调节Swiprosin-1表达改善血脑屏障通透性技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及调节Swiprosin-1表达
改善血脑屏障通透性。
背景技术
血脑屏障(bloodbrainbarrier)是指脑毛细血管阻止某些物质(多半是有
害的)由血液进入脑组织的结构。血液中多种溶质从脑毛细血管进入脑组织，
有难有易，有些很快通过，有些较慢，有些则完全不能通过，这种有选择性的
通透现象使人们设想可能有限制溶质透过的某种结构存在，这种结构可使脑组
织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳
定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。
中枢神经系统疾病常引起血脑屏障结构和功能的剧烈变化。如新生儿核黄
疸和血管性脑水肿，使脑毛细血管内皮细胞间紧密连接开放，屏障的通透性显
著提高以致血浆白蛋白(分子量为69000)这样的大分子物质都可通过屏障。
严重脑损伤导致血脑屏障的严重破坏，使血清蛋白也可通过屏障进入脑组织。
随着脑损伤的修复，大分子物入脑首先停止，完全恢复后小分子物交换加快现
象也会消失，此时血脑屏障功能已经正常。其他中枢神经系统疾病如阿尔茨海
默症、脑卒中、脑肿瘤、神经退行性疾病都可使血脑屏障的通透性增加。此外，
电离辐射、激光和超声波也会导致血脑屏障的通透性增加。
Swiprosin-1又称为EF-handdomain-containingproteinD2(EFHD2)，从秀
丽隐杆线虫(C.elegans)至人类(H.sapiens)中均保守表达。Swiprosin-1于
2004年首次报道发现，由于蛋白结构中含有两个可以与Ca2+结合的结构域
(EF-domain)，其功能推测与调节钙离子相关，在果蝇中，Swiprosin-1可参与
成肌细胞融合；此后10年内，陆续有报道指出Swiprosin-1参与B细胞受体调
节、增强BCR引发的凋亡，在肥大细胞中参与细胞因子的调节等，在免疫调
节方面起作用。同时，Swiprosin-1在其他方面的作用尚不明确。
目前关于Swiprosin-1与血脑屏障通透性之间的关系还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供Swiprosin-1及其调节剂的
新用途。
在本发明的第一方面，提供了Swiprosin-1及其调节剂在制备药物中的用
途，所述的药物用于：
a)调节血脑屏障通透性；或
b)制备血脑屏障通透性增加或降低的动物模型。
所述的调节剂选自抑制剂或增效剂。
作为本发明的一种具体实施方式，所述的增效剂是Swiprosin-1过表达载
体。
作为本发明的一种具体实施方式，所述的抑制剂选自以Swiprosin-1蛋白
或其转录本为靶序列、且能够抑制Swiprosin-1蛋白表达或基因转录的siRNA、
shRNA、dsRNA、微小RNA、长链非编码RNA、反义核酸；或能表达或形成
所述siRNA、shRNA、dsRNA、微小RNA、长链非编码RNA、反义核酸的构
建物。
优选地，所述的抑制剂选自下列a)或b)
a)siRNA，所述的siRNA包含以下序列：
正义链：5’-AAGGGUGCCAAGAACUUCU-3’，
反义链：5’-AGAAGUUCUUGGCACCCUU-3’；
b)DNA双链序列，所述的DNA双链序列包含以下序列：
上游链：5’-CGCGTCCCCAAGGGTGCCAAGAACTTCTTTCAAGAGAAGAAG
TTCTTGGCACCCTTTTTTTGGAAAT-3’，
下游链：5’-CGATTTCCAAAAAAAGGGTGCCAAGAACTTCTTCTCTTGAAA
GAAGTTCTTGGCACCCTTGGGGA-3’。
