新型双特异性抗体及其用途技术领域
本申请大体涉及抗体药物领域，具体而言，本申请提供了新型双特异性抗体及其
医学和生物学用途。
背景技术
双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是一类人工抗体，其包含两个不同的
抗原结合位点。双特异性抗体在生物医药领域，尤其是肿瘤免疫治疗方面应用广泛。
双特异性抗体从作用机制上可分为双重信号阻断型和介导细胞功能型。通常，介
导细胞功能型双特异性抗体指介导T细胞杀伤的抗CD3双特异性抗体。1985年，利用T细胞杀
死肿瘤细胞的概念就已被提出(Stearz at al.Nature 1985，314：628-631)。通常认为有效
激活T细胞需要双重信号，第一信号来自抗原呈递细胞上MHC-抗原复合物与T细胞受体TCR-
CD3的结合，第二信号为T细胞与抗原呈递细胞表达的共刺激分子相互作用后产生的非抗原
特异性共刺激信号。由于多数癌细胞表面MHC的表达下调甚至缺失，从而使癌细胞逃逸免疫
杀伤。靶向CD3的双特异性抗体则能够分别结合T细胞表面CD3分子和癌细胞表面抗原，从而
拉近细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，Tc或CTL)与癌细胞的距离，引导T细胞直接杀伤癌
细胞，而不再依赖于T细胞的双重激活信号。双特异性抗体可以是三功能抗体，即一条臂靶
向肿瘤细胞上的抗原，另一条臂靶向T细胞的CD3分子，Fc段结合Fc受体。这种抗体使得T细
胞、肿瘤细胞和结合抗体Fc结构域的效应细胞形成复合体(Muller and Kontermann，
BioDrugs2010；24：89-98)。
CD3分子有δ、ε、γ、ζ共4个亚基，分子量分别为18.9kDa、23.1kDa、20.5kDa、
18.7kDa，各包括171个、207个、182个和164个氨基酸残基。四种亚基组成的6条多肽链与T细
胞受体(T cell receptor，TCR)紧密结合，形成包含8条多肽链的TCR-CD3复合物，该复合物
传导T细胞激活信号，稳定TCR结构。CD3的胞内部分含有免疫受体酪氨酸激活基序
(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)，TCR识别和结合MHC分子呈
递的抗原肽，使得T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p561ck磷酸化CD3分子中ITAM的酪氨酸残基，
之后募集含有SH2(Scr homology 2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70)。ITAM磷酸化和
结合ZAP-70是T细胞激活早期信号传导过程的重要生化反应之一。因此，CD3分子有传导TCR
识别抗原产生的激活信号的功能。
由于早期在免疫原性、结构稳定性以及抗体质量控制等方面的不足，限制了双特
异性抗体的进一步发展。近年来，上游基因工程抗体和下游生产工艺技术的改进，克服了传
统双特异性抗体的缺陷，从而推动了多类新型双特异性抗体进入临床开发阶段。为了解决
将两个不同的半抗体进行正确装配的问题，设计开发了多种结构的双特异性抗体。
一类双特异性抗体不含Fc区。这类结构抗体的优点是分子量小，可以在原核细胞
中表达，不需要考虑正确装配的问题；缺点是由于没有抗体Fc段，不能介导相应的生物学功
能，而且半衰期短，因而临床应用受到一定限制。目前已有报道的此类双特异性抗体包括
BiTE、DART、TrandAbs、bi-Nanobody等。德国Micromet公司开发的BiTE(bispecific T-cell
engager)系列产品是将抗CD3scfv与不同抗肿瘤细胞表面抗原scfv通过肽段进行连接获得
的，可同时结合CD3+T细胞和肿瘤细胞。此类抗体克服了稳定性差、表达量低、溶解性低等生
产问题，其中Blinatumomab已成功上市。
另一类双特异性抗体保留抗体Fc结构域。此类抗体形成IgG样结构，具有Fc介导的
生物学功能。目前已有报道的此类双特异性抗体包括Triomabs、kih IgG、Cross-mab、ortho
Fab IgG、DVD IgG、IgG scFv、scFv2-Fc等。这些包含Fc段的双特异性抗体具有体内半衰期
长、能够介导ADCC和CDC等优点。
双特异性抗体(例如靶向CD3和肿瘤表面抗原)将在肿瘤治疗中有良好的应用前
景。
发明内容
第一方面，本申请提供双特异性人IgG1抗体，其包含两种具有相同铰链区的Fc片
段，所述铰链区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：28并替换了天然人IgG1抗体恒
定区的第216-230位序列，抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在一些实施方案中，两种Fc片段包含能够确保重链异聚化的突变。在一些实施方
案中，一个Fc片段包含点突变S354C和T366W，另一个Fc片段包含点突变Y349C、T366S、L368A
和Y407V。
在一些实施方案中，两种Fc片段的N端分别融合识别不同抗原表位的单链抗体
(scfv)。
在一些实施方案中，一种Fc片段的N端融合单链抗体(scfv)，另一种Fc片段的N端
融合Fab片段，单链抗体与Fab片段识别不同的抗原表位。
在一些实施方案中，两种Fc片段的N端分别融合识别不同抗原表位的Fab片段。在
一些实施方案中，识别不同抗原表位的Fab片段包含相同的轻链。
在一些实施方案中，一种Fab片段包含天然的人IgG1抗体恒定区CH1片段，另一种
Fab片段包含突变的人IgG1抗体恒定区CH1片段，突变的人IgG1抗体恒定区CH1片段包含点
突变G137E、N203D和R214T中的任意1个、2个或3个，其中CH1片段的氨基酸序列为抗体恒定
区第118-215位的氨基酸序列。在一些实施方案中，天然的人IgG1抗体恒定区CH1片段的氨
基酸序列为SEQ ID NO：2。在一些实施方案中，突变的人IgG1抗体恒定区CH1片段的氨基酸
序列为SEQ ID NO：30。
