增强干细胞治疗潜能的组合物和方法技术领域
本发明涉及干细胞组合物和方法。
发明背景
干细胞疗法是骨髓、皮肤、心脏、角膜移植、移植物抗宿主病、肝肾衰竭、
肺损伤、类风湿性关节炎、自身免疫病例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬
化、狼疮和糖尿病治疗；心血管医药、神经性疾病和同种异体移植物排斥预防中的
理想方法。
可从不同组织，例如骨髓、骨骼肌、牙髓、骨骼、脐带和脂肪组织分离间充
质干细胞(MSC)和/或祖细胞或前体细胞。作为再生药物中治疗方法的可能来源，
MSC正引起越来越高的兴趣。干细胞能自我更新并能分化成特定细胞类型，或能
治疗性地用于促进组织再生的可溶性因子的产生和分泌。具体说，大量自体移植来
源的成年干/祖细胞比起胚胎干细胞(ES)类型来说，在其大量可获得性、低肿瘤生
成性和能避免与ES细胞有关的伦理争议上都更有优势。
为了实现有效修复或再生缺陷或患病器官和组织的能力，供体干/祖细胞应当
具有理想的治疗性能，例如最小化的副作用，能整合入宿主组织，分化成所需的细
胞系，旁分泌效果，调节组织重建和激活内源性修复/再生机制。
MSC已被用于许多啮齿动物、家兔、狒狒等的临床前研究，针对骨髓、皮肤、
心脏和角膜移植、移植物抗宿主病、肝肾衰竭、肺损伤、多发性硬化、类风湿性关
节炎、糖尿病和狼疮疾病。这些研究的一些早期结果已经引发了现在正进行中的人
类临床试验。这些试验涉及治疗自身免疫病，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发
性硬化和1型糖尿病；同种异体移植排斥的预防；和增强骨髓和肾移植的存活率；
以及顽固性移植物抗宿主病的治疗。
心血管疾病的患病和引起死亡的主要因素是冠状和/或外周血管系统中运输血
液的血管部分或完全堵塞的后果。当这些血管部分堵塞时，血液流动不足导致这些
血管供应的肌肉组织缺血，从而抑制肌肉收缩和/或其功能。血液流动完全堵塞导
致肌肉组织坏死。
外周动脉病(PAD)影响了八百万美国人。它是腿部动脉变窄的结果。PAD的
最常见症状是走路时疲劳、抽筋或疼痛。然而，一些PAD患者会丧失行走能力并
不得不截肢。
在一些患者个体中，血管阻塞部分由天然过程补偿，其中形成新血管(通常称
作“血管生成”的过程)以及小血管扩大(称为“动脉发生”)来代替受损血管的功能。
这些新血管能促使耗竭组织的血流恢复，从而形成围绕堵塞血管的“天然旁路”。
然而，一些血管生成受损的患者不能产生足够的旁系血管，以充分补偿心血
管疾病导致的血流减少。需要治疗缺血疾病的新治疗方法。
各种研究已经评估了MSC在临床前动物模型中的疗效，且显示了极大的临床
潜能。然而，仍然存在对于最佳MSC剂量，给药途径，和灌注后MSC细胞命运
的主要问题。
同样，非常需要优化的治疗性MSC组合物以及使用这些组合物的方法，以缓
解各种疾病症状，特别是血管疾病治疗。
Walker等，NatCommun.作者手记，2010年可得)一般公开了用非肌肉肌球蛋
白II(NMII)拮抗剂布雷他汀处理人多潜能干细胞(hPS)，例如人胚胎干细胞(hES)和
经诱导的多潜能干细胞(hiPS)能增强hPS细胞在克隆密度和悬浮条件下的存活。美
国公开号20100216181公开了用布雷他汀作为存活因子在无血清和饲养细胞的培
养基中培养多潜能干细胞。通过在旋转瓶或生物反应器内培养细胞来增加细胞数
量。公开的PCT申请WO2012062819公开了一种控制细胞与基材结合的方法，该
方法使用布雷他汀作为细胞与其通常没有亲和力或亲和力有限的基材的细胞黏着
的促进剂。
然而，这些文献都没有教导或提示当用含干细胞和非肌肉肌球蛋白II拮抗剂
治疗患者时观察到出乎意料的较好结果。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种治疗血管疾病的方法，包括向有需要的患者给予