在本发明的第二方面，提供了一种siRNA，所述的siRNA包含以下序列：
正义链：5’-AAGGGUGCCAAGAACUUCU-3’，
反义链：5’-AGAAGUUCUUGGCACCCUU-3’。
在本发明的第三方面，提供了一种用于敲降Swiprosin-1的DNA双链序列，
所述的DNA双链序列包含以下序列：
上游链：5’-CGCGTCCCCAAGGGTGCCAAGAACTTCTTTCAAGAGAAGAAG
TTCTTGGCACCCTTTTTTTGGAAAT-3’，
下游链：5’-CGATTTCCAAAAAAAGGGTGCCAAGAACTTCTTCTCTTGAAA
GAAGTTCTTGGCACCCTTGGGGA-3’。
在本发明的第四方面，提供了一种构建物，所述的构建物包含以下DNA
双链序列：
上游链：5’-CGCGTCCCCAAGGGTGCCAAGAACTTCTTTCAAGAGAAGAAG
TTCTTGGCACCCTTTTTTTGGAAAT-3’，
下游链：5’-CGATTTCCAAAAAAAGGGTGCCAAGAACTTCTTCTCTTGAAA
GAAGTTCTTGGCACCCTTGGGGA-3’。
作为本发明的一种具体实施方式，所述的构建物为慢病毒载体。
本发明优点在于：
1、实验证实Swiprosin-1过表达小鼠血脑屏障通透性增加，Swiprosin-1基
因敲除小鼠MCAO术后血脑屏障通透性下降，提示可通过调节Swiprosin-1表
达改变血脑屏障通透性，Swiprosin-1及其调节剂可用于血脑屏障通透性相关疾
病的治疗，以及构建血脑屏障通透性增加或降低的动物模型等。
2、设计的过表达载体起到了显著的提高表达作用，设计的siRNA、shRNA
序列起到了显著的敲降作用，均显著优于一般的过表达载体、siRNA或shRNA
序列。
附图说明
图1.pcDNA-CAG-EFHD2质粒图谱。
图2.XhoI，SalI酶切验证转基因质粒及SalI酶切回收条带。(M：1kbDNA
Marker，FermentasSM1163)。
图3.左图为Swiprosin-1过表达小鼠(SwpOE)基因组鉴定，右图为
Swiprosin-1过表达小鼠大脑中蛋白水平鉴定。
图4.Swiprosin-1过表达鼠(SwpOE)与野生型鼠(SwpWT)相比伊文思蓝
渗出增加(荧光图片检测)。
图5.Swiprosin-1过表达鼠与野生型鼠相比伊文思蓝渗出增加(荧光图片
检测)。Swiprosin-1过表达小鼠(SwpOE)大脑皮质有红色点状渗出，野生型小
鼠(SwpWT)红色点状集中于血管内分布。
图6.Swiprosin-1过表达鼠与野生型鼠相比伊文思蓝渗出增加(组织匀浆
定量)。
图7.Swiprosin-1过表达小鼠大脑皮质中occludin分布完整性破坏，表达
减少。
图8.Swiprosin-1过表达小鼠大脑皮质中ZO-1分布完整性破坏，表达减少。
图9.Swiprosin-1过表达小鼠大脑皮质中claudin-5表达不变。
图10.质粒pLVTHM载体图谱。
图11.Swiprosin-1基因敲除小鼠(Swp-/-)蛋白水平验证。
图12.Swiprosin-1基因敲除小鼠MCAO术后伊文思蓝渗出比较图。上图
为光镜下定性比较图，下图为两组小鼠手术侧与非手术侧伊文思蓝渗出定量比
较。
图13.Swiprosin-1敲除小鼠与野生型小鼠MCAO术后脑组织切片伊文思
蓝荧光显色图片(白色箭头标记处为渗出伊文思蓝的区域)。
图14.Swiprosin-1敲除小鼠与野生型小鼠MCAO术后梗死侧紧密连接蛋
白occludin分布变化情况及表达情况差异(三角形标记为渗出的伊文思蓝区域，
星号标记为MCAO术后occludin破坏部位，箭头所示区域为存留在血管内的
伊文思蓝。)
图15.Swiprosin-1敲除小鼠与野生型小鼠MCAO术后梗死侧紧密连接蛋
白ZO-1分布变化情况及表达情况差异。(三角形标记为渗出的伊文思蓝区域，