在一些实施方案中，两种Fc片段的CH2片段中均包含点突变L234F、L235E和P331S，
其中CH2片段的氨基酸序列为抗体恒定区第231-340位的氨基酸序列。在一些实施方案中，
两种Fc片段的CH2片段的氨基酸序列均为SEQ ID NO：31。
在一些实施方案中，双特异性人IgG1抗体识别人免疫细胞表面抗原和肿瘤细胞表
面抗原。
在一些实施方案中，人免疫细胞表面抗原为CD3E。
在一些实施方案中，所述肿瘤表面抗原选自HER1、HER2、HER3、EpCAM、CEA、PSMA、
CD19、CD20、CD22、CD38和BCMA。
第二方面，本申请提供了包含第一方面所述的双特异性人IgG1抗体的药物组合
物。
在一些实施方案中，药物组合物还包含药学可接受的载体、赋形剂、稀释剂等。
第三方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性人IgG1抗体，或者第二方面所
述的药物组合物在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
第四方面，本申请提供了预防或治疗肿瘤的方法，包括向有需要的个体给予第一
方面所述的双特异性人IgG1抗体或者第二方面所述的药物组合物。
在第三或第四方面的一些实施方案中，肿瘤表达双特异性人IgG1抗体所针对的肿
瘤表面抗原。
在第三或第四方面的一些实施方案中，肿瘤选自乳腺癌、胃癌、结直肠癌、前列腺
癌、胰腺癌、白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤。
附图说明
图1a-图1d为本申请设计的四种不同结构双特异性抗体的结构示意图。
图2显示了采用ELISA方法检测各种双特异性抗体同时结合CD3E和HER2两种抗原
的结果。
图3显示了利用流式细胞术分析各种双特异性抗体与MDA-MB-453人乳腺癌细胞表
面HER2结合的结果。
图4显示了利用流式细胞术分析各种双特异性抗体与PBMC表面CD3结合的结果。
图5a-5g显示了不同双特异性抗体对肿瘤细胞的杀伤作用结果，其中图5a显示了
双特异性抗体对HER2阳性细胞的杀伤结果；图5b显示了双特异性抗体对HER2阴性细胞的杀
伤结果；图5c-图5e显示了双特异性抗体的不同铰链区结构对杀伤活性的影响；图5f和图5g
为双特异性抗体的不同抗原结合部设计对杀伤活性的影响。
图6a-6c显示了不同双特异性抗体介导HER2阳性靶细胞(MDA-MB-453人乳腺癌细
胞)对T细胞的激活，其中图6a和图6b显示了不同双特异性抗体激活T细胞表达早期活化标
志分子CD69的结果；图6c显示了不同双特异性抗体诱导T细胞产生细胞因子IL-2的结果。
序列说明
SEQ ID NO：1为本申请的示例性双特异性抗体包含的铰链区的氨基酸序列，其为
天然的人IgG2抗体的铰链区。
SEQ ID NO：2为天然的人IgG1抗体恒定区CH1片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3为本申请的示例性抗人CD3E单克隆抗体的HCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4为本申请的示例性抗人CD3E单克隆抗体的HCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5为本申请的示例性抗人CD3E单克隆抗体的HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6为本申请的示例性抗人CD3E单克隆抗体和抗HER2单克隆抗体的
LCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7为本申请的示例性抗人CD3E单克隆抗体和抗HER2单克隆抗体的
LCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8为本申请的示例性抗人CD3E单克隆抗体和抗HER2单克隆抗体的
LCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9为本申请的示例性抗HER2单克隆抗体的HCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10为本申请的示例性抗HER2单克隆抗体的HCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11为本申请的示例性抗HER2单克隆抗体的HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12为本申请的示例性抗人CD3E单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序
列。
SEQ ID NO：13为本申请的示例性抗人CD3E单克隆抗体和抗HER2单克隆抗体的轻
链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14为本申请的示例性抗HER2单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15为本申请的示例性双特异性抗体的含抗HER2 scfv的臂(抗HER2
scfv-Fc融合蛋白)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：16为本申请的示例性双特异性抗体的含抗人CD3E scfv的臂(抗人
CD3E scfv-Fc融合蛋白)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17为本申请的示例性双特异性抗体的含抗HER2 Fab的臂的重链部分
的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18为本申请的示例性双特异性抗体的含抗HER2 Fab或含抗人CD3E
