精品肝素和制备精品肝素的方法.pdf

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1、10申请公布号CN104140478A43申请公布日20141112CN104140478A21申请号201310165701622申请日20130508C08B37/1020060171申请人清华大学地址100084北京市海淀区清华大学72发明人邢新会吴敬君张翀74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人闫桑田54发明名称精品肝素和制备精品肝素的方法57摘要本文涉及一种精品肝素和制备精品肝素的方法。其中制备精品肝素的方法包括将粗品肝素溶解到水中，制备肝素溶液，向肝素溶液中加入硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B，与半乳糖胺杂质进行酶反应；除去肝素溶液中的硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨。

2、素酶B。51INTCL权利要求书1页说明书14页序列表9页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书14页序列表9页10申请公布号CN104140478ACN104140478A1/1页21一种精制的精品肝素，其中，所述精品肝素所含的半乳糖胺的杂质为5质量以下、优选为3质量以下、进一步优选为1质量以下，再进一步优选为08质量、05质量、03质量、优选为01质量以下。2根据权利要求1所述的精品肝素，其中，所述精品肝素的羊血浆效价为150IU/MG以上、优选为160IU/MG以上、进一步优选为170IU/MG以上。3根据权利要求1或2所述的精品肝素，其中，所述精品肝素配制。

3、为4MG/ML的肝素溶液时，在260NM处的吸光度为01以下，在280NM处的吸光度为01以下。4一种制备精品肝素的方法，其包括向含粗品肝素的肝素溶液中加入下列酶中的至少一种与半乳糖胺杂质进行酶反应，上述酶为硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B。5根据权利要求4所述的方法，其中，所述硫酸软骨素酶AC是与MBP融合的硫酸软骨素酶AC，即MBPCHONACSEQIDNO1，所述硫酸软骨素酶B是与MBP融合的硫酸软骨素酶B，即MBPCHONBSEQIDNO2。6根据权利要求4所述的方法，其中向肝素溶液中添加胰酶停止酶反应。7根据权利要求4所述的方法，其中，还包括下列的提纯步骤除杂质步骤；乙醇沉淀步骤；氧。

4、化步骤；冷冻干燥。8根据权利要求7所述的方法，其中，所述除杂质步骤和乙醇沉淀步骤重复进行两次或三次以上。9根据权利要求7所述的方法，其中，在最后一次乙醇沉淀之前进行氧化并脱色。10根据权利要求7所述的方法，其中，除杂质步骤包括向肝素溶液中添加氯化钙以除去杂质，并进一步添加无水碳酸钠以除去钙离子。11根据权利要求9所述的方法，其中，利用H2O2对肝素溶液进行氧化并脱色。12根据权利要求411中任一项所述的方法，其中，所述硫酸软骨素酶B和粗品肝素的比例为500IU50000IU硫酸软骨素酶B/KG粗品肝素，优选的比例为1000IU20000IU硫酸软骨素酶B/KG粗品肝素，进一步优选3000IU1。

5、2000IU硫酸软骨素酶B/KG粗品肝素，最优选为5000IU10000IU硫酸软骨素酶B/KG粗品肝素；所述硫酸软骨素酶AC和粗品肝素的比例为300IU30000IU硫酸软骨素酶AC/KG粗品肝素，优选的比例为1000IU15000IU硫酸软骨素酶AC/KG粗品肝素，进一步优选2000IU10000IU硫酸软骨素酶AC/KG粗品肝素，最优选为3000IU6000IU硫酸软骨素酶AC/KG粗品肝素。13根据权利要求412中任一项所述的方法，其中，获得所述粗品肝素的肝素原料为来自动物组织的基本上含有肝素的原料，优选来源于猪、牛、羊组织的肝素，更优选来源于猪小肠粘膜的肝素。权利要求书CN10414。

6、0478A1/14页3精品肝素和制备精品肝素的方法技术领域0001本文涉及精品肝素和制备所述精品肝素的方法。背景技术0002肝素是由己糖醛酸L艾杜糖醛酸、D葡萄糖醛酸和D硫酸氨基葡萄糖以14糖苷键交替形成的粘多糖，具有六糖或八糖的重复单位的线性链状结构，其分子量为300037000DA之间，在医药方面作为抗凝试剂和抗栓试剂使用。此外，肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等多种生物学功能MAURICEPETITOU,BENITOCASU,ULFLINDAH19761983,ACRITICALPERIODINTHEHISTORYOFHEPARINTHEDISCOVERYOFTHEANTIT。

