一种治疗鸡白痢的药物及其制法与检测方法及用途技术领域
本发明涉及兽药领域，具体涉及一种咸虾花与桑白皮的活性药物及其制备方法。
背景技术
鸡白痢属卵传性疾病，种鸡群中一旦有被感染病例，就会通过种蛋的方式进行带菌传染。在孵化过程中，造成胚胎死亡，孵化鸡仔出现弱雏、病雏。同时，在鸡群中又可被相互感染，给养鸡业带来极大的经济损失。此病传染源为带菌鸡和病鸡，主要通过消化道被感染。此病临床较为多见，不分年龄阶段均可被感染，但以褐羽产褐壳蛋的鸡种易感性最高，白羽产白壳蛋的鸡种抵抗力稍强，但不注意本病的防治同样造成较大损失。鸡白痢中成鸡白痢和雏鸡白痢是最为常见的病患，雏鸡白痢是造成雏鸡死亡、育雏成活率低的主要疾病之一，成鸡白痢是造成产蛋率不高和成年鸡死淘增加的主要原因之一。除此之外，鸡白痢病在发生特点上又有了新的变化，即青年鸡也可以发生白痢，所造成的损失比雏鸡白痢和成鸡白痢大，这点已逐渐被人们所重视。因此可以说鸡白痢不仅威胁着每批鸡，而且该病造成的危害贯穿了整个养鸡周期。
随着家禽产业化、规模化发展，细菌性疾病越来越常见。此病临床用药治疗中，西药占据着相当比例。但是，在临床治疗中，如果长时间使用某一抗生素类药物，将使菌病株体耐药性大增，某种条件下可诱发再次感染。在临床治疗中，如果长时间使用某一抗生素类药物，将使菌病株体耐药性大增，某种条件下可诱发再次感染。鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起的常见性、多发性疾病，这种疾病即可经过卵垂直感染，也可经水平感染。此病以雏鸡为易感群体，发病率和死亡率都比较高。长期以来，鸡白痢被看作是重点防控疫病，并在较长一段时间内被控制。但是，某些规模化养殖场鸡白痢感染率仍然很高，有的阳性检出率已经高达10％～70％，这严重影响蛋鸡产蛋率。而中药治疗此病，致病菌不易产生耐药性，并且毒副作用比较小，无残留。近些年来，诊治此病已尝试中药治疗，疗效明显。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种组方合理、疗效好的治疗鸡白痢的药物。
本发明的另一目的是提供该药物的制备方法。
本发明还提供了该药物的质量检测方法。
本发明还提供了该药物的制药用途。
本发明药物具有清热解毒、除湿止痢、扶正祛邪、活血祛瘀等功能，用于治疗禽各种湿热、赤白痢、湿热痢等大有裨益。
在本发明药物中原料药的基源如下：
桑白皮为桑科桑属植物桑MorusalbaL.的干燥根皮。
咸虾花为菊科斑鸠菊属的植物咸虾花Vernoniapatula(Dryand.)Merr.[ConyzapatulaDryand.]的全草。
本发明的目的是由以下方式实现的：
一种药物是由以下重量份的原料制成的：桑白皮1～2重量份，咸虾花1～2重量份。
该药物优选是由以下重量份的原料制成的：桑白皮1重量份，咸虾花2重量份。
该药物优选是由以下重量份的原料制成的：桑白皮2重量份，咸虾花1重量份。
该药物优选是由以下重量份的原料制成的：桑白皮1重量份，咸虾花1重量份。
所述的药物中可以制备成散剂、颗粒剂。
所述的药物采用如下方法制备：取桑白皮、咸虾花，混合，加入3～15倍量的水浸泡0.5～2小时，煎煮0.5～2小时，煎煮2～4次，每次0.5～2小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，制成散剂，即得。
所述的药物采用如下方法制备：取干燥的桑白皮、咸虾花，第一次加11倍量水浸泡1小时，煎煮1小时，第二次加4倍量水煎煮1小时，合并水煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀，制成散剂，即得。
所述的药物采用如下方法检测：采用高效液相色谱法进行羟白毛茛碱的含量测定：
（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为20～40：60～80的乙腈-1%冰醋酸溶液；检测波长：190～210nm；柱温：15～25℃；流速：0.5～1.5mL·min-1；进样量：5～20μL；
（2）对照品溶液制备：精密称取干燥至恒重的羟白毛茛碱对照品适量，加甲醇溶解制成对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取本发明药物，加甲醇，加热回流，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各5～20μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
所述的药物优选采用如下方法检测：采用高效液相色谱法进行羟白毛茛碱的含量测定：