有效量的含有一群细胞和非肌肉肌球蛋白II拮抗剂的组合物，从而治疗该血管疾
病。
在一个实施方式中，血管疾病是糖尿病的结果。在另一个实施方式中，血管
疾病是动脉粥样硬化的结果。在另一个实施方式中，血管疾病是外周血管疾病
(PVD)。在还有一个实施方式中，血管疾病是外周动脉疾病(PAD)。在还有一个实
施方式中，血管疾病与约或小于0.9的踝肱压力指数相关。在还有一个实施方式中，
血管疾病与约或小于0.7的踝肱压力指数相关。在还有另一个实施方式中，血管疾
病导致重症肢体缺血。在另一个实施方式中，血管疾病导致皮肤溃疡或坏疽。在另
一个实施方式中，组合物导致或增强血管生成。在还有另一个实施方式中，组合物
导致或增强血管生成，其与对照相比增加至少约20％。
在还有一个实施方式中，一群细胞的一部分包含多潜能细胞(pluripotentcell)。
在还有另一个实施方式中，多潜能细胞是经诱导的多潜能干细胞。在还有一个实施
方式中，一群细胞的一部分包含多能细胞(multipotentcell)。在还有另一个实施方式
中，多能细胞是多能间充质细胞或间充质干细胞。在还有另一个实施方式中，多能
细胞衍生自经诱导的多潜能干细胞。在还有其他实施方式中，该组合物包含药学上
可接受的运载体。
在另一个实施方式中，与同一未接受该组合物的患者相比，患者的肢体功能
增强了约或至少2-3级。在另一个实施方式中，患者的肢体血流提高到正常或未治
疗的肢体血流的约或至少65-85％。在另一个实施方式中，与同一未接受该组合物
的患者相比，患者的缺血损伤改善了约或至少2、3、或4级。在另一个实施方式
中，与同一未接受该组合物的患者相比，患者的缺血损伤以更快的速度(或以加速)
改善。
在还有一个实施方式中，静脉内给予组合物。在还有一个实施方式中，肌肉
内给予组合物。在另一个实施方式中，肌肉内或在缺血损伤位点附近给予组合物。
在还有另一个实施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂敲减非肌肉肌球蛋白II基因
和/或蛋白质表达。在还有另一个实施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是靶向敲
减非肌肉肌球蛋白II基因和/或蛋白质表达的siRNA。在另一个实施方式中，非肌
肉肌球蛋白II拮抗剂是靶向敲减非肌肉肌球蛋白II基因和/或蛋白质表达的编码
siRNA、miRNA或反义RNA的DNA载体。在其他实施方式中，非肌肉肌球蛋白
II拮抗剂是血管紧张素II受体拮抗剂或血管紧张素受体阻滞剂。在另一个实施方
式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂。在另一个实施
方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是2,3-丁二酮-2-一肟(BDM)。在还有一个实施
方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是布雷他汀或其类似物、衍生物或变体。在还
有一个实施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是吡咯烷酮衍生物。在还有一个实
施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是吡咯烷酮家族的分子。
本发明的还有一个方面涉及一种试剂盒，其包含：一群多能细胞；非肌肉肌
球蛋白II拮抗剂；药学上可接受的运载体；和可任选的，将这些物质给予适合用
干细胞疗法治疗的患者的说明书。在一个实施方式中，该疾病是心血管疾病。在另
一个实施方式中，该疾病是外周动脉疾病。
在一个实施方式中，细胞是MSC。在另一个实施方式中，非肌肉肌球蛋白II