7、HROMBINBINDINGSITEBIOCHIMIE8520038389。0003粗品肝素经过纯化之后可以药用，纯化过程包括一系列的一般分离步骤以及使外来物质失活的步骤。其中分离步骤利用了肝素的物化性质，比如高阴离子密度，水溶性以及对于热、酸、碱和氧化剂的相对高活性MARCOGUERRINI,ZHENQINGZHANG,ZACHARYSHRIVER,ETCORTHOGONALANALYTICALAPPROACHESTODETECTPOTENTIALCONTAMINANTSINHEPARINPNAS，2009，106401695616961。0004在历史上药品级别的肝素是基于血浆凝固试验来定。

8、义的，而不是其分子性质。目前这种状态已经改变，这是因为肝素污染危机和更加精妙的多糖分析手段的出现。世界上的多家标准品机构，包括美国药典和欧洲药典，已经开始用基于规定的生化方法，比如核磁共振NMR、毛细管电泳CE、高效液相色谱HPLC来测定肝素的结构和电荷性质。2007年末到2008年初的硫酸软骨素污染肝素钠事件，导致了很多国家的肝素在血液透析的过程中出现过敏反应，比如急性低血压，并导致超过140位病人死亡KISHIMOTOTK，等人2008CONTAMINATEDHEPARINASSOCIATEDWITHADVERSECLINICALEVENTSANDACTIVATIONOFTHECONTAC。

9、TSYSTEMNENGLJMED35824572467；GUERRINIM，等人2008OVERSULFATEDCHONDROITINSULFATEISACONTAMINANTINHEPARINASSOCIATEDWITHADVERSECLINICALEVENTSNATBIOTECHNOL26669675；BLOSSOMDB，等人2008OUTBREAKOFADVERSEREACTIONSASSOCIATEDWITHCONTAMINATEDHEPARINNENGLJMED35926742684。0005肝素中另一种杂质为过硫酸软骨素。过硫酸软骨素OSCS每个双糖单位含有4个硫，如下式1所示，到。

10、目前为止，双糖含有4个硫元素在自然界中还没有发现，结构也不同于其他的粘多糖GAG不纯物质。OSCS的出现也开始使各国重视肝素的其他污染物，如硫酸皮肤素DS、透明质酸HA和所谓的边角料，这些也可以被过硫酸化而出现在肝素中。所以肝素粗品的精制工艺显得越来越重要。0006说明书CN104140478A2/14页40007式1过硫酸软骨素0008由粗品肝素制备精品肝素的过程主要是除去粗品肝素中的杂质的过程。粗品肝素中的杂质主要有蛋白质、核酸类物质和杂多糖。通常，在去除杂质过程中只使用一种除杂方法很难达到很好的效果，实际操作过程中，会将多种除杂的方法结合起来使用，这样会导致步骤复杂、肝素收率低。0009。

11、粗品肝素中的主要多糖成分是肝素，除此之外其还有其他相关的多糖GAGS，例如包括硫酸皮肤素DS、硫酸软骨素CS，包括硫酸软骨素ACSA和硫酸软骨素CCSC和软骨素，这些物质由于与肝素本身的物理性质和化学性质非常相似，因此难以将其从粗品肝素中除去。上述这些相关的多糖杂多糖一般称为半乳糖胺杂质。对于半乳糖胺杂质的去除也是肝素纯化的关键问题之一，在现有的纯化操作过程中，往往通过调节不同的乙醇浓度，通过多步进行的分级沉淀方法去除半乳糖胺杂质，其中相关的多糖主要以硫酸皮肤素形式存在，对其的去除尤其困难。0010如上所述，已有的肝素纯化方法去除肝素中半乳糖胺杂质主要是软骨素、CSA、CSC、DS主要是用乙醇。

12、进行多级沉淀，由于肝素和其他半乳糖胺杂质的结构、分子量、醇溶性很接近，所以单纯靠乙醇沉淀难以进行分离，需要多级分离才能达到比较理想的分离效果，所以造成肝素的收率下降，而且乙醇的用量大，经济成本和时间成本较高。发明内容0011鉴于上述问题，本申请的发明人进行了深入地研究，提出了如下的方案解决了上述问题。0012本文的一个方面提供一种精品肝素。具体来说00131一种精制的精品肝素，其中，所述精品肝素所含的半乳糖胺杂质为5质量以下、可以为3质量以下、进一步可以为1质量以下、再进一步优选为08质量、05质量、03质量、优选为01质量以下。00142根据1所述的精品肝，其中，所述精品肝素的羊血浆效价为1。