（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-1%冰醋酸溶液；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；
（2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的羟白毛茛碱对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取本发明药物10g，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
所述的药物可用于制备治疗鸡白痢、湿热痢的药物。
实验一：本发明药物治疗鸡白痢的试验
1发病情况
2014年8月，江苏省连云港市某养鸡场饲养的1000只白羽肉鸡于5日龄开始发病，且发病情况较为严重，发病率达80％。
临床症状：病雏表现精神委顿、垂头缩颈，绒毛松乱，两翼下垂，缩颈闭眼昏睡，不愿走动，拥挤在一起；食欲下降，排便次数多，出现腹泻症状，排稀薄如糨糊状粪便，肛门周同绒毛被粪便污染而影响排便，病雏排粪时因疼痛而发生尖叫声；有的病锥呼吸困难，伸颈张口；有的可见关节肿大，行走不便，跛行；有的出现眼盲。
病理变化：最急性病例的表现是突然死亡而没有病变。急性病例可见卵黄吸收不全，卵黄囊的内容物变成淡黄色并呈奶油样或干酪样黏稠物；心包增厚，心脏上常可见灰白色坏死小点或小结节；肝脏肿大，并可见点状出血或灰白色针尖状的灶性坏死点；胆囊扩张充满胆汁；脾脏肿大，质地脆弱；肺可见坏死或灰白色结节；肾充血或贫血，输尿管显著膨大，有时在肾小管中有尿酸盐沉积。
2诊断
根据鸡群中此病发生特点以及病死鸡的主要病理变化，可确诊此病为白痢。进一步借助全血平板凝集反应，可确诊此病的禽白痢。
3诊疗实验
3.1实验分类
筛选被感染病例180只，将其均匀分为6组，每组均匀30只。前1～3组分别按照低剂量、中剂量、高剂量用药治疗；第4组，取常备药氟苯尼考，药用浓度为10％，常规治疗用药，作为对照组；第5组，为检疫阳性，不给药治疗；第6组，为检疫阴性，不给药治疗。待到15日龄时，除了第6组之外，其余各组经胸肌接种菌液0.3mL/只，接种后持续拌料给药5d，详细记录每组病死率、痊愈率等等情况。具体分组及用药情况参照如下表1-1：
表1-1分组及用药情况
3.2实验用药
本发明药物：处方：桑白皮50g，咸虾花50g；制备方法：取干燥的桑白皮50g、咸虾花50g第一次加1100mL水浸泡1小时，煎煮1小时，第二次加400mL，煎煮1小时，合并水煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，得本发明药物。
对比药物A：处方：桑白皮100g；制备方法：取干燥的桑白皮100g，第一次加1100mL水浸泡1小时，煎煮1小时，第二次加400mL，煎煮1小时，合并水煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，得对比药物A。
对比药物B：处方：咸虾花100g；制备方法：取干燥的咸虾花100g，第一次加1100mL水浸泡1小时，煎煮1小时，第二次加400mL，煎煮1小时，合并水煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，得对比药物B。
氟苯尼考，生产企业：河南健恒动物药业有限公司，批准文号：兽药字（2010）162062110。
3.3疗效判定标准
治愈率标准：用药后临床症状消失，精神状态、饮食等等均恢复正常为痊愈。分组中痊愈数占每组鸡只比例为治愈率。
显效率标准：用药后临床症状明显减轻，精神状态、饮食等等均恢复到发病前为有效。分组中有效鸡数和痊愈数总和相加占每组鸡只比例为显效率。
无效率标准：用药后临床症状不减，或者是病死数增加，剖检见明显病变组织变化者可判为治愈无效。分组中无效鸡数占每组鸡只比例为无效率。
3.4数据统计及处理
所有统计数据，经过SPSS10.0软件汇总处理，同时经过t检验和卡方检疫进行数据分析，处理结果做最后疗效分析。
3.5结果分析
3.5.1数据汇总
经过一段时间治疗之后，将具体治愈情况做汇总，见表1-2。
表1-2康复情况
3.5.2结果分析
