自积雪草的积雪草苷和羟基积雪草苷的 水溶性提取物及其分离方法 本发明涉及具有抗纤维化作用，能保护肝细胞的来自Centella asiatica的积雪草苷(asiaticoside)和羟基积雪草苷(madecassoside)的水溶性提取物和涉及其分离方法。
自生在非洲马达加斯加岛和印度的伞形科植物Centellaasiatica(L.)Urb，长期以来一直用于治疗局部创伤(Poizot.A，Dumez.D，CR.Acad.Sci[D]286，1978)。许多研究者报道Centella asiatica的定量(titrated)提取物(下文中称作“TECA”)对于组织的局部创伤有效。实际上，TECA为世所公认的药物并可买到，其商品名为“Madecassol”(积雪草苷∶积雪草酸∶羟基积雪草酸＝4∶3∶3)。其治疗效果为通过改善纤维化过程，保护组织细胞，以使损伤的组织恢复到接近原来的状态。但是，这些成分只限于治疗外伤，而且在韩国专利公开号第87-1458号、第87-1573号和第91-2518号中公开其提取需要复杂的过程，因而，其收率和纯度很差。此外，主要目的成分为配基(积雪草酸、羟基积雪草酸和崩大碗酸)和积雪草苷，它们都是不溶于水的，因而，限制了其用途。
尽管先存的TECA显示优越地抗纤维化作用，其不溶于水的物理性质迫使其自身以粉末形式使用，将其使用范围限制在治疗外伤。
由本发明者重复的，目的在于扩大TECA的药用用途的深入研究导致发现：用含水醇处理Centella asiatica，非常有助于提取溶于水并可有效地保护肝细胞和抗肝细胞纤维化的成分。
所以，本发明的目的为提供自Centella asiatica的积雪草苷和羟基积雪草苷的水溶性提取物，它显示优越的保护肝细胞和抗肝细胞纤维化作用。
本发明的另一个目的是提供所述水溶性提取物的分离方法。
根据本发明的目的，提供自Centella asiatica分离积雪草苷和羟基积雪草苷的水溶性提取物的方法，它包括如下过程：使包含Centella asiatica的含水醇冷冻沉淀；用卤化物溶剂处理含水醇中的提取物以便层离；用高级醇提取含水层；用氢氧化钠，然后用水洗醇层中的提取物并浓缩该提取物；用醋酸乙酯使该提取物结晶，得到结晶并洗结晶。
根据本发明的另一目的，提供自Centella asiatica的积雪草苷和羟基积雪草苷的水溶性提取物，它具有抗纤维化作用，能够保护肝细胞。
1.积雪草苷和羟基积雪草苷提取物的分离
使Centella asiatica浸入含水醇溶液中，得到提取物，然后，用卤化物溶剂处理该提取物。用醇(Cn≥4)提取其水层。然后，用碱水溶液数次洗涤醇层中的提取物，并真空浓缩或使其沉淀，得到固体。
该显示水溶性的固体主要包含由下式I代表的积雪草苷和羟基积雪草苷：(式I略)
用于本发明中的醇溶液包含含醇量为50-80％的甲醇或乙醇。用于本发明中的卤化物溶剂选自二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷和二氯乙烯。就所述含水层的提取而言，使用包含至少4个碳原子的醇例如选自正丁醇、仲丁醇和戊醇。作为碱溶液使用氢氧化钠或氢氧化钾水溶液。
通过上述过程得到的自Centella asiatica的提取物主要由4∶6-6∶4的积雪草苷和羟基积雪草苷组成，已发现所述两种成分占该提取物的97％或以上。它可以溶于水、醇和植物油。尤其，因为所述提取物在水中的溶解性是非常重要的物理性质，所以，在本发明中称其为水溶性TECA(在下文中称作“WS-TECA”)。
2.保护肝细胞试验
使用已知的代表性毒物四氯化碳和半乳糖胺在初期培养的wistars鼠的肝细胞中诱发毒性，检验WS-TECA的毒性阻断作用和恢复作用。
A)试验动物
使wistars鼠(雄性，150-200g)在温度为22±1℃和湿度为60±5％，昼夜每12小时更换的条件下，自由觅食和饮水。自试验前一天起使其禁食。
B)wistars鼠的肝细胞培养