13、50IU/MG以上、可以为160IU/MG以上、可以为170IU/MG以上。00153根据1或2所述的精品肝素，其中，精品肝素配制为4MG/ML的肝素溶液时，在260NM处的吸光度为01以下，在280NM处的吸光度为01以下。0016本文的另一个方面涉及一种制备精品肝素的方法纯化肝素的方法，具体来说00174一种制备精品肝素的方法，其包括0018向含粗品肝素的肝素溶液中加入下列酶中的至少一种与半乳糖胺杂质进行酶反应，上述酶为硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B。00195根据4所述的方法，其中，所述硫酸软骨素酶AC是与MBP融合的硫酸软骨素酶AC，即MBPCHONACSEQIDNO1，所述硫酸软骨。

14、素酶B是与MBP融合的硫酸软骨素酶说明书CN104140478A3/14页5B，即MBPCHONBSEQIDNO2。00206根据4所述的方法，其中，向肝素溶液中添加胰酶停止酶反应。00217根据4所述的方法，其中，还包括下列的提纯步骤0022除杂质步骤；0023乙醇沉淀步骤；0024氧化步骤0025冷冻干燥。00268根据7所述的方法，其中，所述除杂质步骤和乙醇沉淀步骤重复进行两次或三次以上。00279根据根据7所述的方法，其中，在最后一次乙醇沉淀之前进行氧化并脱色。002810根据7所述的方法，其中，除杂质步骤包括向肝素溶液中添加氯化钙以除去杂质，并进一步添加无水碳酸钠以除去钙离子。002。

15、911根据9所述的方法，其中，利用H2O2对肝素溶液进行氧化并脱色。003012根据411中任一项所述的方法，其中，0031所述硫酸软骨素酶B和粗品肝素的比例为500IU50000IU硫酸软骨素酶B/KG粗品肝素，优选的比例为1000IU20000IU硫酸软骨素酶B/KG粗品肝素，进一步优选3000IU12000IU硫酸软骨素酶B/KG粗品肝素，最优选为5000IU10000IU硫酸软骨素酶B/KG粗品肝素；0032所述硫酸软骨素酶AC和粗品肝素的比例为300IU30000IU硫酸软骨素酶AC/KG粗品肝素，优选的比例为1000IU15000IU硫酸软骨素酶AC/KG粗品肝素，进一步优选200。

16、0IU10000IU硫酸软骨素酶AC/KG粗品肝素，最优选为3000IU6000IU硫酸软骨素酶AC/KG粗品肝素。003313根据412中任一项所述的方法，其中，获得所述粗品肝素的肝素原料为来自动物组织的基本上含有肝素的原料，优选来源于猪、牛、羊组织的肝素，更优选来源于猪小肠粘膜的肝素。具体实施方式0034以下，对本文的实施方式进行具体说明。0035如无特殊说明，本说明书中的术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。本文中，所涉及的数值一般指重量或重量百分比，除非特殊说明。00360037本文的一个方面提供一种精制的精品肝素。精品肝素通常以肝素钠的干。

17、燥粉末的形式存在。0038该精品肝素的羊血浆效价为150IU/MG以上，可以为160IU/MG以上，还可以为170IU/MG以上，并且所述精品肝素所含的半乳糖胺杂质为5质量以下，可以为3质量以下，进一步可以为1质量以下，再进一步优选为08质量，05质量，03质量，01质量以下。在本文中，对于半乳糖胺杂质的下限没有具体限定，可以是所采用的检测方法的极限值，例如可以是001质量或以上。说明书CN104140478A4/14页60039上文中的羊血浆效价也称为APTTACTIVEATEDPARTIALTHROMBOPLASTINTIME效价，是利用活化部分凝血酶时间法测定的效价。在此，效价越高表明抗。

18、凝血活性越强。所述活化部分凝血酶时间法可以参照欧洲药典70版的第208209页，关于肝素的275章EUROPEANPHARMACOPOEIA70P208209,275ASSAYOFHEPARIN。具体的测定方法参见本文实施例部分的描述。APTT效价的单位为IU/MG，其中将标准品肝素钠BRP购买自EUROPEANDIRECTORATEFORQUALITYMEDICINES，EDQM，欧洲药品质量管理局的APTT效价H0200000定义为1010IU/ML。0040其中本文所述的半乳糖胺杂质是指包括硫酸皮肤素DS、硫酸软骨素CS和软骨素等含有半乳糖胺单糖的杂质的总和。可以根据本文实施例部分所述的。

19、半乳糖胺杂质检测方法来检测本文得到的精品肝素所含的半乳糖胺杂质的浓度。半乳糖胺杂质的含量是描述肝素精品纯度的指标，含量越少表示肝素纯度越高，其所含有的杂多糖的含量越少，这种肝素作为药物使用时更容易预测量效关系、是更加安全的这是因为半乳糖胺杂质有可能被硫酸化后变为OSCS从而引起过敏反应。0041欧洲药典,关于肝素的275章EUROPEANPHARMACOPOEIA70P208209,275ASSAYOFHEPARIN中规定的APTT效价是相对于标准品对照进行测定、并用生物统计方法平行线原理33计算而得出。0042半乳糖胺杂质含量的测定值是半乳糖胺占总糖胺的含量，即半乳糖胺占肝素样品中总糖胺即半。