Fab的臂的轻链部分的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19为本申请的示例性双特异性抗体的含抗人CD3E Fab的臂的重链部
分的氨基酸序列。
SEQ ID NO：20为本申请的示例性双特异性抗体的含抗HER2 Fab的臂的重链部分
的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21为本申请的示例性双特异性抗体的含抗HER2 scfv的臂(抗HER2
scfv-Fc融合蛋白)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22为本申请的示例性双特异性抗体的含抗人CD3E scfv的臂(抗人
CD3E scfv-Fc融合蛋白)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23为本申请的示例性双特异性抗体的含抗HER2 Fab的臂的重链部分
的氨基酸序列。
SEQ ID NO：24为本申请的示例性双特异性抗体的含抗人CD3E Fab的臂的重链部
分的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25为本申请的示例性双特异性抗体的含抗HER2 Fab的臂的重链部分
的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26为本申请的示例性双特异性抗体的含抗HER2 Fab的臂的重链部分
的氨基酸序列。
SEQ ID NO：27为本申请的示例性双特异性抗体的含抗人CD3E Fab的臂的重链部
分的氨基酸序列。
SEQ ID NO：28为本申请的示例性双特异性抗体包含的铰链区的氨基酸序列，其为
天然的人IgG2抗体的铰链区的变体。
SEQ ID NO：29为本申请的示例性双特异性抗体包含的铰链区的氨基酸序列，其为
天然的人IgG1抗体的铰链区。
SEQ ID NO：30为本申请的示例性双特异性抗体包含的Fab片段中的CH1片段的氨
基酸序列。
SEQ ID NO：31为本申请的示例性双特异性抗体包含的Fc片段中的CH2片段的氨基
酸序列。
SEQ ID NO：32为人CD3E胞外区(CD3E)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：33为人CD3D胞外区(CD3D)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：34为猴CD3E胞外区(mfCD3E)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35为猴CD3D胞外区(mfCD3D)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：36为小鼠CD3E胞外区(mCD3E)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：37为小鼠CD3D胞外区(mCD3D)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：38为HER2胞外区D1D2D3部分(HER2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：39为His标签的氨基酸序列。
SEQ ID NO：40为鼠抗体IgG2a的Fc片段(mFc)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41为人IgG1抗体的Fc片段变体(FcK)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：42为人IgG1抗体的Fc片段变体(FcH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：43为天然的人IgG1抗体重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：44为人IgG1抗体重链恒定区的变体(IgG1Hn)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：45为人IgG1抗体重链恒定区的变体(IgG1Kn)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：46为人IgG1抗体重链恒定区的变体(IgG1Hn-m3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：47为人IgG1抗体重链恒定区的变体(IgG1kn-m3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：48为人IgG1抗体重链恒定区的变体(IgG1H3n-m3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：49为人IgG1抗体重链恒定区的变体(IgG1kn1-m3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：50为人IgG1抗体重链恒定区的变体(IgG1H3n1-m3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：51为人IgG1抗体κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
发明详述
定义
除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
在本文描述抗体结构时，涉及氨基酸位置编号的描述参照人IgG1抗体的EU
numbering定义，这是本领域技术人员公知且容易查询到的。此外，在本文结合EU
numbering位置描述突变时，是指相对于天然抗体序列产生的突变。
本文所用术语“Fc片段”、“Fc结构域”、“Fc部分”或类似的术语是指抗体重链恒定
