一种人工异种抗菌皮肤的制备方法技术领域
本发明涉及组织工程学生物材料技术领域，尤其是涉及一种以猪胸主动脉为原料制备人工异种抗菌皮肤的方法。
背景技术
皮肤是覆盖在人体表面具有高级组织结构的器官，具有保护人体、防止细菌侵蚀和感染，调节体温和排泄废液等作用，当皮肤受到创伤、烧伤或其他损害时，会导致组织体液的流失，从而导致人体水、电解质和酸碱平衡失调，影响人体正常吸收和代谢平衡。此外，暴露在空气的伤口极易感染细菌，严重时可导致休克或败血症。因此皮肤的修复必须解决。
理想的人工皮肤应当具备以下特点：(1)能够覆盖并封闭皮肤缺损创面、防止感染；(2)具有柔韧性和一定机械强度、移植后能与创面粘附良好，防止水分和体液从创面蒸发流失；(3)促进皮下血管生长，逐渐形成自体表皮层和真皮层结构；(4)移植存活率高、被受体永久接受并成活、最大程度的接近正常皮肤生理的愈合质量；(5)经济易得、安全不携带病原。
目前在临床中使用的皮肤修复材料可分为两大类：一类是天然皮肤，包括自体皮肤、同种异体皮和异种皮；另一类是人工皮肤，即用天然高分子(胶原、壳聚糖、透明质酸等)和合成高分子(硅橡胶、尼龙、涤纶等)合成的组织工程人工皮肤。天然皮肤虽有类似于受体皮肤的结构和功能，但存在供源不足、制备流程繁琐、免疫排异、创面收缩严重、病毒感染等问题；而人工皮肤虽然可大量供应，并且易保存、无传染疾病、无免疫排斥反应，但还存在各种弊端，如Intergra不如自体移植皮肤具有弹性和柔软度，而Biobrane可能抑制巨噬细胞的作用等。另外还有通过在人工皮肤材料上体外种植成纤维细胞和角质细胞，并培养形成具有真皮和表皮结构的组织工程化人工皮肤，例如Transcyte、Apligraf、OrCel等产品，与传统材料比较，移植组织工程化人工皮肤后，创面愈合率提高，愈合时间缩短，但治疗成本增加，产品制备繁琐耗时。此外，在伤口愈合过程中，常规伤口敷料无抗菌功效，极易在愈合过程中被外界细菌感染，导致伤口感染，愈合减缓。
我国作为养猪大户，除了日常可使用部分，目前除了猪皮作为胶原提取原料，小肠作为抗凝血活性药物肝素钠的提取原料外，其余成分均未得到完善的利用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种人工异种抗菌皮肤的制备方法。本发明不仅解决了工业废弃物处理的问题，而且解决了制备人工皮肤的来源问题。
本发明的技术方案如下：
一种人工异种抗菌皮肤的制备方法，包括如下步骤：
(1)取检疫合格的猪，无菌开腔，取胸主动脉，用医用生理盐水漂洗干净后，钝性分离制得厚度为0.3～0.5mm的血管内膜，再用医用生理盐水清洗，制得猪胸主动脉血管内膜；
(2)将步骤(1)所得的猪胸主动脉血管内膜置于1M的氯化钠溶液中，并在37℃恒温摇床中以100～150r/min的转速震荡，每间隔6h超声波震荡5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(3)将步骤(2)得到的猪胸主动脉血管内膜置于溶度为10mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液中，并在37℃恒温摇床中以100～150r/min的转速震荡，每间隔6h超声波震荡5min，12～24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(4)将步骤(3)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为2.5mg/mL的胰酶溶液中，并在37℃恒温摇床中以100～150r/min的转速震荡，每间隔6h超声波震荡5min，6～24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(5)将步骤(4)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为100～150μg/mL的纳米银溶液中，于室温下浸泡24h后30℃自然风干；
(6)将步骤(5)制得的产品，根据临床需要裁剪，真空包装，电子束辐射灭菌后在2～10℃环境下保存，即得本发明人工异种抗菌皮肤。
步骤(1)中所述猪的月龄大于5个月。
步骤(1)～步骤(4)中所述溶液中的溶剂均为超纯水。
步骤(5)中纳米银溶液的熔剂为医用生理盐水，纳米银平均粒径为5～50nm。
步骤(1)～步骤(5)中所述医用生理盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠溶液。
所述超声波震荡过程中超声的频率为40KHz。
本发明有益的技术效果在于：
(1)本发明彻底去除猪胸主动脉的内皮细胞层和平滑肌细胞，使血管内膜成为自体皮生长支架。
(2)本发明通过SDS溶液清洗和胰蛋白酶清洗步骤去除内膜层中内皮细胞和平滑肌细胞层，降低了免疫原性。
(3)本发明通过纳米银溶液浸泡，大幅度提升了成品的抗菌活性，增长了成品存放时间。
