc保护的氨基十二酸置
于反应瓶中，加入有机碱(2.5mmol,10equiv)和缩合剂(0.75mmol,3.0equiv)，在DMF溶液
中，室温条件下反应3小时。反应完毕后，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，然后用哌啶/DMF
(v/v＝1/4；10mL)脱除保护基团，反应20分钟，得到带有氨基十二酸C12的树脂；
(5)重复步骤(2)6次；
(6)重复步骤(4)，将原料Fmoc保护的氨基十二酸换成烷基链C16(0.75mmol,
3.0equiv)。
(7)10mL三氟乙酸：水：三异丙基硅烷(95:2.5:2.5)切割步骤(6)所得的树脂，产品
经C18制备柱分离制备，得到抗癌多肽1，冻干后得到白色粉末状固体75mg。
所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺，所述耦合剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三
吡咯烷基。
进一步的，所述HPLC方法为使用GE AKTApurifier100系统配备C18制备柱(3cm×
25cm,10μm)，紫外220nm波长检测，梯度淋洗50分钟，流速17mL/min，其中流动相A为超纯水
(0.05％TFA)，B为甲醇(0.05％TFA)；起始浓度为30％A和70％B，线性梯度淋洗至100％B。
制备实施例2：
所述的抗癌多肽2的制备，包括以下步骤：
(1)将Rink酰胺树脂(309mg,0.810mmol/g,0.25mmol,1equiv)加入DMF/DCM(v/v＝
1/1；10mL)溶胀3h，用DMF清洗树脂，然后用哌啶/DMF(v/v＝1/4；10mL)脱除Fmoc保护基团，
反应20分钟；用DMF清洗树脂，将Fmoc-His(Trt)-OH(0.75mmol,3.0equiv)置于反应瓶中，加
入有机碱(2.5mmol,10equiv)和缩合剂(0.75mmol,3.0equiv)，在DMF溶液中反应3小时后，
再脱除Fmoc保护基团，得到与组氨酸偶联的树脂；
(2)将与第一个组氨酸反应后的Rink酰胺树脂与Fmoc-His(Trt)-OH(0.75mmol,
3.0equiv)置于反应瓶中，加入有机碱(2.5mmol,10equiv)和缩合剂(0.75mmol,3.0equiv)，
在DMF溶液中，室温条件下反应3小时。反应完毕后，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，然后用
哌啶/DMF(v/v＝1/4；10mL)脱除保护基团，反应20分钟，得到与两个组氨酸偶联的树脂；
(3)依次重复步骤(2)4次，最终得到与上述氨基酸依次偶联的树脂；
(4)将步骤(3)得到的与上述氨基酸依次偶联的树脂和Fmoc保护的聚乙二醇置于
反应瓶中，加入有机碱(2.5mmol,10equiv)和缩合剂(0.75mmol,3.0equiv)，在DMF溶液中，
室温条件下反应3小时。反应完毕后，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，然后用哌啶/DMF(v/v
＝1/4；10mL)脱除保护基团，反应20分钟，得到带有聚乙二醇PEG5的树脂；
(5)重复步骤(2)6次；
(6)重复步骤(4)，将原料Fmoc保护的聚乙二醇换成烷基链C16(0.75mmol,
3.0equiv)。
(7)10mL三氟乙酸：水：三异丙基硅烷(95:2.5:2.5)切割步骤(6)所得的树脂，产品
经C18制备柱分离制备，得到抗癌多肽2，冻干后得到白色粉末状固体80mg。
所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺，所述耦合剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三
吡咯烷基。
进一步的，所述HPLC方法为使用GE AKTApurifier100系统配备C18制备柱(3cm×
25cm,10μm)，紫外220nm波长检测，梯度淋洗50分钟，流速17mL/min，其中流动相A为超纯水
(0.05％TFA)，B为甲醇(0.05％TFA)；起始浓度为30％A和70％B，线性梯度淋洗至100％B。