星号标记为MCAO术后ZO-1破坏部位，箭头所示区域为存留在血管内的伊文
思蓝。)
图16.脑微血管内皮细胞干扰Swiprosin-1后给予缺糖缺氧(OGD)刺激
可减少紧密连接蛋白ZO-1表达下调。其中，LV-GFP为对照空载慢病毒，
LV-sh-Swp为Swiprosin-1干扰慢病毒。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
如本文所用，所述的“Swiprosin-1增效剂”包括了激动剂、上调剂、稳定
剂等，只要它们能够上调Swiprosin-1基因或蛋白的表达水平，或维持
Swiprosin-1的稳定性，或增加Swiprosin-1的有效作用时间等。它们可以是化
合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、
RNA)的，也可以是上调Swiprosin-1表达的病毒产品。
所述的Swiprosin-1增效剂是指任何可提高Swiprosin-1的活性、提高
Swiprosin-1的稳定性、上调Swiprosin-1的表达、增加Swiprosin-1有效作用时
间的物质，这些物质均可用于本发明。例如，所述的增效剂是：表达Swiprosin-1
的质粒/病毒、化学合成的小分子化合物。
如本文所用，所述的“Swiprosin-1抑制剂”包括了拮抗剂、下调剂、阻滞
剂、阻断剂等，只要它们能够下调Swiprosin-1的表达水平。它们可以是化合
物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、
RNA)的，也可以是抑制Swiprosin-1表达的病毒产品。
所述的Swiprosin-1抑制剂是指任何可降低Swiprosin-1的活性、降低
Swiprosin-1的稳定性、下调Swiprosin-1的表达、减少Swiprosin-1有效作用时
间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调Swiprosin-1有用的物质。
例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，核酸酶，核酸结合分子，
只要其能够下调Swiprosin-1的表达。
实施例1Swiprosin-1过表达小鼠血脑屏障通透性增加
一、Swiprosin-1过表达小鼠制备
1材料
质粒pcDNA-CAG(序列如SEQIDNO.7所示)由南方模式生物研究中心
提供，DH5α购自天根生物公司，EFDH2cDNA购于SourceBioscience；各种
限制性内切酶、T4DNA连接酶、T4DNApolymerase、Taq酶及PCR相关试剂
购自Takara及NEB公司；胶回收Kit购自天根生物公司，质粒抽提Kit购于
Qiagen公司；抗羊源Swiprosin-1多克隆抗体购自Imgenex公司。
转基因质粒构建用引物及转基因阳性鼠鉴定用引物的序列如下：
efdhu1
catGGATCcggggagtgtcaggaagaggaag
SEQ ID NO.5
efdhl1
catAAGCTTgcgtgaatgggctgaagttgggc
SEQ ID NO.6
2方法
2.1转基因质粒的构建
以EFDH2-cDNA为模板，PCR扩增EFHD2(1115bp)。PCR体系为：模板
DNA：1μl，5×PrimeSTARbuffer：4μl，dNTP：1μl，Primermix：2μl，Prime
STARHSDNAPolymerase：0.2μl，ddH2O：11.8μl。反应程序为：95℃3min，
98℃15sec，55℃-68℃15sec，72℃1min30sec，72℃5min，35个循环。用
BamHI和HindIII酶切EFHD2片段及pcDNA-CAG，并连接(连入pcDNA-CAG载