20、乳糖胺葡萄糖胺的比值，也就是糖胺的相对含量。半乳糖胺杂质含量通过半乳糖胺/半乳糖胺葡萄糖胺来计算。0043另外，本文涉及的精品肝素在260NM处的吸光度为01以下，在280NM处的吸光度为01以下，在本文中所测定的吸光度是测定浓度为4MG/ML的精品肝素溶液的吸光度而得到的数值。0044在本领域中，通常利用260NM处的吸光度表征核酸类物质的浓度，利用280NM处的吸光度表征蛋白质类物质的浓度。在本文中，可以利用本领域已知的方法测定精品肝素在260NM处的吸光度，以及在280NM处的吸光度。具体的测定方法可以参见实施例部分描述的方法。根据中国药典2010CP2010的规定要求A26001，A2。

21、8001。本文涉及的精品肝素满足药典要求，即浓度为4MG/ML的肝素溶液，满足A26001，A28001参见中国药典2010第二部366367页。00450046本文的另一个方面涉及一种制备精品肝素的方法纯化肝素的方法，其包括0047向含粗品肝素的肝素溶液中加入下列中的至少一种硫酸软骨素酶硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B，与半乳糖胺杂质进行酶反应。0048粗品肝素0049本文的粗品肝素是指含有肝素的原料，因此只要是主要含肝素的原料即可，通常粗品肝素的APTT效价为80100IU/MG左右，粗品肝素通常是从动物组织主要是猪小肠粘膜中提取的未经过纯化和脱色的肝素从小肠粘膜等组织中提取的步骤见文献可。

22、以参考HAIYINGLIU，ETALLESSONSLEARNEDFROMTHECONTAMINATIONOFHEPARINNATPRODREP,2009,26,313321。在本文中的粗品肝素是指未经本文所述的方法进行纯化的肝素，其中粗品肝素含有作为多糖成分的肝素，以及其它的半乳糖胺杂质，例如硫酸皮肤说明书CN104140478A5/14页7素DS、硫酸软骨素CS，包括硫酸软骨素ACSA和硫酸软骨素CCSC和软骨素。当然粗品肝素也可以是经过了通常的纯化和脱色步骤除去了其它多种杂质和颜色但尚未除去上述半乳糖胺杂质的肝素产品，在本文中涉及的半乳糖胺杂质主要包括硫酸皮肤素DS、硫酸软骨素CS，包括硫。

23、酸软骨素ACSA和硫酸软骨素CCSC和软骨素。本文中的肝素粗品通常是指半乳糖胺杂质含量为10质量以上，为15质量以上，为20质量以上，以及进一步为30质量以上，40质量以上的各种肝素。0050粗品肝素可以是市场上购买的肝素的粗产品，例如可以为购买自四川广元申达实业有限公司和山东郓城绅联生物技术有限公司等。本文的粗品肝素可以是来自动物的肝素原料，动物的肝素可以是来源于猪、牛、羊组织的肝素，更优选来源于猪小肠粘膜的肝素。在本文的方法中，通常将粗品肝素溶解在溶剂例如水中以进行与下述硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B的反应。0051硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B0052在该方法中，硫酸软骨素酶AC。

24、和硫酸软骨素酶B可以是通过任何方法获得的硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B。该硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B可以是购买的酶产品，也可以利用能够生产硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B的细菌菌体、该细菌菌体的细胞提取物、也可以是细胞提取物经提纯得到的含酶溶液、以及经纯化得到的酶。上述能够生产硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B的细菌例如有肝素黄杆菌PEDOBACTERHEPARINUS或FLAVOBACTERIUMHEPARINUM、金黄节杆菌ARTHROBACTERAURESCENS和嗜水气单孢菌AEROMONASLIQUEFACIENS。0053例如，硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B来自肝素黄杆菌。。

25、0054硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B可以是购买的酶产品，例如购买自SIGMA、IBEX等公司的硫酸软骨素酶AC，以及购买自SIGMA、IBEX等公司的硫酸软骨素酶B。0055其中，来自肝素黄杆菌的硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B可以通过直接使用肝素黄杆菌菌体、菌体的细胞提取物、或细胞提取物经初步纯化后得到的含酶溶液。也可以利用该硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B分别在大肠杆菌中重组表达后得到的经基因工程操作的酶。0056在本文中，硫酸软骨素酶AC可以是与MBP融合的硫酸软骨素酶，即MBPCHONAC。该MBPCHONAC的氨基酸残基序列如SEQIDNO1所示，其DNA序列如SEQIDNO3所。