区的一部分，包括铰链区(hinge)、恒定区的CH2片段和CH3片段。参照人IgG1抗体的EU
numbering定义，Fc片段是抗体恒定区中第216-447位的氨基酸序列。
本文所用术语“Fab(fragment antigen binding)片段”、“Fab部分”或类似的术语
是指完整的抗体用木瓜蛋白酶处理后产生的能够与抗原结合的抗体片段，包括完整的轻链
(VL-CL)、重链可变区和CH1片段(VH-CH1)。
本文所用术语“单链抗体(scfv，single chain fragment variable)”是指一般利
用基因工程技术构建的单链结构的抗体，包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的一条多
肽链。在重链可变区和轻链可变区之间通常会设计一段柔性的连接肽(linker)以便重链可
变区和轻链可变区可以折叠成为能够结合抗原的正确构象。
本文所用术语“双特异性抗体”是具有结合两种不同抗原能力的抗体，其可以由两
个Fc片段以及分别与其融合的两个抗原结合部分组成，每个抗原结合部分可以为Fab片段
的形式或单链抗体的形式。
本文所用术语“双特异性人IgG1抗体”是指基于人IgG1抗体的双特异性抗体，并且
除了本文说明的改变结构之外，其具备人IgG1抗体的基本特征和功能。
在本文的某些实施方案中，将双特异性抗体描述为具有两个“臂”，例如，在图1a-
图1d所示的四种结构中，以中间为界，可以将双特异性抗体分为两个臂。双特异性抗体的臂
可以由Fc片段和抗原结合部分(Fab片段或单链抗体)组成。对于由Fc片段和Fab片段组成的
臂，其结构类似于通常的抗体，含有完整的重链和轻链。
本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对
抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即
kabat定义和Chothia定义。(参阅例如Kabat，“Sequences of Proteins of Immunological
Interest”，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)；A1-Lazikani et
al.，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；以及Martin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：
9268-9272(1989))。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来
确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。
对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例
如可以利用在线软件Abysis确定(http：//www.abysis.org/)。
如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体
至抗原表位的结合。
第一方面，双特异性人IgG1抗体，其包含两种具有相同铰链区的Fc片段，所述铰链
区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：28并替换了天然人IgG1抗体恒定区的第216-
230位序列，抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
SEQ ID NO：1为天然的人IgG2抗体的铰链区，SEQ ID NO：28为天然的人IgG2抗体
的铰链区的变体。本申请的发明人通过研究意想不到地发现，在双特异性人IgG1抗体中引
入人IgG2抗体的铰链区能够改进双特异性抗体的一些功能和性质。
当构建保留抗体Fc结构域的双特异性抗体时，可以从以下两个角度优化双特异性
抗体的结构：一是重链异聚化，二是轻链和重链的正确装配。在一些实施方案中，两种Fc片
段包含能够确保重链异聚化的突变。KIH技术(knob-in-hole，KIH)是解决重链异聚化的一
种策略。通常，KIH技术是指通过改造CH3区的氨基酸序列，形成有利于异种半抗体相互配对
的结构，可以在构成双特异性抗体的同时又尽可能地保持正常抗体的结构。在一些实施方
案中，所利用的KIH技术包括，使一个Fc片段包含点突变S354C和T366W，另一个Fc片段包含
点突变Y349C、T366S、L368A和Y407V。关于KIH技术的指导，例如可参见“An efficient
route to human bispecific IgG”，A.Margaret Merchant et al.，Nature
Biotechnology，Volume16，1998，通过引用的方式将该文献全文并入本文。
在一些实施方案中，两种Fc片段的N端分别融合识别不同抗原表位的单链抗体
(scfv)。
在一些实施方案中，一种Fc片段的N端融合单链抗体(scfv)，另一种Fc片段的N端
融合Fab片段，所述单链抗体与所述Fab片段识别不同的抗原表位。
在一些实施方案中，两种Fc片段的N端分别融合识别不同抗原表位的Fab片段。由
此形成的双特异性抗体的结构接近于天然抗体，也是优选的一种实施方案。
在一些实施方案中，识别不同抗原表位的Fab片段包含相同的轻链。该实施方案有
利于轻链和重链的正确装配，也是优选的一种实施方案。
在一些实施方案中，一种Fab片段包含天然的人IgG1抗体恒定区CH1片段，另一种
Fab片段包含突变的人IgG1抗体恒定区CH1片段，突变的人IgG1抗体恒定区CH1片段包含点
突变G137E、N203D和R214T中的任意1个、2个或3个，其中CH1片段的氨基酸序列为抗体恒定
区第118-215位的氨基酸序列。在一些实施方案中，天然的人IgG1抗体恒定区CH1片段的氨
基酸序列为SEQ ID NO：2。在一些实施方案中，突变的人IgG1抗体恒定区CH1片段的氨基酸
序列为SEQ ID NO：30。