体的EFHD2片段的序列如SEQIDNO.8所示)。通过酶切及测序验证最终载体。
2.2转基因小鼠的制备
以SalI酶切转基因质粒，回收5.5kb的DNA片段用于显微注射。取5-6周龄
C57BL/6J雌鼠超排后与性成熟的C57BL/6J雄鼠交配，挑选见栓鼠取受精卵，培
养在M16培养液中。纯化后的质粒DNA溶解在TE缓冲液中，浓度为5ng/μl，以
M2为体外操作液，将DNA注射到受精卵的雄原核中，注射后的受精卵移植到0.5
天假孕鼠的输卵管，每只假孕鼠输卵管单侧移卵约25枚。
2.3小鼠基因组的制备
移植后的假孕鼠饲养于SPF级动物房，待仔鼠出生10天左右剪取鼠尾0.3
cm，加450μl裂解液及50μl蛋白酶K(10mg/ml)，56℃消化过夜。离心取上清，
无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤，稍晾干后溶解于200μl纯水中。
2.4PCR鉴定转基因阳性鼠
Swiprosin-1上设计引物efdhu1和efdhl1，反应条件为：95℃3min变性
后，95℃30s，60℃30s，72℃1min进行35个循环后，72℃5min，
阳性小鼠应扩增出1.1kb片段(TakaRaLATaqwithGCBufferRR02AG)。
Westernblot检测阳性小鼠大脑中蛋白水平。
3结果
3.1pcDNA-CAG-EFHD2转基因质粒的结构和转基因片段的制备
EFHD2基因克隆到pcDNA-CAG载体中，经酶切和序列分析证实，各组
成元件正确，且阅读框正确。转基因质粒结构见图1；质粒线性化后及电泳分
离结果见图2。
3.2Swiprosin-1过表达小鼠的鉴定
PCR鉴定和Westernblot检测结果见图3。结果表明成功获得转基因阳性
鼠，转基因阳性鼠大脑中Swiprosin-1蛋白水平显著升高，为对照组的2.88倍。
二、Swiprosin-1过表达小鼠血脑屏障通透性检测
1材料
水合氯醛购于国药集团化学试剂有限公司，伊文思蓝、三氯乙酸购于生工
生物。
2方法
伊文思蓝的相对分子量为960.82g/mol，它可以与血浆白蛋白高效的以非共
价的方式结合。在可见光下呈现蓝色，633nm处呈现红色荧光。生理状态下，
伊文思蓝进入血液后与血浆白蛋白结合，无法透过血脑屏障；在血脑屏障通透
性增加时，伊文思蓝可以透过血脑屏障，进入脑实质中，对其进行定量检测可
以作为评价血脑屏障功能破坏程度的依据。
2.1取材
Swiprosin-1过表达小鼠与对照小鼠尾静脉注射2％(wt/vol)伊文思蓝溶
液0.1ml/10g。2h后，小鼠腹腔注射3.5％(wt/vol)水合氯醛全身麻醉(350
mg/kg)。小鼠腹侧向上固定于鼠板，自胸骨剑突处腹部皮肤剪开，沿胸腔两侧
向上，打开胸腔，可避免造成大量出血。暴露心脏，用注射器尖端扎入左心室
处，剪开右心房。打开蠕动泵，心脏灌流生理盐水，控制流速为10ml/min，
灌流时间统一为5min，至心脏流出无色澄明液体。
2.2检测
2.2.1荧光定量检测
Swiprosin-1过表达小鼠心脏灌流后，取脑，将小脑与脑干去除，保留大脑。
将大脑半球表面用生理盐水清洗，吸干表面液体。每个大脑半球分别称重，记
录。将大脑移入2ml离心管中，向其中吸入50％(wt/vol)三氯乙酸溶液1ml，
用匀浆器匀浆。匀浆液体离心，16,000g×20min。上清液吸出，沉淀弃去。收
集上清液，在多功能酶标仪(TECANInfiniteM200PRO)定量分析，激发波
长为620nm，吸收波长为680nm处检测荧光。
2.2.2荧光图片检测
Swiprosin-1过表达小鼠心脏灌流生理盐水后，心脏灌流4％多聚甲醛溶液，
流速为10ml/min，至小鼠四肢抽动，尾巴甩动后，将流速调整为5ml/min。
继续灌注5min。将小鼠脑小心取出，避免损伤大脑表面。将脑组织表面清洗