26、示，关于MBPCHONAC的详细描述可以参考申请号为201110358185X的中国专利申请。0057在本文中，硫酸软骨素酶B可以是与MBP融合的硫酸软骨素酶，即MBPCHONB。该MBPCHONB的氨基酸残基序列如SEQIDNO2所示，其DNA序列如SEQIDNO4所示，关于MBPCHONB的详细描述可以参考申请号为2011103581347的中国专利申请。0058MBPCHONAC和MBPCHONB可以是以具有该酶基因的细菌的粗培养液、该粗培养液的细胞提取物、或者是根据简单的纯化方法得到的酶粗产品、或者进一步纯化得到的酶产品形式被利用。0059在上述方法中，使硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨。

27、素酶B与粗品肝素反应，反应过程中硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B降解肝素原料中的硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、软骨素以及硫酸皮肤素。本文对于具体的反应条件没有特别地限定，只要是硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B能够发挥活性，有效地降解硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、软说明书CN104140478A6/14页8骨素、以及硫酸皮肤素的反应条件即可，本领域技术人员可以根据所使用的酶和原料进行适当地选择。反应可以在2040的条件下，可以在2535的条件下进行，以及在PH为785，可以在775的条件下进行。在一个具体的实施方式中，反应温度为30，PH为75，并利用氯化钠和氯化钙，调节PH。0060对于上。

28、述反应进行的时间也没有具体限定，只要是能够将粗品肝素中的硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、软骨素、以及硫酸皮肤素充分降解皆可。所述充分降解是指在反应进行的过程中通过紫外可见光分光光度计检测反应体系在232235NM处的吸光度，当吸光度不再变化时，认为其中硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、软骨素以及硫酸皮肤素已经被充分降解。因此仅需要根据不同的酶量、不同的操作条件，选择适当的反应时间即可，本领域技术人员可以适当地调节。在一个具体的实施方式中，反应进行的时间为055小时。0061在上述方法中，在添加硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B进行酶解反应。此外，在反应过程中，可以先添加一定量的硫酸软骨素酶AC和/或硫。

29、酸软骨素酶B进行反应，反应一段时间后在补充一定量的硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B再进行一段时间的反应。0062另外，硫酸软骨素酶B和粗品肝素的比例为500IU50000IU硫酸软骨素酶B/KG粗品肝素，比例可以为1000IU20000IU硫酸软骨素酶B/KG粗品肝素，进一步可以为3000IU12000IU硫酸软骨素酶B/KG粗品肝素，可以为5000IU10000IU硫酸软骨素酶B/KG粗品肝素。0063硫酸软骨素酶AC和粗品肝素的比例为300IU30000IU硫酸软骨素酶AC/KG粗品肝素，比例可以为1000IU15000IU硫酸软骨素酶AC/KG粗品肝素，进一步可以为2000IU100。

30、00IU硫酸软骨素酶AC/KG粗品肝素，可以为3000IU6000IU硫酸软骨素酶AC/KG粗品肝素。0064其中硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B的1IU定义为在30，PH值为75的条件下能产生1MOL4,5不饱和糖醛酸的酶量。0065在本文的方法中，通常是将粗品肝素溶解在水中，使粗品肝素溶液的浓度为1G/L500G/L，也可以为50G/L200G/L。0066在本文所述的方法中，由于肝素的分子量在1200015000道尔顿左右，而经硫酸软骨素酶AC和/或B反应而降解后的半乳糖胺杂质是基本上以二糖形式存在的低分子经降解的半乳糖胺杂质，其分子量一般在2000道尔顿以下，例如1000道尔顿以下，例。

31、如约为400500道尔顿，由于肝素的分子量明显不同于降解后的半乳糖胺杂质，因此可以容易地在后续步骤中利用分子量的差异从混合物中分离出目标产品肝素。0067在本文的方法中，向肝素溶液中添加胰酶停止酶反应。对于添加胰酶停止酶反应的条件可以根据本领域已知的条件来进行设定。在一个具体的实施方式中，调节结束了酶反应后的肝素溶液的PH为89，控制温度为48，加入06W/W的胰酶，并基本上保持PH为89，胰酶酶解一共进行55小时。0068在利用胰酶终止酶反应之后，进一步除去所添加的硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B，此时，该步骤除了除去了所述的硫酸软骨素酶之外，还可以除去粗品肝素中其它的蛋白质。0069在。