不被任何理论所束缚，在一种Fab片段中引入上述突变能在不改变抗体恒定区结
构/功能以及免疫原性的前提下，改变含有该突变的重链的电荷特性(等电点，pI)，进而有
利于双特异性抗体的后期纯化。137、203和214这三个位点位于CH1结构域的亲水区(结构域
的表面)，对其进行突变不会改变CH1的构象，所涉及的突变是将碱性氨基酸改为中性氨基
酸(如R214T)，或者将中性氨基酸改为酸性氨基酸(如G137E、N203D)，这样的突变能导致含
有突变的这条重链的等电点(pI)下降，低于未突变的另一条重链的等电点，这有利于后期
纯化过程中利用等电点不同将目的双特异性抗体与例如KIH技术可能产生的同聚体进行有
效的分离。而且，上述突变也天然存在于其它亚型的抗体(如IgG2、IgG4)，预期不会导致明
显的免疫原性问题。
在一些实施方案中，两种Fc片段的CH2片段中均包含点突变L234F、L235E和P331S，
其中CH2片段的氨基酸序列为抗体恒定区第231-340位的氨基酸序列。在一些实施方案中，
两种Fc片段的CH2片段的氨基酸序列均为SEQ ID NO：31。
在CH2片段中引入上述突变能够降低抗体Fc段介导的抗体依赖性细胞毒作用
(ADCC)，从而可能减少双特异性抗体在体内导致的副作用。关于上述突变的指导，例如可参
见“The binding affinity of human IgG for its high affinity Fc receptor is
determined by multiple amino acids in the CH2domain and is modulated by the
hinge region”，Stephen M.Canfield et al.，J.Exp.Med.Volume 173，1991，通过引用的
方式将该文献全文并入本文。
在一些实施方案中，双特异性人IgG1抗体识别人免疫细胞表面抗原和肿瘤细胞表
面抗原。
在一些实施方案中，人免疫细胞表面抗原为CD3E。
抗CD3E抗体能结合T细胞表面TCR受体复合物中的CD3E亚基，能够提供T细胞激活
的第一信号(类似于抗原呈递细胞上的MHC-肽复合物结合到TCR)，有利于T细胞的激活。而
且包含针对CD3E的的抗原结合部的双特异性抗体，可以实现T细胞在肿瘤细胞周边的富集，
提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
在一些实施方案中，所述肿瘤表面抗原选自HER1、HER2、HER3、EpCAM、CEA、PSMA、
CD19、CD20、CD22、CD38和BCMA。
HER2基因位于人17q21染色体，编码分子量185kD的跨膜蛋白，该蛋白有酪氨酸激
酶活性，正常状态下以无活性形式存在，参与调节细胞正常分化，通常只在婴儿期表达，成
人只在少数组织中低水平表达。HER2基因在正常细胞中是双拷贝基因，通过基因突变激活，
其扩增导致转录上调，蛋白表达增加。HER2是人表皮生长因子受体(epidermal growth
factor receptor，EGFR)家族的第二个成员，属于I型受体酪氨酸激酶家族，在许多正常和
异常表皮细胞的生长、分化和代谢过程中起重要的调节作用，多种肿瘤的发生、发展和疾病
状态都与HER2相关。该家族共有4种受体，分别命名为HER1、HER2、HER3和HER4，这些受体相
互作用形成同源或异源二聚体，尤以HER2异二聚体为主，在细胞的信号传导过程中发挥重
要作用。HER2激活抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖；上调VEGF/VPF，加速肿瘤血管生
成，促进肿瘤细胞转移，破坏组织抗侵袭功能(Artufel MV，Valero A C，Llado R R，et
al.Clin Transl Oncol，2005，7.(11)：504-511)。HER2蛋白过表达对诱导细胞分化、增殖和
转化以及促进肿瘤转移、侵袭和粘附具有重要作用(Hynes N E，Stem D F.Biochem
Biophys AcTa，1994，1198(2-3)：165-184.)。由于在20％的乳腺癌病例中过表达，而且与不
良预后相关，因此HER2在乳腺癌中的作用格外受到关注(Reese et al.，Stem Cells 1997；
15：1-8；Andrechek et al.，Proc Natl Acad Sci USA 2000；97：3444-3449.Slamon et
al.，Science 1987；235：177-182)。
CEA(癌胚抗原，carcino-embryonic antigen)是大肠癌组织产生的一种糖蛋白，
作为抗原可引起患者的免疫反应。其广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌，也存在于正常
胚胎的消化管组织中，在正常人血清中也可有微量存在。癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志
物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监
测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物。
PSMA是110kDa的II型穿膜蛋白，基因定位于染色体断臂11q上，表达于正常前列腺
上皮和前列腺肿瘤细胞中，其中在肿瘤细胞中的表达量上调，有研究认为PSMA参与了前列
腺癌发生过程中细胞迁移的调控。在前列腺癌中PSMA的表达和肿瘤的级别及是否存在激素
抵抗呈正相关，PSMA的强表达意味着更高的复发率。现认为PSMA是前列腺癌参考依据之一。
CD19是表达于B淋巴细胞及滤泡树突状细胞的表面蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超
家族成员，位于16号染色体短臂上(16p11.2)，编码556个氨基酸的I型跨膜糖蛋白，分子量
95KD。CD19只在正常和恶性B细胞中表达，几乎不在其他组织中表达；其次，CD19在B细胞恶