干净，放置于15％蔗糖溶液中4℃过夜脱水，至样本沉底后，换入30％蔗糖溶
液中，4℃脱水，至标本完全沉底，预计时间为24h～48h左右。将样本冰冻切
片，厚度为16μm。于荧光显微镜下观察，正常情况下脑组织中无伊文思蓝红
色荧光出现，或仅局限分布于血管内；当血脑屏障破坏时，在血管周围会出现
红色浸润区域。
3结果
结果见图4、图5、图6。表明Swiprosin-1过表达小鼠相比于野生型小鼠
大脑中伊文思蓝渗出增加。
三、免疫组织荧光检测紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1表达改变与
形态分布
1材料
多聚甲醛购于生工生物工程(上海)股份有限公司，蔗糖购于国药集团化学
试剂有限公司，抗鼠源β-actin单克隆抗体、抗鼠源GAPDH单克隆抗体、DAPI
染液购于碧云天生物技术研究所，抗兔源claudin-5多克隆抗体购于Millipore
公司，抗兔源occludin多克隆抗体、抗兔源ZO-1多克隆抗体购于Invitrogen
公司。
2方法
2.1免疫组织荧光染色
2.1.1样品处理及冰冻切片制备
标本用4％多聚甲醛前固定后，置于4％多聚甲醛液中，于4℃冰箱后固定
4h。随后放置于15％蔗糖(PBS溶解)溶液中4℃过夜脱水，至样本沉底后，
换入30％蔗糖溶液中，4℃过夜脱水，至标本完全沉底。样品修形，将小脑及
脑干移除，包埋于OCT组织胶中，于-80℃冰箱中速冷。后平衡于冰冻切片机
中，冰冻切片机箱体温度为-20℃，刀头温度为-25℃。组织切片厚度为16～18
μm，贴于多聚赖氨酸处理过的防脱片载玻片上。-80℃冰箱中保存备用。
2.1.2免疫组织荧光染色
烘片：临用前从-80℃冰箱中取出，平衡至室温后，60℃烘箱中烤片2～3h。
在组织周围用组化笔画一封闭圆环，添加液体操作在圆环中完成。PBS浸润清
洗5min×3次(为防止脱片，所有操作均不剧烈晃动)。透膜：组织上加入0.4％
TritonX-100透膜10min，室温放置于摇床上，缓慢摇动。封闭：配置封闭液，
含有5％FBS+2％BSA的0.4％Triton-X100的PBS溶液。于室温摇床上封闭
样本1h，以阻断组织与抗体的非特异性吸附。一抗孵育：加入一抗，比例一
般为1:50～1:100，抗体稀释液为含有5％FBS+2％BSA的0.4％Triton-X100的
PBS溶液。4℃孵育过夜。二抗孵育：PBS浸洗5min×3次。室温避光孵育二
抗1h，比例为1:200，抗体稀释液为PBS。细胞核复染：PBS浸洗5min×3次。
孵育DAPI染液，PBS浸洗5min×3次。所有操作均避光操作。封片，荧光镜
检：抗荧光淬灭封片剂封片，保存于-20℃。备用镜检。
2.2各连接蛋白表达水平检测
Westernblot常规检测各连接蛋白表达水平改变。
3结果
结果见图7、图8、图9。表明Swiprosin-1过表达小鼠相比于野生型小鼠
大脑紧密连接蛋白occludin、ZO-1下调，claudin-5不变。
实施例2Swiprosin-1基因敲除小鼠MCAO术后血脑屏障通透性下降
一、Swiprosin-1基因敲除小鼠(Swp-/-)制备
1方法
1.1转基因质粒的构建
从Swiprosin-1基因中克隆获得长臂片段和短臂片段，连入T载体确认上述片
段的正确性后，将短臂片段连入Neo载体得到Neo-短臂载体，然后再将长臂片段
连入Neo-短臂载体得到长臂-Neo-短臂载体，最后将长臂-Neo-短臂载体连入TK
载体得到TK-长臂-Neo-短臂载体。通过酶切及测序验证最终载体。
1.2转基因小鼠的制备
以Not1酶切TK-长臂-Neo-短臂载体，回收含有长臂序列和短臂序列的DNA
片段用于显微注射。取5-6周龄C57BL/6J雌鼠超排后与性成熟的C57BL/6J雄鼠交
配，挑选见栓鼠取受精卵，培养在M16培养液中。纯化后的质粒DNA溶解在TE