32、本文中在还可以包括除杂质步骤、乙醇沉淀步骤、氧化步骤，以及冷冻干燥步说明书CN104140478A7/14页9骤。除杂质步骤和乙醇沉淀步骤重复进行两次或三次以上，可以为重复进行两次。其中这些提纯步骤中的一些也可以在本文所述方法之前进行，可以先除去一些杂质后再利用本文中的方法来除去粗品肝素中的半乳糖胺杂质。0070去除杂质的方法有调PH值、盐沉淀、醇沉淀、酶解和离心等方法。脱色方法主要是氧化脱色，使用的氧化剂有高猛酸钾、过氧化氢。在氧化脱色的过程中，部分杂质也会被去除掉。0071目前已有大量的文献报道了这些除杂质和氧化脱色等步骤。调PH值的方法例如，通常可以将肝素钠溶液PH值调节至15左右，可以。

33、沉淀出大部分酸性蛋白质。考虑到肝素钠在温热和酸性条件下容易失活，使用亚硫酸氢钠作为保护剂以防止肝素钠失活。上述这些去除杂质和氧化脱色的方法可以结合和选择使用。0072李红心等人发现使用高速低温离心去除沉淀的蛋白质，与硅藻土作助滤剂的过滤除杂蛋白的方法进行比较，得到的精品肝素钠的效价损失降低到最低程度参见李红心，精品肝素钠的制备及效价分析J陕西科技大学学报，2005，2353234。0073此外，罗喜牛使用三氯化铝作为除杂剂，结合调PH值的方法，与常规法比较，操作明显简化，除杂效果佳罗喜牛，肝素钠的三氯化铝精制工艺J中国医药工业杂志，1998，2910441442。0074考虑利用酶的作用专一特。

34、点，并结合调节PH值和氧化除蛋白质的方法，李红心建立了胰蛋白酶酶解除蛋白质的方法，实验结果表明，采用该方法去除粗品肝素钠中的杂蛋白，对肝素钠效价和效价回收率的影响均较小。罗喜牛等人采用D254树脂吸附法除去调节酸性、碱性不易除尽的核酸、蛋白质杂质罗喜牛，沈静，徐烈贤等，D254树脂在肝素钠精制过程中的应用J中国医药工业杂志，1998，295200202。张万忠等人将酶解法和氧化法除杂结合起来，在粗品肝素钠中加入胰蛋白酶对杂蛋白进行酶解，再结合过氧化氢氧化除杂，以提高精品肝素钠的效价和效价回收率张万忠，张辉，李文秀等，肝素钠精制工艺研究J沈阳化工学院学报，2002，163191194。0075在。

35、本文的一个实施方式中除杂质步骤包括向肝素溶液中添加氯化钙以除去杂质，并进一步添加无水碳酸钠以除去钙离子。在一个具体的实施方式中，胰酶酶解结束后，加入CACL2常温反应30分钟，升温至8085，然后用NAOH调PH为93，10000G离心10分钟。将冷却得到溶液至40以下，调节PH为103，10000G离心10分钟。向离心后的溶液中加入30W/V无水碳酸钠，48反应30分钟，10000G离心10分钟。0076在进行一次除杂质步骤后，对得到的溶液进行一次乙醇沉淀。乙醇沉淀的方法是本领域技术人员已知的乙醇沉淀方法。通常可以采用3070的乙醇溶液进行分级分离，静置一段时间后，收集沉淀。0077此外，在。

36、最后一次乙醇沉淀之前进行氧化脱色，其中利用H2O2对肝素溶液进行氧化并脱色。在进行脱色的过程中，可以不断地补充H2O2进行氧化脱色。氧化过程可以进行一次或两次或多次。0078在本文中列举了通过乙醇沉淀分离方法进一步纯化肝素产品，此外也可以利用膜分离、重力梯度离心等各种本领域技术人员常用的方法来进行进一步的分离纯化。0079脱色之后得到精品肝素的溶液，此时，可以通过对该肝素溶液进行冷冻干燥以获得精品肝素粉末。冷冻干燥的方法可以参考本领域中通常采用的方法，在本文的一个具体说明书CN104140478A8/14页10的实施方式中用045UM微孔滤膜进行过滤，用冰醋酸调节溶液PH60，用022UM微孔。

37、滤膜进行过滤，过滤后进行冻干24小时，得到精品肝素粉末。0080在本文中为了获得精品肝素，除杂质步骤和乙醇沉淀步骤重复进行两次或三次以上。0081通过上述本文的制备精品肝素的方法得到质量收率可以通过精品肝素质量/粗品肝素质量100来计算。0082通过上述本文的制备精品肝素的方法得到效价收率可以通过质量收率精品肝素APTT/粗品肝素APTT100来计算。0083利用本文的制备精品肝素的方法的效价收率通常在70以上。0084利用本文的制备精品肝素的方法的质量收率通常在35以上。0085通过上述本文所述的方法可以获得本文的精品肝素，即羊血浆效价为150IU/MG以上，优选为160IU/MG以上，进一。