性转化过程中不丢失，难治/复发性病例仍然有效；再者，CD19在造血干细胞和pro-B细胞中
不表达，治疗停止后，B细胞可以得到有效地补充。因而近年来靶向CD19的各种白血病治疗
策略取得较好的临床效果，包括CD3+CD19双特异性抗体和靶向CD19的CAR-T等。
CD20抗原是一种B细胞分化抗原，仅表达于前B细胞和成熟B细胞表面，它在95％以
上的B细胞性淋巴瘤中表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。靶向
CD20的多个单抗(如Rituxan)已经在临床上成功的用于多种淋巴瘤的治疗。
CD38是一个定位于膜上的糖蛋白，催化环腺苷二磷酸核糖(cADPR，cyclic ADP-
ribose)的合成和降解。CD38是一个45kDa的单链跨膜糖蛋白，整体结构分为N末端短的胞质
尾，单次跨膜域和C端长的胞外区。成年人中，CD38在大多数自然杀伤细胞、T细胞、B细胞，单
核细胞/巨噬细胞。血小板和红细胞上也有一定程度的表达。靶向CD38的单抗
(daratumumab)已经批准用于多发性骨髓瘤的治疗。
BCMA(B细胞成熟抗原，B-cell maturation antigen)是由185个氨基酸残基组成
的III型跨膜蛋白。它属于TNF受体家族成员，与其配体B细胞激活因子BAFF或增殖诱导配体
APRIL结合可刺激B细胞增生。BCMA正常表达于成熟的B细胞和浆细胞，在多发性骨髓瘤(MM)
中也有广泛的表达，是多发性骨髓瘤的一个非常理想的免疫治疗靶点。
第二方面，本申请提供了包含第一方面所述的双特异性人IgG1抗体的药物组合
物。
在一些实施方案中，药物组合物还包含药学可接受的载体、赋形剂、稀释剂等。
在一些实施方案中，药物组合物用于治疗肿瘤，例如表达双特异性人IgG1抗体所
针对的肿瘤表面抗原的肿瘤。
在一些实施方案中，药物组合物还可包含润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；
润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。
在一些实施方案中，可将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏
剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。
在一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组
合物，这些给药方式包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给
药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。
在一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受
的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。
第三方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性人IgG1抗体，或者第二方面所
述的药物组合物在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
第四方面，本申请提供了预防或治疗肿瘤的方法，包括向有需要的个体给予第一
方面所述的双特异性人IgG1抗体或者第二方面所述的药物组合物。
在第三或第四方面的一些实施方案中，肿瘤表达双特异性人IgG1抗体所针对的肿
瘤表面抗原。
在第三或第四方面的一些实施方案中，肿瘤选自乳腺癌、胃癌、结直肠癌、前列腺
癌、胰腺癌、白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，
而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变
化。
以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。
实施例
实施例1单克隆抗体的制备和确认
作为展示本申请的双特异性人IgG1抗体的一个实例，制备了靶向于人CD3E和HER2
的双特异性人IgG1抗体。
作为制备该双特异性人IgG1抗体的基础，本申请的发明人首先制备了针对人CD3E
和HER2的两种单克隆抗体，该过程需要利用多种不同的重组蛋白，包括重组人CD3E的胞外
区(CD3E，SEQ ID NO：32)，人CD3D-胞外区(CD3D，SEQ ID NO：33)，猴CD3E胞外区(mfCD3E，
SEQ ID NO：34)，猴CD3D胞外区(mfCD3D，SEQ ID NO：35)，小鼠CD3E胞外区(mCD3E，SEQ ID
NO：36)，小鼠CD3D胞外区(mCD3D，SEQ ID NO：37)，重组HER2胞外区D1D2D3部分(HER2，SEQ
ID NO：38)。在自然环境中，CD3E与CD3D形成异源二聚体，因此为了制备有天然构象的CD3E
抗原，我们将CD3E和CD3D同时表达，并利用FcK+FcH异源二聚体方法将CD3D和CD3E形成异源
二聚体，用作本研究中的抗原。这些重组蛋白都有大量的翻译后修饰(如：糖基化或二硫键
等)，因而利用哺乳动物细胞表达系统将更有利于保持重组蛋白的结构和功能。此外，为了
方便纯化，非抗体类的重组蛋白在C端添加了His-tag(SEQ ID NO：39)，或者鼠抗体IgG2a的
Fc段(mFc，SEQ ID NO：40)。重组抗体制备时，抗体重链恒定区可以来自人IgG1抗体(SEQ ID
NO：43)，或者为IgG1恒定区的各种突变体，如：IgG1Hn(SEQ ID NO：44)，IgG1Kn(SEQ ID NO：
45)，IgG1Hn-m3(SEQ ID NO：46)，IgG1kn-m3(SEQ ID NO：47)，IgG1H3n-m3(SEQ ID NO：48)，
IgG1kn1-m3(SEQ ID NO：49)，IgG1H3n1-m3(SEQ ID NO：50)，轻链恒定区是kappa亚型(SEQ