制备实施例3：
所述的抗癌多肽3的制备，包括以下步骤：
(1)将Rink酰胺树脂(309mg,0.810mmol/g,0.25mmol,1equiv)加入DMF/DCM(v/v＝
1/1；10mL)溶胀3h，用DMF清洗树脂，然后用哌啶/DMF(v/v＝1/4；10mL)脱除Fmoc保护基团，
反应20分钟；用DMF清洗树脂，将Fmoc保护的氨基十二酸置于反应瓶中，加入有机碱
(2.5mmol,10equiv)和缩合剂(0.75mmol,3.0equiv)，在DMF溶液中反应3小时后，再脱除
Fmoc保护基团，得到与氨基十二酸偶联的树脂；
(2)将与氨基十二酸反应后的Rink酰胺树脂与Fmoc-His(Trt)-OH(0.75mmol,
3.0equiv)置于反应瓶中，加入有机碱(2.5mmol,10equiv)和缩合剂(0.75mmol,3.0equiv)，
在DMF溶液中，室温条件下反应3小时。反应完毕后，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，然后用
哌啶/DMF(v/v＝1/4；10mL)脱除保护基团，反应20分钟，得到与一个组氨酸偶联的树脂；
(3)依次重复步骤(2)5次，最终得到与上述氨基酸依次偶联的树脂；
(4)将步骤(3)得到的与上述氨基酸依次偶联的树脂和烷基链C16(0.75mmol,
3.0equiv)置于反应瓶中，加入有机碱(2.5mmol,10equiv)和缩合剂(0.75mmol,3.0equiv)，
在DMF溶液中，室温条件下反应3小时。反应完毕后，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，然后用
哌啶/DMF(v/v＝1/4；10mL)脱除保护基团，反应20分钟，得到带有烷基链C16的树脂；
(5)10mL三氟乙酸：水：三异丙基硅烷(95:2.5:2.5)切割步骤(4)所得的树脂，产品
经C18制备柱分离制备，得到抗癌多肽3，冻干后得到白色粉末状固体76mg。
所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺，所述耦合剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三
吡咯烷基。
进一步的，所述HPLC方法为使用GE AKTApurifier100系统配备C18制备柱(3cm×
25cm,10μm)，紫外220nm波长检测，梯度淋洗50分钟，流速17mL/min，其中流动相A为超纯水
(0.05％TFA)，B为甲醇(0.05％TFA)；起始浓度为30％A和70％B，线性梯度淋洗至100％B。
制备实施例4：
所述的抗癌多肽4的制备，包括以下步骤：
(1)将Rink酰胺树脂(309mg,0.810mmol/g,0.25mmol,1equiv)加入DMF/DCM(v/v＝
1/1；10mL)溶胀3h，用DMF清洗树脂，然后用哌啶/DMF(v/v＝1/4；10mL)脱除Fmoc保护基团，
反应20分钟；用DMF清洗树脂，将Fmoc-His(Trt)-OH(0.75mmol,3.0equiv)置于反应瓶中，加
入有机碱(2.5mmol,10equiv)和缩合剂(0.75mmol,3.0equiv)，在DMF溶液中反应3小时后，
再脱除Fmoc保护基团，得到与组氨酸偶联的树脂；
(2)将与第一个组氨酸反应后的Rink酰胺树脂与Fmoc-His(Trt)-OH(0.75mmol,
3.0equiv)置于反应瓶中，加入有机碱(2.5mmol,10equiv)和缩合剂(0.75mmol,3.0equiv)，
在DMF溶液中，室温条件下反应3小时。反应完毕后，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，然后用
哌啶/DMF(v/v＝1/4；10mL)脱除保护基团，反应20分钟，得到与两个组氨酸偶联的树脂；
(3)依次重复步骤(2)4次，最终得到与上述氨基酸依次偶联的树脂；
(4)将步骤(3)得到的与上述氨基酸依次偶联的树脂和烷基链C16(0.75mmol,
3.0equiv)置于反应瓶中，加入有机碱(2.5mmol,10equiv)和缩合剂(0.75mmol,3.0equiv)，