(4)本发明相比较环氧乙炔、钴60等灭菌方式，电子束辐射灭菌后产品无对人体有害的化学物质或辐射残余，保证了成品对人体的无危害作用。
(5)本发明完整的保留细胞外基质，成纤维细胞和角质细胞可迅速成长，形成真皮层和表皮层，从而避免因真皮层缺损而导致瘢痕形成过重；同时与创面粘附紧密，且含有大量促血管生成物质，因此可大幅加快皮肤新生血管的生长速度，缩短愈合时间。
(6)本发明制备过程简单，成品形态完整，保液率、机械强度均可满足使用要求，创面收缩率低；无需用戊二醛等有毒试剂交联提高强度，无需用保湿剂增加成品的湿润性，与已有的人工皮肤相比较，使用化学药品少，降低了使用时的化学毒性。
(7)本发明人工皮肤胶原结构完整，利于成纤维细胞和角质细胞的生长，适用于皮肤缺损或烧伤，使用安全可靠、无毒，避免疾病传播。
(8)本发明人工皮肤原料来源丰富、生产周期短、保存时间长、并且价格低廉，有可应用于临床使用的巨大潜能。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
一种人工异种皮肤的制备方法，包括以下步骤：
(1)取12月龄检疫合格的猪，无菌开腔，取胸主动脉，用医用生理盐水漂洗干净后，钝性分离制得厚度为0.3～0.5mm血管内膜，用医用生理盐水清洗后制得猪胸主动脉血管内膜；
(2)将步骤(1)所得的猪胸主动脉血管内膜置于1M的氯化钠水溶液中，并在37℃恒温摇床中以100r/min的转速震荡，每间隔6h超声波震荡(频率为40KHz)5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(3)将步骤(2)得到的猪胸主动脉血管内膜置于溶度为10mg/mL的十二烷基硫酸钠水溶液中，并在37℃恒温摇床中以100r/min的转速震荡，每间隔6h超声波震荡(频率为40KHz)5min，12h后用医用生理盐水漂洗干净；
(4)将步骤(3)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为2.5mg/mL的胰酶溶液中，并在37℃恒温摇床中以100r/min的转速震荡，每间隔6h超声波震荡(频率为40KHz)5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；
((5)将步骤(4)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为100μg/mL的纳米银溶液中，于室温下浸泡24h后30℃自然风干；
(6)将步骤(5)制得的产品，根据临床需要裁剪，真空包装，电子束辐射灭菌后在2～10℃环境下保存，即得本发明人工异种皮肤。
步骤(1)中所述猪的月龄大于5个月。
步骤(1)～步骤(4)中所述溶液中的溶剂均为超纯水。
步骤(5)中纳米银溶液的熔剂为医用生理盐水，纳米银平均粒径为50nm。
步骤(1)～步骤(5)中所述医用生理盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠溶液。
所述超声波震荡过程中超声的频率为40KHz。
实施例2
一种人工异种皮肤的制备方法，包括以下步骤：
(1)取18月龄检疫合格的猪，无菌开腔，取胸主动脉，用医用生理盐水漂洗干净后，钝性分离制得厚度为0.3～0.5mm血管内膜，用医用生理盐水清洗后制得猪胸主动脉血管内膜；
(2)将步骤(1)所得的猪胸主动脉血管内膜置于1M的氯化钠水溶液中，并在37℃恒温摇床中以150r/min的转速震荡，每间隔6h超声波震荡(频率为40KHz)5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(3)将步骤(2)得到的猪胸主动脉血管内膜置于溶度为10mg/mL的十二烷基硫酸钠水溶液中，并在37℃恒温摇床中以150r/min的转速震荡，每间隔6h超声波震荡(频率为40KHz)5min，18h后用医用生理盐水漂洗干净；
(4)将步骤(3)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为2.5mg/mL的胰酶溶液中，并在37℃恒温摇床中以150r/min的转速震荡，每间隔6h超声波震荡(频率为40KHz)5min，6h后用医用生理盐水漂洗干净；
((5)将步骤(4)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为150μg/mL的纳米银溶液中，于室温下浸泡24h后30℃自然风干；
(6)将步骤(5)制得的产品，根据临床需要裁剪，真空包装，电子束辐射灭菌后在2～10℃环境下保存，即得本发明人工异种皮肤。
步骤(1)中所述猪的月龄大于5个月。
步骤(1)～步骤(4)中所述溶液中的溶剂均为超纯水。
步骤(5)中纳米银溶液的熔剂为医用生理盐水，纳米银平均粒径为50nm。
步骤(1)～步骤(5)中所述医用生理盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠溶液。