ID NO：51)。
根据Uniprot数据库的各种目的重组蛋白的氨基酸序列，设计并合成上述各种重
组蛋白的基因(包含His-tag、mFc或者Fc编码基因)。利用常规的分子生物学技术将合成的
各种重组蛋白基因克隆至合适的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，然后利
用脂质体(如invitrogen公司的293fectin等)或其它转染试剂(如PEI等)将制备的重组蛋
白表达质粒转染入HEK293细胞(如invitrogen公司的HEK293F)，在无血清悬浮培养条件下
培养3-5天。然后通过离心等方式收获培养上清。
His-tag融合表达的重组蛋白利用金属螯合亲和层析柱(如GE公司的HisTrap FF
等)对培养上清中的重组蛋白进行一步纯化。而mFc融合表达的重组蛋白和重组抗体用
ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行一步纯化。然后利用脱盐柱
(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者其它合
适的缓冲液。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。
利用重组抗体技术得到靶向于肿瘤抗原HER2的单克隆抗体(指定为C6G9+L1A7)和
靶向于人CD3E的单克隆抗体(指定为H10B7+L1A7)。C6G9+L1A7的重链可变区序列为SEQ ID
NO：14，轻链可变区序列为SEQ ID NO：13。H10B7+L1A7的重链可变区序列为SEQ ID NO：12，
轻链可变区序列为SEQ ID NO：13。C6G9+L1A7和H10B7+L1A7具有相同的轻链。此外，C6G9+
L1A7和H10B7+L1A7各自的抗体功能和性质经过实验确认。
实施例2不同结构双特异性抗体的设计和制备
基于实施例1制备和验证的两种单克隆抗体，设计了一系列针对人CD3E和HER2的
双特异性抗体。
由于双特异性抗体的每个臂可以包含Fab片段或scfv，因此根据不同的组合方式
设计了四种结构的双特异性抗体(参见图1a-图1d)。
此外，为了促进形成异源二聚体，使用了基于KIH(Knob-Into-Hole)技术的人IgG1
抗体的Fc片段突变体(FcK，SEQ ID NO：41或者FcH，SEQ ID NO：42)，即，将针对人CD3E(源自
H10B7+L1A7)的抗原结合区融合在含有Knob突变的Fc(FcK)的N端，将针对HER2(源自C6G9+
L1A7)的抗原结合区融合在含有Hole突变的Fc(FcH)的N端。
按照与实施例1类似的重组抗体技术，制备了表1中所示的双特异性抗体(BsAb)和
作为对照的单克隆抗体(MAb)。
表1.不同结构的人CD3E+HER2双特异性抗体和对照单克隆抗体的结构
实施例3各种双特异性抗体的亲和力分析
用GE的Biacore X100plus进行抗体亲和力测定。胺基偶联试剂(Amine coupling
kit)、人抗体捕获试剂(human antibody capture kit)、His捕获试剂(his capture kit)
以及CM5芯片和pH7.4的10×HBS-EP等相关试剂和耗材均购自GE Healthcare公司。
采用捕获法测定不同双特异性抗体的亲和力。在测定实施例2中制备的单克隆抗
体或者双特异性抗体对CD3E的亲和力时，将抗His的抗体偶联至CM5芯片表面，将带有His标
签的CD3E抗原(CD3E-FcK-His/CD3D-FcH)捕获到CM5芯片表面作为固定相，采用单循环的方
法将各种抗CD3E抗体蛋白设置一系列的浓度梯度流经固定相表面，测定各抗体蛋白的亲和
力。
在测定实施例2中制备的单克隆抗体或者双特异性抗体对HER2抗原的亲和力时，
将抗Fc的抗体偶联至CM5芯片表面，稀释各种抗HER2抗体蛋白至合适浓度，分别捕获到CM5
芯片表面作为固定相，采用单循环的方法将重组的HER2-His设置一系列的浓度梯度流经固
定相表面，测定不同抗体蛋白的亲和力。
本实施例中使用的人CD3E和HER2抗原的制备见实施例1的描述。
如表2和表3的结果所示，各种双特异性抗体均能够分别有效结合CD3E和HER2两种
抗原。
表2.对照单克隆抗体和双特异性抗体结合CD3E的亲和力常数
抗体
Ka
Kd
KD
MAb1
1.615E+7
4.871E-3
3.016E-10
BsAb1
3.161E+6
2.275E-2
7.189E-9
BsAb2
8.260E+5
1.118E-2
1.353E-8
BsAb3
4.346E+5
4.122E-2
9.486E-8
BsAb4
3.221E+6
1.198E-2
3.718E-9
BsAb5
1.276E+6
1.228E-2
9.622E-9
BsAb6
2.2E+6
8.701E-3
3.954E-9
BsAb7
6.573E+5
8.677E-3
1.320E-8
BsAb8
3.111E+6
1.843E-2
5.924E-9
表3.对照单克隆抗体和双特异性抗体结合HER2的亲和力常数
抗体
Ka
Kd
KD
MAb2
1.194E+5
6.676E+-4
5.313E-9
BsAb1
9.659E+4
6.846E+-4
7.088E-9
BsAb2
7.427E+4
9.622E+-4
1.296E-8
BsAb3
1.32E+5
9.474E+-4
7.175E-9
BsAb4
8.231E+4
7.118E+-4
8.648E-9
BsAb5
6.666E+-4
7.172E+-4
1.076E-8
BsAb6
8.252E+4
6.984E+-4
8.463E-9
BsAb7
9.533E+4
6.473E+-4
6.79E-9
BsAb8
5.236E+4
5.071E-4
9.686E-9
实施例4各种双特异性抗体同时识别CD3E和HER2两种抗原的能力鉴定
利用常规ELISA方法检测实施例2中制备的双特异性抗体对CD3E和HER2两种抗原