通过2阶段胶原酶灌注技术(稍作改进的Berry-Friend方法)分离其肝细胞。使用乌拉坦(1g/lkg体重)使wistar鼠麻醉，用70％酒精清洁其腹部并切开。在其门静脉插入20导管径计，通过它以15ml/min的流速加入150ml的HBBS。这时，切开其下腔静脉放出血。在其开胸后，将18导管径计插入其下腔静脉，将其扎住，以便使在95mlHBBS中包含0.05％胶原素的消化汁再循环。使所述再循环进行10分钟，同时，提供CO2(5％)和O2(95％)的混合物。当分离肝细胞时，拣出其肝并置于烧杯中的60ml HBBS中。用一把剪刀剥开包围肝的薄膜，以使肝细胞游离。然后，使其经一张试镜纸过滤。所得到的滤液以50g离心2分钟。除去上清液，然后，通过在同样条件下离心培养基，得到肝细胞的悬液。使该悬浮液以5×105细胞/毫升的浓度转移到涂有胶原的培养皿中。所用的培养基为包含10％的胎儿腓肠血清、2.0mg/ml的牛血清白蛋白(组分V)、10-6M的地塞米松、10-7M的胰岛素、5.32×10-2M的L-丝氨酸、4.07×10-2M NaHCO3、100IU/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素和5μg/ml的二性霉素B的Waymouth’s MB 752/1培养基。使所述细胞在恒湿，同时提供空气(95％)和CO2(5％)的混合物的恒温箱中，于37℃培养。
C)试验方法
使肝细胞培养24小时后，用包含10mM四氯化碳的新鲜培养基替换原培养基，再培养的1.5小时使该四氯化碳诱发其毒性。通过用包含1.5mM的半乳糖胺的新鲜培养基替换已使所述肝细胞培养1.5小时的培养基，并培养其14小时，半乳糖胺也可以诱发肝细胞毒性。
通过Reitman-Frankel方法和稍加改进的Gerlach方法，测定所述培养基中的谷丙转胺酶(GPT)和山梨醇脱氢酶(SDH)。
每分钟1mg所述蛋白质产生的产物的量代表谷胱甘肽-S-转移酶的活性，其测定过程为：将后线粒体上清液混合在包含谷胱甘肽、1-氯-2，4-二硝基苯和磷酸钾缓冲液的试管中，并立即测定在340nm处垂直上升的吸收度达5分钟。
所述后线粒体上清液是通过下列过程得到的：培养肝细胞，除去培养基，加入3ml的66mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)得到细胞的悬浮液，使所述悬浮液匀化15秒钟，并以12500g离心该悬浮液15分钟。
使用改进的McCord-Frivich方法测定肝细胞中的超氧物歧化酶(SOD)。加入100μl的后线粒体上清液及200μl试剂A、500μl去离子水和200μl试剂B，并于37℃放置30分钟。在生成的上清液中再加入200μl试剂C后，于室温，放置20分钟，测定550nm处的吸收度，以便计算SOD单位。
就GSSG还原酶的活性而言，在包含600μl磷酸盐缓冲液、100μ10mM GSSG和100μl 1mM NADPH的试管中，加入200μl的后线粒体上清液，并在340nm处检测吸收度在2分钟内的变化。
就谷胱甘肽(GSH和GSSG)的总含量的测定而言，将700μl0.3mM NADPH和100μl 6mM DTNB加入200μl的后线粒体悬浮液中，然后，使其在水浴中，于30℃培育。通过加入10μl的GSH还原酶(50单位/毫升)引发反应后，在412nm处，每隔15秒钟测定吸收度，共测2分钟。
就谷胱甘肽(氧化形式，GSSG)的含量而言，剧烈搅拌每100μl的后线粒体悬浮液2μl的2-乙烯基吡啶的混合物并于25℃放置60分钟，以便产生GSH的衍生物，然后，测定其含量，以便计算剩余的GSSG。
为检测RNA的生物合成，将[3H]-尿苷加入浓度为1μCi/ml的培养基中并测定掺入培育细胞的RNA中的放射标记尿苷。为此，在除去所述培养基后，用HBSS洗所述细胞三遍并加入1ml的10％三氯乙酸，以便沉淀蛋白质。加入1ml的乙醇-乙醚(3∶1)的混合物，以便除去剩余的三氯乙酸并将该蛋白质溶于200μl的1N氢氧化钠中。取100μl该蛋白质溶液并加到3ml的aquasol(一种闪烁cocktail)中，以便测定放射性。
D)结果