缓冲液中，浓度为5ng/μl，以M2为体外操作液，将DNA注射到受精卵的雄原核
中，注射后的受精卵移植到0.5天假孕鼠的输卵管，每只假孕鼠输卵管单侧移卵
约25枚。
1.3小鼠基因组的制备
移植后的假孕鼠饲养于SPF级动物房，待仔鼠出生10天左右剪取鼠尾0.3
cm，加450μl裂解液及50μl蛋白酶K(10mg/ml)，56℃消化过夜。离心取上清，
无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤，稍晾干后溶解于200μl纯水中。
1.4Swiprosin-1基因敲除小鼠鉴定
Westernblot检测Swiprosin-1基因敲除小鼠大脑中蛋白水平。
2结果
Westernblot检测结果见图11。结果表明成功获得Swiprosin-1基因敲除小
鼠，Swiprosin-1基因敲除小鼠的大脑中Swiprosin-1蛋白水平显著下降。
二、Swiprosin-1基因敲除小鼠大脑中动脉栓塞手术(MCAO)
1手术操作
(a)手术前小鼠过夜禁食。
(b)小鼠经腹腔注射水合氯醛全身麻醉(350mg/kg)，室温控制在25±2℃，
小鼠在术中保持仰卧位于电热板上，维持体温在37℃左右。将温度传感器探头
插入肛环1.5cm左右检测小鼠体温。当体温降至36℃以下时，小鼠可使用照
明用白炽灯加热，灯泡高度位于小鼠上方30cm至35cm处。
(c)将手术缝合线、塑料垫片浸泡于生理盐水中，防止后续步骤对血管的
牵拉。
(d)将小鼠颈部腹侧毛发用水打湿，剃毛，显露出皮肤后用75％酒精消毒。
沿小鼠颈部正中用眼科直剪将皮肤剪开，开口长度约1.5cm。用眼科弯镊钝性
分离小鼠右侧(对手术者而言)肩胛舌骨肌、胸骨乳突肌以及胸骨舌骨肌，暴
露颈总动脉(需要区别颈总动脉与颈总静脉)。并将剥离开的肌肉及组织用提
前固定在鼠板上的自制挂钩勾住，暴露手术视野。
(e)用显微弯镊，将颈总动脉上的迷走神经与其他结缔组织筋膜分离开(分
离过程中避免牵拉刺激迷走神经)。
(f)沿颈总动脉向上找寻颈内动脉与颈外动脉的分叉处，用显微弯镊小心
将颈内动脉分离出，避免损坏颈动脉窦。
(g)在颈总动脉近心端，以及颈外动脉与颈内动脉分叉处分别用3-0手术
缝合线结扎。在颈总动脉远心端与颈外动脉和颈内动脉分叉处之间，用3-0手
术缝合线松弛结扎，并确定其没有分支被扎住(该步骤的目的主要在于固定下
一步进入颈总动脉的栓线，以及防止出血)。
(h)将塑料垫片放置在颈总动脉下，用显微剪在颈总动脉上剪开一个小缺
口，但不要将颈总动脉剪断，抬高垫片。将栓线用显微镊夹住插入颈总动脉，
至通过松弛结扎的缝合线后，将缝合线轻轻系牢(防止颈内动脉出血)。用显
微镊将栓线小心向前推进，通过颈内动脉，进入颅内。
(i)至轻微感觉到有阻力出现时(此时的表现为栓线变弯)，即可停止。轻
微的阻力表示栓线头部已经进入大脑前动脉的近端，阻塞同侧大脑中动脉。此
时栓线头部距离颈外动脉和颈内动脉分叉处约为12-14mm。
(j)扎紧之前松弛的缝合线，将动物置于腹侧位，腹腔注射0.2ml生理盐
水，防止脱水。置于37℃电热毯上，至小鼠苏醒。
2术后指标评价
2.1神经学评分指标
小鼠脑卒中后神经学功能的改变，在术后小鼠苏醒时即可出现，初步标志
手术成功。术后24h，处死动物前，对其进行神经学评分。包括：
0分：无明显神经功能缺失表现，活动正常；
1分：不能完全伸展手术对侧前爪(轻度)；
2分：爬行时出现手术对侧转圈(中度)；
3分：行走时，身体向手术侧偏瘫倾倒(重度)；
4分：不能自发行走，意识丧失(严重)；
5分：死亡。
2.2脑梗死区域的测定
(a)小鼠脱颈处死后，断头。
(b)用眼科剪头端向上挑起，从枕骨大孔伸入，沿大脑中锋将颅骨小心剪
开，避免破坏到大脑。
(c)用预冷的生理盐水浸湿全脑，将全脑放入-20℃冰箱中冷冻5～10min。
弃去小脑及脑干部分，用组织切片刀按冠状方向将大脑切为6片(约1mm厚)。