38、步优选为170IU/MG以上的精品肝素，并且所述精品肝素所含的半乳糖胺的杂质为5质量以下，优选为3质量以下，进一步优选为1质量以下，再进一步优选为08质量，05质量，03质量，01质量以下。0086此外，还可以是该精品肝素在260NM处的吸光度为01以下，在280NM处的吸光度为01以下。0087实施例0088下面结合具体实施例对本文作进一步说明，但本文并不限于以下实施例。此外，在实施例中使用的是MBPCHONAC和MBPCHONB作为硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B的代表，本领域技术人员应当理解，任何形式的硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B均可以用于实现本发明的目的。除非另有说明，实施例中涉及。

39、的百分比为质量百分比，份数为质量份数。0089半乳糖胺杂质检测方法00901溶液制备00911流动相14MM的氢氧化钾溶液量取1MOL/L的氢氧化钾溶液14ML，于1000ML的容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得14MM的氢氧化钾溶液。00922氨基葡糖对照溶液称取USP盐酸氨基葡萄糖对照品USPGLUCOSAMINEHYDROCHLORIDERS16MG于10ML容量瓶中，加5N盐酸溶液溶解并定容至刻度，摇匀即得16MG/ML的USP盐酸氨基葡萄糖溶液。00933半乳糖胺对照溶液称取USP盐酸氨基半乳糖对照品USPGALACTOSA分钟EHYDROCHLORIDERS16MG于100ML容。

40、量瓶中，加5N盐酸溶液溶解并定容至刻度，摇匀即得16G/ML的USP半乳糖胺溶液。00944对照溶液氨基葡糖对照溶液和半乳糖胺对照溶液等体积混合。00955水解标准溶液转移10ML标准溶液于20ML带有螺帽的玻璃管中，密闭，100加热6小时。冷却至室温，转移溶液于1000ML容量瓶中，用水稀释至刻度。00966样品溶液称取24MG待测肝素样品于20ML玻璃管中，加5N的盐酸10ML溶解，密闭。00977水解样品溶液100加热样品溶液6小时，冷却至室温，转移溶液于1000ML容量瓶，用水稀释至刻度。说明书CN104140478A109/14页1100982液相系统0099模式HPIC0100检测。

41、器脉冲电流检测器，按照下表设计0101步骤时间S电压V过程100001202001开始304001结束4041205042206043067044018050010102柱子3MM30MM保护柱及3MM15CM柱，L69填料；0103柱温维持柱温为30；0104流速05ML/分钟；0105预平衡至少用流动相冲洗60分钟；0106进样体积10L；0107洗脱流动相冲洗10分钟；0108柱子清洗用100MM氢氧化钾至少冲洗10分钟；0109平衡每次进样前至少用流动相冲洗10分钟；01103系统适应性01111样品水解对照溶液01122系统适应性要求0113分离度半乳糖胺峰与氨基葡萄糖峰的分离度要不。

42、小于2；0114柱效对氨基葡萄糖来说，理论塔板数不小于2000；0115拖尾因子对半乳糖胺峰与氨基葡萄糖峰来说，介于0820之间。01164检测01171样品水解对照溶液及水解样品溶液01182记录液相图谱，并且测量半乳糖胺峰与氨基葡萄糖峰保留时间时的峰响应值，计算在水解对照溶液中，半乳糖胺峰对氨基葡萄糖峰响应比值GALNR0119说明书CN104140478A1110/14页120120其中GALNB水解对照溶液中半乳糖胺峰面积；0121GALNW对照溶液中半乳糖胺对照品的称样量MG；0122GLCNB水解对照溶液氨基葡萄糖峰面积；0123GLCNW对照溶液中氨基葡萄糖对照品的称样量MG。0。

43、1245计算氨基己醣中半乳糖胺含量W0125氨基己醣中半乳糖胺含量0126其中GALNU水解样品溶液中半乳糖胺峰面积；0127GALNR半乳糖胺峰对氨基葡萄糖峰响应比值；0128GLCNU水解样品溶液中氨基葡萄糖峰面积。01296可接受的标准0130水解样品溶液中半乳糖胺峰面积占总氨基己糖峰面积的百分比10131吸光度的测定方法0132秤取100MG待测肝素样品于25ML容量瓶中，加去离子水至刻度，充分溶解。用1CM光程石英比色皿在紫外可见分光光度计GOLDSPECTRAMLAB54,上海棱光技术上测定吸光度以去离子水调零。分别测定260NM用于表征核酸的浓度和280NM用于表征蛋白质的浓度吸。