以1μg/ml直到300μg/ml的量，将WS-TECA给与已经用四氯化碳诱发毒性的wistar鼠的起初培养的肝细胞中。显示从1μg/ml直到100μg/ml的剂量依赖关系，WS-TECA降低了释放入培养基中的GPT和SDH的活性，在100μg/ml显示对肝细胞最大的保护活性。此外，WS-TECA增加GSSG还原酶和SOD的活性，它们参与肝中许多酶的解毒作用，在阻止GST游离基的产生和除去产生的游离基中发挥作用。而且，WS-TECA增加了由于所述自由基降低的GSH的量。如上所述，WS-TECA在100μg/ml显示50-60％的最大活性(见表1)。
当用1μg/ml直到300μg/ml量的WS-TECA处理已经用半乳糖胺导致毒性的起初培育的wistar鼠肝细胞时，在300μg/ml，产生对GPT和SDH的活性的最大抑制。
就WS-TECA对由半乳糖胺损害的肝细胞中RNA合成的影响而论，加入300μg/ml量的WS-TECA与不加WS-TECA相比，在RNA的生物合成中，其肝细胞增加二倍，因而，使多至40％的损伤肝细胞恢复到正常状态。
表1
WS-TECA对由CCl4诱发的肝细胞毒性的作用
保护作用(％)*条件 GPT SDH GST GSH GSSG SOD空白对照** 100 100 100 100 100 100阳性对照*** 0 0 0 0 0 0WS-TECA 1μg/ml 10.1 3.0 2.8 6.6 13.9 15.8WS-TECA 10μg/ml 26.9 14.9 5.4 12.7 55.8 31.6WS-TECA 50μg/ml 35.2 34.3 36.8 26.1 60.0 36.8WS-TECA 100μg/ml 64.5 55.8 49.2 57.0 63.9 57.9WS-TECA 300μg/ml 53.6 41.7 38.0 45.5 55.8 47.4
*保护(％)＝(阳性对照-样品)/(阳性对照-空白对照)
**空白对照：未处理的肝细胞
***阳性对照：CCl4处理的肝细胞
表2
WS-TECA对由CCl4诱发的肝细胞毒性的作用
保护作用(％)*条件 GPT SDH RNA 合成(cpm)空白对照** 100 100 615±48阳性对照*** 0 0 125±11WS-TECA 1μg/ml 10.8 12.2 109±32WS-TECA 10μg/ml 18.5 19.1 204±29WS-TECA 100μg/ml 30.8 32.7 234±14WS-TECA 300μg/ml 41.5 43.9 267±58
*保护(％)＝(阳性对照-样品)/(阳性对照-空白对照)
**空白对照：未处理的肝细胞
***阳性对照：CCl4处理的肝细胞
E)抗纤维化作用
通过胆管结扎技术或通过四氯化碳处理诱发试验动物肝纤维化。给与试验动物在本发明中得到的WS-TECA，以便定量地估计血清溶胶原N端基肽(PIIIP)和羟基脯氨酸，因而测定组织中引起纤维化过程的主要因素胶原蛋白的生物合成和蓄积。
试验过程和WS-TECA抗纤维化结果如下。
所述胆管结扎方法按下列方式进行，即切开雄性SD鼠(200-220g)的腹部并使其胆管双结扎达4周，以便诱发肝细胞纤维化。一日一次，腹膜给药。使用家兔抗PIIIP抗体，使用ELISA方法定量测定血清中的PIIIP。使用染色法完成所述肝组织中胶原蛋白的定量过程，其中，当使所述肝组织酸水解时，释放出的羟基脯氨酸用氯胺T和ER溶液(对二甲胺基苯甲醛、高氯酸、异丙醇)处理。
就所述结扎胆管试验中抗纤维化作用而言，WS-TECA可以降低作为肝纤维化指标的羟基脯氨酸的量(见表3)。此外，使用WS-TECA可以抑制用作胶原蛋白生物合成指标的PIIIP血清浓度(见表4)。显然，WS-TECA对缓解肝纤维化是有效的。
下列为由四氯化碳诱发的肝纤维化试验。
按体重，每周两次，共四周，腹膜给与雄性SD鼠480mg的CCl4。同时，一天一次，共四周，腹膜给与溶于生理盐水中的所述试验药物。以与胆管结扎试验相同的方法定量测定血清中的PIIIP和肝组织中的胶原蛋白。