将脑片浸入放有1％TTC染液的6孔板中，置于37℃恒温水浴槽内，闭光孵育
5min左右，将脑片用眼科镊小心翻面，继续孵育5min，至脑片被均匀染色即
可停止。
(d)将TTC染液回收，向脑片中灌入4％多聚甲醛溶液，过夜静置，使其
组织固定。拍照，可见大脑缺血区域组织显示为白色，正常区域组织显示红色。
三、Swiprosin-1基因敲除小鼠MCAO术后血脑屏障通透性检测
1方法
具体取材和检测的操作同实施例1，只是针对MCAO术后的Swiprosin-1
基因敲除小鼠。
2结果
结果见图12、图13。表明Swiprosin-1基因敲除小鼠相比于野生型小鼠大
脑中伊文思蓝渗出显著减少。
四、免疫组织荧光检测紧密连接蛋白occludin、ZO-1表达改变与形态分布
1材料
同实施例1。
2方法
具体操作同实施例1。
3结果
结果见图14、图15。表明Swiprosin-1基因敲除小鼠相比于野生型小鼠大
脑紧密连接蛋白occludin、ZO-1显著上调。
实施例3Swiprosin-1基因敲除的细胞实验
通过细胞氧糖剥夺实验(OGD)研究大鼠脑微血管内皮细胞rBMEC敲除
Swiprosin-1基因后对紧密连接蛋白ZO-1表达的影响。
1材料
慢病毒载体pLVTHM购于深圳市宝珠生物科技有限公司，载体图谱见图
10；水合氯醛、TTC购于国药集团化学试剂有限公司；PBS购于上海博光生物
有限公司；胎牛血清(FBS)、DMEM培养基购于Gibco公司。
2方法
2.1Swiprosin-1干扰慢病毒载体构建
设计得到以下Swiprosin-1的siRNA分子：
正义链：5’-AAGGGUGCCAAGAACUUCU-3’(SEQIDNO.1)；
反义链：5’-AGAAGUUCUUGGCACCCUU-3’(SEQIDNO.2)。
根据上述siRNA分子设计并合成shRNA，其编码序列为：
上游链：5’CGCGTCCCCAAGGGTGCCAAGAACTTCTTTCAAGAGAAG
AAGTTCTTGGCACCCTTTTTTTGGAAAT3’(SEQIDNO.3)；
下游链：5’CGATTTCCAAAAAAAGGGTGCCAAGAACTTCTTCTCTTG
AAAGAAGTTCTTGGCACCCTTGGGGA3’(SEQIDNO.4)。
将上述shRNA的编码序列插入到慢病毒载体pLVTHM的MluI和ClaI位
点之间，由H1启动子调控表达，该慢病毒载体中含有EF1-alpha启动子调控
的GFP表达。然后通过酶切及测序验证最终载体。
2.2慢病毒的包装
用构建的Swiprosin-1干扰慢病毒载体和包装质粒共转染293T细胞，包装
病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，并测定病毒滴度。
2.3细胞氧糖剥夺实验
(a)原代培养rBMEC，待细胞长满至70％时，转染干扰慢病毒及其对照空
载病毒。转染96h后，弃除正常培养基，PBS漂洗细胞3次。
(b)加入无糖无血清DMEM培养基于待缺氧细胞中，细胞放置于三气培
养箱中，通入含93％N2、5％CO2、2％O2的混合气体，37℃培养，缺氧6h；
正常细胞中弃去含5％FBS的ECM培养基，改加入含5％FBS的DMEM培养
基，放置于37℃正常细胞培养箱中培养。
(c)缺氧终止后，应立即放置于冰板上并进行后续实验，以防止其复氧发
生。
2结果
shRNA的敲除效率为85％。ZO-1表达检测结果见图16。脑微血管内皮细
胞敲除Swiprosin-1基因后，紧密连接蛋白ZO-1表达显著上调。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通
技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些
改进和补充也应视为本发明的保护范围。