的同时结合，ELISA流程如下：首先用CD3E-FcK/CD3D-FcH抗原包被ELISA板，4℃冰箱过夜；
然后用含有1％BSA的封闭液37℃封闭1小时；洗涤后加入双特异性抗体37℃孵育1小时；洗
涤后加HER2-His抗原，37℃孵育1小时；洗涤后加入HRP-抗His IgG，37℃孵育1小时；洗涤后
加入HRP底物液进行显色分析。结果如图2所示：构建的各种双特异性抗体均能够同时识别
CD3E和HER2两种抗原。
实施例5各种双特异性抗体识别细胞表面的CD3E和HER2的能力鉴定
通过流式细胞术分析实施例2中制备的双特异性抗体与MDA-MB-453人乳腺癌细胞
上表达的人HER2或人PBMC上表达的人CD3的结合能力。MDA-MB-453细胞购自中国医学科学
院基础医学研究所基础医学细胞中心，并培养于RPMI1640培养基中。PBMC利用Ficoll密度
梯度离心法从志愿者全血中分离，并培养于RPMI1640培养基中。
采集正常志愿者的血液(各50mL)，其中所采集的血液由发明人及其同事作为志愿
者提供，所有志愿者均已签署知情同意书。志愿者的纳入标准为：
1.年龄大于18周岁；
2.无HIV、HBV感染；
3.血常规检测正常；
4.非孕妇或哺乳期妇女。
收集培养的细胞，并使用台盼蓝染色评估细胞活力。然后将活细胞在含有0.1％
BSA的PBS缓冲液中调整至3×106个细胞/ml，向圆底96孔板中每孔加入90μl的细胞悬浮液。
向含细胞的孔中加入10μl的双特异性抗体或相应的两种单克隆抗体(MAb1和MAb2)以获
17.8nM(MDA-MB-453结合研究)或者53.3nM(PBMC结合研究)的终浓度。于4℃下孵育30分钟
后，将细胞离心(5分钟，350g)，利用150μl/孔含BSA的PBS染色缓冲液洗涤，重悬浮并与100μ
l/孔荧光染料缀合的羊抗人IgG抗体于4℃下孵育额外的30分钟。然后通过加入150μl/孔
PBS染色缓冲液并在350g下离心5分钟来洗涤细胞。利用150μl/孔PBS染色缓冲液进行第二
个洗涤步骤。将样品重悬浮在100μl/孔PBS染色缓冲液中，使用流式细胞仪(BD
Biosciences)获得并分析所述样品。结果如图3和图4中所示：实施例2中制备的双特异性抗
体均能够分别识别MDA-MB-453人乳腺癌细胞上表达的人HER2和PBMC上表达的人CD3。
实施例6各种双特异性抗体介导T细胞对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤
收集MDA-MB-453人乳腺癌细胞(HER2阳性细胞)或MDA-MB-468人乳腺癌细胞(HER2
阴性细胞，购自中国医学科学院基础医学研究所)，计数，并使用台盼蓝评估细胞活力。调整
细胞密度为2×105/ml，每孔100μl接种于96孔细胞培养板，然后加入起始浓度为3.3nM，10
倍梯度稀释的实施例2中制备的CD3+HER2双特异性抗体。为了方便比较，将不同的CD3+HER2
双特异性抗体或者对照单克隆抗体(MAb1和MAb2)调整至相同的摩尔浓度。最后向孔中加入
人PBMC细胞(效应物)以获得5：1的最终E：T比例。同时设置单独靶细胞(MDA-MB-453人乳腺
癌细胞或MDA-MB-468人乳腺癌细胞)对照、单独PBMC细胞(效应细胞)对照、单独培养基做空
白对照。孵育20小时后，取上清，参照CytoTox非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书
(CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity Assay，promega，G1780)检测和分析双特
异性抗体介导的T细胞对靶细胞MDA-MB-453人乳腺癌细胞的杀伤率。检测结果如图5a-图5g
和表4所示：本申请构建的各种双特异性抗体(BsAb)均能有效介导T细胞对HER2阳性靶细胞
的杀伤，不能介导T细胞对HER2阴性靶细胞的杀伤，双特异性抗体中抗原结合部的形式或铰
链区的序列的不同选择带来的双特异性抗体的活性存在一定差异。当采用SEQ ID NO：1或
者SEQ ID NO：28所示的铰链区时，双特异性抗体能够介导T细胞对肿瘤细胞实现更强的杀
伤能力。
表4.不同双特异性抗体介导T细胞对靶细胞MDA-MB-453杀伤的EC50
实施例7各种双特异性抗体介导的T细胞激活
收集表达HER2的MDA-MB-453人乳腺癌细胞，计数并使用台盼蓝评估细胞活力。调
整MDA-MB-453人乳腺癌细胞的细胞密度为2×105/ml，每孔100μl接种于96孔细胞培养板，
然后加入系列稀释的实施例2制备的各种CD3+HER2双特异性抗体。为了方便比较，将不同的
CD3+HER2双特异性抗体或者对照单克隆抗体(MAb1和MAb2)调整至相同的摩尔浓度。最后向
孔中加入人PBMC(效应物)以获得5：1的最终E：T比例。同时设置单独靶细胞(MDA-MB-453人
乳腺癌细胞)对照。孵育20小时后，通过离心(5分钟，350g)沉淀细胞并利用150μl/孔PBS缓
冲液洗涤两次。加入抗人CD3和人CD69的抗体(eBioscience，11-0037-42，12-0699-42)，于4
℃下避光孵育30分钟。然后利用150μl/孔PBS缓冲液洗涤细胞两次，重悬浮于100μl/孔PBS
缓冲液中，并使用流式细胞仪(BD Biosciences C6)对细胞样品进行分析并比较不同样品
处理后CD3阳性细胞群中激活标志物CD69的表达差异。或者在孵育20小时后，取培养上请，
利用ELISA分析上清中IL2水平(人IL-2ELISA试剂，DAKEWE，DKW12-1020-096)。结果如图6a-
图6c所示：本申请构建的多种双特异性抗体均能够实现HER2阳性靶细胞对T细胞的特异性
激活。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在
本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因
此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。