拮抗剂是布雷他汀。在另一个实施方式中，心血管疾病是外周动脉疾病。在另一个
实施方式中，细胞是MSC，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是布雷他汀，且心血管疾病
是外周动脉疾病。在另一个实施方式中，试剂盒还包含心血管药。在另一个实施方
式中，试剂盒还含有支架。在另一个实施方式中，试剂盒还包含药物洗脱性支架。
在一个实施方式中，组成试剂盒的部件置于分隔的容器中。在另一个实施方式中，
一群多能细胞；非肌肉肌球蛋白II拮抗剂；和药学上可接受的运载体在同一容器
中，例如注射器或自动给药装置中。试剂盒可用于外周动脉疾病。试剂盒可含有
MSC细胞。非肌肉肌球蛋白II拮抗剂理想为布雷他汀，疾病为外周动脉疾病。试
剂盒还可包含心血管药，和/或支架，和/或药物洗脱性支架。各部件可在分隔的容
器中、同一容器中或在注射器中。
本发明的另一个方面涉及一种降低用包含MSC的组合物治疗的外周动脉病患
者中截肢率的方法，包括在治疗前使MSC接触非肌肉肌球蛋白II拮抗剂。在一个
实施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是布雷他汀。在另一个实施方式中，截肢
率降低了至少约20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,或90％或以上。
本发明的另一个方面涉及一种用于治疗适合用干细胞疗法治疗的疾病的干细
胞组合物，该组合物包含一群多能细胞；和非肌肉肌球蛋白II拮抗剂。在本发明
该方面的一个实施方式中，细胞是MSC。在另一个实施方式中，非肌肉肌球蛋白
II拮抗剂是布雷他汀。
本发明的另一个方面涉及一种制备用于治疗适合用干细胞疗法治疗的疾病的
干细胞组合物的方法，所述干细胞组合物包含一群多能细胞和非肌肉肌球蛋白II
拮抗剂，其中将一群多能细胞和NMII拮抗剂一起孵育一段时间，然后给予患者。
本发明的另一个方面涉及一种使适用干细胞疗法治疗的疾病加速治愈的方
法，包括使用含有一群多能细胞和非肌肉肌球蛋白II拮抗剂的组合物治疗患者，
其中该组合物与不含非肌肉肌球蛋白II拮抗剂的组合物相比导致疾病更快治愈。
在这些方面的一些实施方式中，细胞是MSC。在其他实施方式中，NMII拮
抗剂是布雷他汀。在还有其他实施方式中，疾病是心血管疾病。
附图说明
当考虑附图及相应详细描述时，可以更完整地理解本发明。附图所示实施方
式仅仅是举例说明发明，不应考虑为将发明限制于所示实施方式。
图1A-B显示了随时间血流(％)：对于所有有效动物计算各组中值。布雷他汀
(BB)加速和增强间充质干细胞移植引发的血流再生。与预先用布雷他汀处理但在不
存在布雷他汀的情况下移植的干细胞(1A，第5组，实心黑方块)相比，在布雷他汀
存在下给予的干细胞(1A，第4组，菱形)显示更快且增强的动物中血流再生。含有
布雷他汀的培养基对照(1A,第2组，圆形)显示少量的恢复效果，与MSC一样，
后者在稍后的时间点才获得了恢复(1A,第3组，三角形)。MSC的肌肉内给药显
示与静脉内施用相比持续较好的效果。数据显示单独的布雷他汀(BB)对血流再生没
有效果，但在与干细胞同时施用时，布雷他汀增强和/或支持MSC的再生潜能。
图2A-B显示了随时间的肢体功能(％)：对于所有有效动物计算各组中值。数
据显示与MSC共存的布雷他汀(BB)支持肢体功能的迅速改善。尽管在其他治疗组
中有血液灌注改善，治疗28天后观察到肢体功能恶化和肢体坏死有所增加。第3
组显示了动物间较广泛的分布和较高的截肢发生率。数据显示静脉内治疗(2B)某种
程度上效果较差，与局部肌肉内治疗方案相比导致更多的并发症(图2A)。在布雷
他汀存在下接受移植的MSC的小鼠(2A，第4组，空心方块)在移植后显示随时间