所述CCl4处理产生比所述胆管结扎要轻得多的纤维化诱发作用，且在未使用药物的条件下，用CCl4处理的肝组织使胶原蛋白沉淀量为对照组的两倍。
WS-TECA抑制肝组织中胶原蛋白沉淀(见表5)以及降低血清中PIIIP的浓度(见表6)，它显示剂量依赖关系。
这些数据表明，由于WS-TECA增加胶原蛋白的合成，可以用于缓解肝纤维化和因阻碍胶原蛋白合成引起的肝组织中胶原蛋白的沉淀。
表3
WS-TECA对在肝组织中羟基脯氨酸沉淀的抑制作用 组 肝组织中总羟基脯氨酸空白对照 32.11±6.07结扎胆管 162.2±127WS-TECA 给药
1.5mg/kg 111.2±60.6
5.0mg/kg 96.4±51.7
表4
WS-TECA对血清中PIIIP浓度的降低作用组 PIIIP血清浓度空白对照 6.1±2.9结扎胆管 37.4±12.9WS-TECA 给药
1.5mg/kg 25.5±6.4
表5
WS-TECA对CCl4处理鼠中胶原蛋白沉淀的抑制作用组 肝组织中总羟基脯氨酸空白对照 1.67±0.26CCl4-处理 3.02±0.78WS-TECA 给药
0.5mg/kg 3.29±1.34
1.5mg/kg 2.39±0，89
5.0mg/kg 2.18±1.03
表6
WS-TECA对于CCl4处理鼠血清中PIIIP浓度的降低作用组 PIIIP血清浓度空白对照 7.4±2.9结扎胆管 47.2±7.8WS-TECA 给药
0.5mg/kg 32.8±9.2
1.5mg/kg 26.1±3.5
5.0mg/kg 27.6±6.3
通过下列实施例可以更好地理解本发明，它们只是解释本发明，而不对其加以限制。
实施例1
将32升70％乙醇加入4.7kg干燥的Centella asiatica中，然后，使其冷冻沉淀48小时。将得到的醇提物置于瓶子中，加入17升二氯甲烷，并搅拌1小时。在完全分层后，取上层，加入5升乙醇和7升的二氯甲烷，并搅拌1小时。等再次完全分层后，取上层，使用17升正丁醇提取。用0.1N氢氧化钠分数次洗涤正丁醇层提取物，然后，用水洗几次。真空浓缩正丁醇层到十分之一(体积)，使得到的浓缩物与5升乙酸乙酯混合，以便结晶。抽滤所得结晶，以便得到剩下的固体。然后，用少量的乙酸乙酯洗，于50℃，真空干燥24小时，得到120g黄色固体。
实施例2
将35升70％的乙醇加入5kg的Centella asiatica中，然后，使其于10℃放置48小时。
将所得乙醇提取物置于瓶中，按实施例1相同方法处理，得到125g的积雪草苷和羟基积雪草苷(4∶6)的混合物。
实施例3
按实施例1相同方法得到积雪草苷和羟基积雪草苷(6∶4)的混合物。
实施例4
使用流动相(正丁醇∶乙醇∶氨水∶水＝60∶40∶5∶10)将硅胶(70-230目)装入直径6cm，长度26cm的柱子内。然后，将1g的WS-TECA溶解在尽可能少的流动相中并加样。使流动相以恒速流下并用25ml小瓶收集，分别得到400mg纯的积雪草苷和羟基积雪草苷。
试验实施例
将5gWS-TECA溶于100ml甲醇中，然后，加入3ml 5N氢氧化钠并加热回流12小时。使生成的溶液和常规的TECA在固定相上用流动相(正丁醇∶乙醇∶氨水∶水＝60∶40∶5∶10)展开，并用无水乙酸和硫酸(9∶1)的混合物显色，以便鉴定包含羟基积雪草酸和积雪草酸的WS-TECA的水解产物。
其水解产物的HPLC分析显示积雪草苷和羟基积雪草苷以5∶5的比例存在。
在许多国家，每年经常发生慢性肝炎例如病毒性肝炎和酒精性肝炎，死亡率很高。所述肝病持续地引起肝细胞的损伤，因而导致肝纤维化。迄今，一直尝试使用colchichine和UDCA治疗所述肝病，然而，关于其作用有许多不同的观点。所以，迫切要求开发能够降低肝细胞损伤和纤维化的新的治疗剂。正如上述，预期自Centella asiatica提取的积雪草苷和羟基积雪草苷的混合物能够降低慢性肝病的浆液性及由于该疾病导致的死亡率。
本发明是说明性的，所用术语是为了说明而不是加以限制。
根据上述说明，可对本发明行许多改动。所以，在本权利要求书的范围内，用不同的方法实施本发明，是可以理解的。