所述超声波震荡过程中超声的频率为40KHz。
实施例3
一种人工异种皮肤的制备方法，包括以下步骤：
(1)取24月龄检疫合格的猪，无菌开腔，取胸主动脉，用医用生理盐水漂洗干净后，钝性分离制得厚度为0.3～0.5mm血管内膜，用医用生理盐水清洗后制得猪胸主动脉血管内膜；
(2)将步骤(1)所得的猪胸主动脉血管内膜置于1M的氯化钠水溶液中，并在37℃恒温摇床中以120r/min的转速震荡，每间隔6h超声波震荡(频率为40KHz)5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(3)将步骤(2)得到的猪胸主动脉血管内膜置于溶度为10mg/mL的十二烷基硫酸钠水溶液中，并在37℃恒温摇床中以120r/min的转速震荡，每间隔6h超声波震荡(频率为40KHz)5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(4)将步骤(3)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为2.5mg/mL的胰酶溶液中，并在37℃恒温摇床中以120r/min的转速震荡，每间隔6h超声波震荡(频率为40KHz)5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(5)将步骤(4)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为100的纳米银溶液中，于室温下浸泡24h后30℃自然风干；
(6)将步骤(5)制得的产品，根据临床需要裁剪，真空包装，电子束辐射灭菌后在2～10℃环境下保存，即得本发明人工异种皮肤。
步骤(1)中所述猪的月龄大于5个月。
步骤(1)～步骤(4)中所述溶液中的溶剂均为超纯水。
步骤(5)中纳米银溶液的熔剂为医用生理盐水，纳米银平均粒径为50nm。
步骤(1)～步骤(5)中所述医用生理盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠溶液。
所述超声波震荡过程中超声的频率为40KHz。
测试例1
将本发明实施例3得到的人工异种抗菌皮肤进行抗菌效果评价，实施例3中步骤(4)所得未浸泡纳米银溶液的猪胸主动脉血管内膜作为阴性对照组，以皮肤表面常见金黄色葡萄球菌为试验模型。
实验方法：取金黄色葡萄球菌菌种于肉汤培养基中复苏，在37℃恒温培养箱中以120r/min的转速震荡培养过夜。取生理盐水将细菌悬浮液稀释至600nm除吸光值为0.1左右后，均匀涂布于肉汤琼脂培养基上。取直径为1cm的实施例3所得人工异种抗菌皮肤和阴性对照组样品贴在带同一块菌琼脂培养基平板的两侧，于37℃恒温培养24h后，根据国标GB/T20944.1-2007测定抑菌圈大小，并结合测试样品底部是否有细菌生长的情况评价样品抗菌效果，平行测试5次。结果如表1所示，与未浸泡纳米银材料相比较，人工异种抗菌皮肤抗金黄色葡萄球菌效果显著。
表1抗金黄色葡萄球菌效果评价
测试例2
将本发明实施例2得到的人工异种抗菌皮肤进行抗菌效果评价，以实施例2中步骤(4)所得未浸泡纳米银溶液的猪胸主动脉血管内膜作为阴性对照组，以伤口感染较常见菌铜绿色假单胞菌为试验模型
实验方法：取铜绿色假单胞菌菌种于肉汤培养基中复苏，在37℃恒温培养箱中以120r/min的转速震荡培养过夜。取生理盐水将细菌悬浮液稀释至600nm除吸光值为0.1左右后，均匀涂布于肉汤琼脂培养基上。取直径为1cm的实施例2所得人工异种抗菌皮肤和阴性对照组样品贴在带同一块菌琼脂培养基平板的两侧，于37℃恒温培养24h后，根据国标GB/T20944.1-2007测定抑菌圈大小，并结合测试样品底部是否有细菌生长的情况评价样品抗菌效果，平行测试5次。结果如表2所示，与未浸泡纳米银材料相比较，人工异种抗菌皮肤抗铜绿色假单胞菌效果显著。
表2抗铜绿色假单胞菌效果
测试例3
将本发明实施例2得到的人工异种抗菌皮肤进行SD大鼠皮肤缺损模型的移植实验，以实施例2中步骤(4)所得未浸泡纳米银溶液的猪胸主动脉血管内膜作为阴性对照组，医用纱布作为空白对照组。
实验方法：将15只同龄、同体型的健康SD大鼠麻醉固定，无菌条件下剔除背部毛发后，用手术剪刀剪开皮肤至粘膜层，造成直径为1cm的伤口缺损模型；随机分成三组后，其中一组大鼠随机敷上与伤口大小相同的实施例2制得的人工异种抗菌皮肤，一组用与伤口大小相同的阴性对照组材料敷在伤口表面，剩余一组用医用纱布包扎伤口。固定包扎后，正常饮食，观察伤口愈合情况，记录伤口愈合时间。结果见表3所示，与医用纱布相比较，人工异种抗菌皮肤和阴性对照组止血速度快，与伤口粘合紧密，不易脱落，可显著吸收伤口渗出液，显著促进伤口愈合；与阴性对照组相比较，人工异种抗菌皮肤炎症反应时间短，伤口无明显感染现象。说明本发明可显著促进伤口愈合，并有显著的抗菌效果。
表3伤口愈合