早期感染病例，鸡只表现出精神沉郁、羽毛松乱、两翼垂下、头颈缩卧、闭眼昏睡、不愿走动、呆立掉队，时有白色稀便排出，食欲废绝，饮欲降低。在经过一段时间治疗后，尤其是使用本发明药物治愈一段时间后，病患鸡的精神、食欲、呼吸等等明显有所好转。通过数据统计可以看出：使用对比药物A，治愈数19只，死亡数8只，总有效率73.3％；使用对比药物B，治愈数18只，死亡数8只，总有效率73.3％；使用本发明药物，治愈数24只，死亡数2只，总有效率93.3％；10％浓度氟苯尼考，治愈数20只，死亡数5只，总有效率83.3％。阳性不予治疗，治愈数2只，死亡数26只，总有效率13.3％。通过实验比较，可以看出本发明药物用于鸡白痢治疗效果显著，有效率在93％以上。与对比药物A组、对比药物B组、10％浓度氟苯尼考组相比，存在显著的差异性(P<0.01)。
4结论
从治疗效果来看，本发明药物用于治疗鸡白痢疾有着很好的康复效果。而且，通过对比实验，本发明药物治疗总体效果要优于氟苯尼考、对比药物A组和对比药物B组。在这5d的连续用药中，第3d感染鸡群病情基本得到控制，死亡数锐减，起到了很好预控此病的效果。使用本发明药物预控此病，致病菌不易产生耐药性，并且毒副作用比较小，无残留。
实验二：本发明药物的质量检测方法研究
1仪器与试药
1.1仪器
高效液相色谱仪（Agilent110高效液相色谱仪及工作站，G1311Aquat泵，G1314紫外检测器）。
1.2试药
羟白毛茛碱（hydroxyhydrastine）对照品（中国药品生物制品检定研究院）；本发明中药组合物；中药材（康济连锁药店提供）；甲醇（色谱醇，上海生化工助剂厂）；其他试剂为分析纯。
2方法与结果
2.1处方
桑白皮500g，咸虾花500g。
2.2制备
取干燥的桑白皮500g，咸虾花500g，第一次加11000mL水浸泡1小时，煎煮1小时，第二次加4000mL，煎煮1小时，合并水煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，即得。
2.3羟白毛茛碱（hydroxyhydrastine）的含量测定
2.3.1HPLC色谱条件
采用HypersilDs（4.0mm×125mm，5μm）色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-1%冰醋酸溶液；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；在该色谱条件下，对照品及样品色谱峰良好，无咸虾花阴性对照对测定无干扰。
2.3.2对照品溶液的制备
精密称取80℃干燥至恒重的羟白毛茛碱对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液。
2.3.3供试品溶液与阴性对照液的制备
精密称取本发明药物10g，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液即得；另按处方比例制备不含咸虾花的阴性对照品，同法制成阴性对照液。
2.3.4标准曲线的绘制
精密称取80℃干燥至恒重的羟白毛茛碱对照品适量，用甲醇制成10.4，20.8，41.6，83.2，166.4μgmL-1系列浓度的溶液，分别精密量取上述5种浓度溶液各10μL，注入高效液相色谱仪进行测定。
以峰面积比值与浓度进行线性回归，得回归方程为：A=21.2763C-0.1391，r=0.9999。表明羟白毛茛碱在10.4～166.4μgmL-1浓度范围内呈良好的线性关系。
2.3.5稳定性试验
精密吸取供试品溶液10μL，分别于0，1，2，4，8h进样，并计算羟白毛茛碱含量。结果8h内RSD为0.45%（n=5）。表明样品溶液在8h内稳定。
2.3.6重复性试验
按供试品溶液制备方法平行处理样品5份，依法测定羟白毛茛碱含量并计算。结果测得羟白毛茛碱平均含量为0.13mg·g-1，RSD为1.3%。
2.3.7精密度实验
精密吸取羟白毛茛碱对照品溶液，重复进样5次，依法测定峰面积。结果RSD为0.22%（n=5）。表明精密度较好。
2.3.8回收率实验
精密称取已知羟白毛茛碱含量的同一批号的样品6份，按高、中、低浓度分别精密加入适量的羟白毛茛碱对照品溶液，按样品测定项下操作，依法测定，计算回收率。结果平均回收率为100.2%，RSD为0.44%（n=5）。
2.3.9样品含量测定
分别量取对照品溶液和供试品溶液适量，用微孔滤膜滤过，各进样10μL，按上述色谱条件测定3批样品，平行测定5次。按外标法以峰面积计算供试品溶液羟白毛茛碱的含量。本品含羟白毛茛碱应为标示含量的96%～104%，以每1g样品含羟白毛茛碱计，不得少于0.13mg。3批样品含量分别为100.1%（RSD=1.1%），101.2%（RSD=1.2%），99.8%（RSD=1.0%）。
具体实施方式：
实施例1，一种治疗鸡白痢的药物，该药物是由以下重量份的原料制成的：桑白皮2重量份，咸虾花1重量份。