44、光度。0133活化部分凝血酶时间法羊血浆效价的检测方法01341溶液配制0135空白09的氯化钠溶液，分别为B1B2；0136标准用09的氯化钠溶液溶解肝素钠BRP是标准品，购买自EUROPEANDIRECTORATEFORQUALITYMEDICINES，EDQM，欧洲药品质量管理局H0200000至三个浓度梯度S1S3分别为12、144、1728IU/ML；0137样品首先估计待测样品的效价，然后按照估计效价用09的氯化钠溶液溶解至三个浓度梯度T1T3分别为12、144、1728IU/ML。01382测定步骤0139标记14个EP管按顺序B1、S1、S2、S3、T1、T2、T3、T1、T2。

45、、T3、S1、S2、S3、B2放在冰浴上，加入融化的绵羊血浆山东苍山向明生化助剂厂10ML和10ML标准品或者样品或者空白，注意不要产生气泡；0140转移14个EP管至37水浴保持90秒之后加入16ML合适浓度的含有磷脂和激活剂鞣花酸的APTT试剂希森美康医用电子上海有限公司，使空白的再钙化时间不超过60秒；0141加入APTT试剂之后在37水浴保温240秒之后加入在37水浴预热的37G/L的氯化钙溶液2ML，立即记录血凝时间600NM波长下吸光度变化为值为最大值的一半时的时间。0142用生物检定统计法中的量反应平行线原理33法，计算效价和实验误差，平均可信限率FL应不得大于15。0143实施。

46、例10144将40G购自四川广元申达实业有限公司的粗品肝素钠溶解于400ML去离子水说明书CN104140478A1211/14页13中，加入03W/V的氯化钠、022W/V的氯化钙，调节PH75，加入硫酸软骨素酶BMBPCHONB200IU在30反应05小时后再加入200IU在30反应15小时。反应结束后加入27W/VNACL，调节PH为89，控制温度48，加入06W/W的胰酶，每小时调节PH为89，酶解55小时。胰酶酶解结束后，加入278W/V的CACL2常温反应30分钟，升温8085，用20的NAOH调PH为93，10000G离心10分钟。将料液放凉到40以下，调PH103，10000G。

47、离心10分钟。离心后的料液加入30W/V无水碳酸钠，48反应30分钟，10000G离心10分钟。离心后的料液，用6MOL/L的HCL，调PH62，控制乙醇度数42进行分级分离，静置20分钟，收集沉淀。将沉淀加纯化水267ML溶解，加入15W/VNACL，用20的NAOH调PH为95，加入27W/V的CACL2，升温8085，反应30分钟，将料液放凉到40以下。料液中加入27W/V无水碳酸钠，常温反应30分钟，10000G离心10分钟。将离心后的料液，用20的NAOH调PH102，控制温度28，加入体积25V/V浓度为30的H2O2，加入时间分别为0小时、2小时、4小时、12小时、14小时，氧化。

48、24小时。氧化过程进行三次之后，将氧化后的料液用6MOL/L的HCL，调PH62，控制乙醇度数42进行分级，静置20分钟。用045M微孔滤膜进行过滤，用冰醋酸调节溶液PH60，用022M微孔滤膜进行过滤，过滤后进行冻干24小时，得到161G精品肝素。0145根据上述的方法对实施例1得到的精品肝素进行检测，检测结果如下0146精品肝素检测结果01471精品肝素吸光度检测A2600098，A2800075，满足药典规定的A26001，A28001。01482羊血浆效价检测粗品肝素APTT效价为96043IU/MG，精品肝素APTT效价为17525IU/MG。01493质量收率精品肝素质量/粗品肝素。

49、质量100161/401004025。01504效价收率质量收率精品肝素APTT/粗品肝素APTT100402517525/960437344。01515半乳糖胺杂质检测用CARBOPACPA20分析柱检测半乳糖胺杂质，粗品肝素为219，精品肝素为02740022，精品满足药典规定的1标准。0152实施例20153将40G购自四川广元申达实业有限公司的粗品肝素钠溶解于400ML去离子水中，加入03W/V的氯化钠、022W/V的氯化钙，调节PH75，加入硫酸软骨素酶ACMBPCHONAC120IU在30反应05小时后再加入120IU在30反应15小时。反应结束后加入27W/VNACL，调节PH为89，控制温度48，加入06W/W的胰酶，每小时调节PH为89，酶解55小时。胰酶酶解结束后，加入278W/V的CACL2常温反应30分钟，升温8085，用20的NAOH调PH为93，10000G离心10分钟。将料液放凉到40以下，调PH103，10000G离心10分钟。离心后的料液加入30W/V无水碳酸钠，48反应30分钟，10000G离心10分钟。离心后的料液，用6MOL/L的HCL，调PH62，控制乙醇度数42进行分级分离，静置20分钟。