稳定和迅速的肢体功能改善。在用较低量的布雷他汀预处理的MSC治疗的小鼠中
检测到了相同趋势(2A,第5组，三角形)。相反，单独施用MSC直到第20天才显
示轻微改善，而且肢体功能在后来的时间点变差。培养基对照仅显示少量效果。注
意，负斜率表示肢体功能的改善。再一次，MSC的肌肉内给药(2A)持续显示优于
静脉内施用(2B)的效果。在布雷他汀存在下施用MSC胜过MSC的再生潜力。本
次施用显示再生潜力方面最快的改进。
图3A-B显示了缺血严重性评分(％)：对于所有有效动物计算各组中值。布雷
他汀与MSC一起施用阻止了缺血评分中的严重性。当肌肉内施用时，第4和第5
组随时间分析的缺血严重性评分持续显示更好的结果，而培养基对照分布在散点图
中。注意，对于肌肉内和静脉内施用，MSC(第3组)都显示评分中有较大变动，而
第5组仅静脉内施用有较大变动。再一次，MSC的肌肉内施用如图3A所示，静
脉内施用如图3B所示。
图4显示了血流(％)的盒形图斜率的分布，计算成从手术到第35天的血流(％)
的线性趋势。每只动物的单个数字表示其随时间在终点的变化。这些图提供了一种
在一张图上显示许多组的常规方法。例如，血流(％)的评价表示成各组的盒形图的
斜率，以描述肌肉内和静脉内给药的DMEM+BB在BMMSC研究中对照组和最佳
表现组之间的较低变化(表示为较小的盒尺寸)。
图5显示了布雷他汀阻止治愈过程中的严重并发症。临床前研究中的一个主
要问题是由于治疗相关失败(手术后14天后截肢)或与治疗无关的失败(例如麻醉中
死亡或手术后14天前截肢)导致的动物高淘汰率。仅有一些动物由于后一原因被从
统计分析中被排除。但是显示严重副作用(截肢)的动物还是被评级，其数据被输入
到统计分析中。数据清楚显示布雷他汀(第4组和第8组)显著提高了MSC的再生
潜能，而且由于严重并发症惊人的低发生率而引人注目。
发明详述
本文所述的是能够快速治愈和增强患病或受损组织再生，同时显著减少治愈
中并发症的MSC组合物和方法。具体说，本文公开了本发明的MSC组合物，其
在确认的动物模型中具有高再生潜能。具体说，发现布雷他汀强烈和出乎意料地加
速和增强MSC的治疗潜能，而且减少治愈过程中的严重并发症。
词语“一”或“一个”当与“包含”在权利要求和说明书中联用时，可表示
“一”，但也与“一个或多个”，“至少一个”和“一或多于一个”的意思一致。
在整篇申请中，术语“约”用于表示包括装置，用于测定数值的方法，或存
在于研究对象中的差异造成的包括固有误差的固有变动的值。通常术语表示视情况
而定包括大约或少于1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,
14％,15％,16％,17％,18％,19％或20％可变性。
在权利要求中使用术语“或”表示“和/或”，除非特别指出仅替代方式，或
替代方式互相排除，但公开内容支持仅指替代方式和“和/或”的定义。
如本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含”(和任何形式的“包含”，
例如含有和含)，“具有”(以及任何形式的“具有”，例如“有”和“拥有”)，“包
括”(以及任何形式的“包括”，例如“囊括”和“括入”)或“含有”(以及任何形
式的“含有”，例如“含入”和“包含”)都是纳入性或开放性的，并不排除额外
的未提到的元素或方法步骤。考虑本说明书中所讨论的任何实施方式可以用任何本
发明的方法或组合物实现，反之亦然。另外，本发明的组合物可用于实现本发明的
方法。
“治疗”、“处理”或“疗法”在本文中指对对象施用一种物质，以治愈、减
轻、缓解、治疗、预防或改善疾病、疾病症状、由疾病引发的疾病状态或发生疾病
的倾向。“有效量”是能在经治疗对象中产生如本文所定义的医学上理想结果的物质
量。医学上理想的结果可以是客观的(即通过测试或标记物可测量的)或主观的(即