实施例2，一种治疗鸡白痢的药物，该药物是由以下重量份的原料制成的：桑白皮1重量份，咸虾花2重量份。
实施例3.一种治疗鸡白痢的药物，该药物是由以下重量份的原料制成的：桑白皮1重量份，咸虾花1重量份。
实施例4.一种治疗鸡白痢的药物，该药物是由以下重量份的原料制成的：桑白皮1.5重量份，咸虾花1重量份。
实施例5，实施例1～4中任意一项所述的药物，该药物可以采用常规方法制备成散剂、颗粒剂。
实施例6.实施例1～4中任意一项所述的药，该药物采用如下方法制备：取桑白皮、咸虾花，混合，加入3～15倍量的水浸泡0.5～2小时，煎煮0.5～2小时，煎煮2～4次，每次0.5～2小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，制成散剂，即得。
实施例7.实施例1～4中任意一项所述的药，该药物采用如下方法制备：取干燥的桑白皮、咸虾花，第一次加11倍量水浸泡1小时，煎煮1小时，第二次加4倍量水煎煮1小时，合并水煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀，制成散剂，即得。
实施例8，实施例6或7所述的药物，该药物采用如下方法检测：采用高效液相色谱法进行羟白毛茛碱的含量测定：
（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为20～40：60～80的乙腈-1%冰醋酸溶液；检测波长：190～210nm；柱温：15～25℃；流速：0.5～1.5mL·min-1；进样量：5～20μL；
（2）对照品溶液制备：精密称取干燥至恒重的羟白毛茛碱对照品适量，加甲醇溶解制成对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取本发明药物，加甲醇，加热回流，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各5～20μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
实施例9，实施例6或7所述的药物，该药物采用如下方法检测：采用高效液相色谱法进行羟白毛茛碱的含量测定：
（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-1%冰醋酸溶液；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；
（2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的羟白毛茛碱对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取本发明药物10g，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
实施例10：一种治疗鸡白痢的药物
处方：桑白皮50g，咸虾花50g
制备方法：取干燥的桑白皮50g、咸虾花50g第一次加1100mL水浸泡1小时，煎煮1小时，第二次加400mL，煎煮1小时，合并水煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，得本发明药物。
实施例11：一种治疗鸡白痢的药物，其剂型为硬胶囊剂
药物处方：桑白皮500g，咸虾花500g
制备方法：取干燥的桑白皮500g，咸虾花500g，第一次加11000mL水浸泡1小时，煎煮1小时，第二次加4000mL，煎煮1小时，合并水煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，制成散剂，制成1000g。
采用高效液相色谱法对羟白毛茛碱（hydroxyhydrastine）进行含量测定：
（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-1%冰醋酸溶液；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；
（2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的羟白毛茛碱对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取本发明药物10g，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测，检测结果为羟白毛茛碱的含量为0.1637mg/g。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。