在DMF溶液中，室温条件下反应3小时。反应完毕后，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，然后用
哌啶/DMF(v/v＝1/4；10mL)脱除保护基团，反应20分钟，得到带有烷基链C16的树脂；
(5)10mL三氟乙酸：水：三异丙基硅烷(95:2.5:2.5)切割步骤(4)所得的树脂，产品
经C18制备柱分离制备，得到抗癌多肽4，冻干后得到白色粉末状固体72mg。
所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺，所述耦合剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三
吡咯烷基。
进一步的，所述HPLC方法为使用GE AKTApurifier100系统配备C18制备柱(3cm×
25cm,10μm)，紫外220nm波长检测，梯度淋洗50分钟，流速17mL/min，其中流动相A为超纯水
(0.05％TFA)，B为甲醇(0.05％TFA)；起始浓度为30％A和70％B，线性梯度淋洗至100％B。
本发明所涉及所有其它多肽的制备均用上述方法制备，根据所制备的多肽适应性
的调整所需的原料。
效果实施例1.抗癌多肽1-4对卵巢癌SKOV-3细胞的MTT毒性分析
在细胞层面上检测抗癌多肽1-4对卵巢癌SKOV-3细胞的MTT毒性分析。分别在卵巢
癌SKOV-3细胞中加入浓度为1，2，4，8，16，32，64，128μM抗癌多肽1-4，培养基为对照，孵育24
小时，然后采用MTT法测定细胞毒性。实验发现，多肽1和2对SKOV-3细胞的毒性较大，多肽3
次之，多肽4最小。参见图3，抗癌多肽1和2对卵巢癌SKOV-3细胞毒性较大。
效果实施例2.抗癌多肽1-4对肺癌A549细胞的MTT毒性分析
在细胞层面上检测抗癌多肽1-4对肺癌A549细胞的MTT毒性分析。分别在肺癌A549
细胞中加入浓度为1，2，4，8，16，32，64，128μM抗癌多肽1-4，培养基为对照，孵育24小时，然
后采用MTT法测定细胞毒性。实验发现，多肽1、2和3对A549细胞的毒性较大，多肽4最小。参
见图4，抗癌多肽1、2和3对肺癌A549细胞毒性较大。
效果实施例3.抗癌多肽1-4对乳腺癌MCF-7细胞的MTT毒性分析
在细胞层面上检测抗癌多肽1-4对乳腺癌MCF-7细胞的MTT毒性分析。分别在乳腺
癌MCF-7细胞中加入浓度为1，2，4，8，16，32，64，128μM抗癌多肽1-4，培养基为对照，孵育24
小时，然后采用MTT法测定细胞毒性。实验发现，多肽1、2和3对MCF-7细胞的毒性较大，多肽4
最小。参见图5，抗癌多肽1、2和3对乳腺癌MCF-7细胞毒性较大。
效果实施例4.抗癌多肽1对卵巢癌SKOV-3荷瘤小鼠的抑瘤效果和体重影响分析
建立卵巢癌小鼠模型：大量培养卵巢癌SKOV-3细胞，收集对数生长期的细胞，去除
培养液，用PBS洗涤两次，将细胞密度调整到1×107/ml，在裸鼠的右侧腋下注射0.2ml约2×
106细胞，然后继续饲养，每天观察裸鼠的生长情况，并观察是否有实体瘤生成。确认小鼠荷
瘤后，当肿瘤直径达到100mm3，开始给药。组(1)每天每只老鼠尾静脉注射PBS；组(2)每天每
只老鼠尾静脉注射0.1mL药物(顺铂，5mg/Kg)；组(3)每天每只老鼠尾静脉注射药物(多肽1，
5mg/Kg)。测量记录每只老鼠肿瘤大小及体重：给药间隔2天/次；给药之前称重、测量肿瘤大
小，间隔时间2天/次；
通过比较以上3组卵巢癌小鼠肿瘤体积大小和体重发现，多肽1给药组肿瘤增长明
显小于对照组和顺铂给药组，参见图6。另外，小鼠体重没有明显区别，说明多肽1对小鼠的
系统毒性很小，对小鼠生长体重无影响，参见图7。
本发明所要求保护的含有聚组氨酸的抗癌多肽经实验证明均具有类似上述效果
例所述的功能，即本发明提供的抗癌多肽如下所示：
以上显示和描述了本发明，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例
的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和
改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同
物界定。