治疗对象表示出迹象或感觉到效果)。
本文所述的“适合干细胞疗法治疗的疾病”表示能够通过施用干细胞治疗的任
何程序、病症、失调、微恙和/或疾病。这些疾病包括但不限于骨髓、皮肤、心脏
和角膜移植，移植物抗宿主病，肝肾衰竭，肺损伤，类风湿性关节炎，自身免疫病
的治疗(例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、狼疮和糖尿病)；神经疾病、
心血管疾病和同种异体移植排斥的预防；以及急性淋巴细胞白血病(ALL),急性髓
细胞性白血病(AML)，伯基特淋巴瘤，慢性髓细胞性白血病(CML),幼年型粒单核
细胞白血病(JMML)，非霍奇金氏淋巴瘤，霍奇金氏淋巴瘤，淋巴瘤样肉芽肿病,髓
发育不良综合症(MDS),慢性粒单核细胞白血病(CMML),骨髓衰竭综合征，低
巨核细胞性血小板减少症,自身免疫性嗜中性白血球减少症(重症),先天性红细
胞生成障碍性贫血,周期性中性白细胞减少,戴-布二氏贫血,伊文综合征,范科尼
贫血,血小板无力症,幼年型皮肌炎,Kostmann综合症,红细胞发育不全,施瓦赫
曼综合征,严重再生障碍性贫血,先天性铁粒幼红细胞性贫血,血小板减少并桡骨
缺乏(TAR综合征),先天性角化不良,血液疾病，镰刀形细胞贫血(血色素SS),
HbSC病,βo镰刀形贫血，α-重型地中海贫血(胎儿水肿),β-重型地中海贫血(库利
(氏)贫血),β-中间型地中海贫血,E-βo地中海贫血,E-β+地中海贫血,代谢疾病，
肾上腺脑白质失养病(婴儿),异染性脑白质病变,克拉伯病(球形细胞脑白质营养
不良),先天性红细胞生成性卟啉病,赫曼斯基-普德拉克综合征,赫尔利综合征,
胡-射二氏综合征,亨特综合征,圣菲利波综合征,马-兰二氏综合征,II型、III型粘
多糖症，α甘露糖苷贮积症,A型或B型尼曼-匹克综合征,桑德霍夫综合征,泰-萨
克斯病,巴藤病(遗传样神经元腊样脂褐质症),高原酸血症,免疫缺陷病,运动失
调性毛细血管扩张症,慢性肉芽肿性疾病,迪格奥尔格综合征,IKK-γ缺陷,免疫失
调性多内分泌病变,II型X-连锁粘多糖贮积症,先天性骨髓粒细胞缺乏症X-连锁免
疫缺陷,重症联合免疫缺陷,腺苷脱胺酶缺陷,威斯科特-奥尔德里奇综合征,X-连
锁血中丙球蛋白贫乏,X-连锁淋巴(细胞)增生症，Omenn综合征，网状结构不良，
胸腺发育不全,白细胞粘附缺陷,其他骨硬化症,朗格汉斯细胞组织细胞增生症,
噬血细胞淋巴组织细胞增生症,急性和慢性肾病,阿尔茨海默氏病,抗衰老,关节
炎,哮喘,心脏干细胞治疗,脑梗塞(中风),脑瘫(中风),慢性阻塞性肺疾患
(COPD),充血性心力衰竭,糖尿病(I型和II型),纤维肌痛,免疫缺陷，缺血性心
脏病，狼疮，多发性硬化，心肌梗塞,骨关节炎,骨质疏松,帕金森氏病,外周动脉
疾病,类风湿性关节炎,整容手术中的干细胞治疗，创伤性大脑损伤和神经性疾病。
本文所指的“血管或心血管疾病”以临床事件，包括临床症状和临床体征为特
征。临床症状是患者报告的那些经历，其对医师显示为存在病变。临床体征是生理
或实验室检测获得的客观发现，其对医师显示为存在病变。“心血管疾病”同时包括
“冠状动脉疾病”和“外周血管疾病”，两个术语如下定义。心血管疾病的临床症
状包括胸痛，气短，虚弱，晕厥，意识发生变化，剧痛，阵发性夜间呼吸困难,短
暂脑缺血发作和患者经历的其他这样的现象。心血管疾病的临床体征包括以下发
现，例如EKG异常，外周脉搏改变，动脉杂音，心音异常，湿啰音和哮鸣音,颈
静脉扩张,神经改变和其他医师所注意到的其他这样的发现。临床症状和临床体征
可在心血管疾病中合并，例如心肌梗塞(MI)或中风(也被称为“脑血管事件”或
“CVA”)，这其中患者会报告某些现象(症状)，而临床医师会感知到其他现象(体
征)，都表示有潜在的病变。“心血管疾病”包括与脆性斑块疾病、闭塞性疾病和硬
化的心血管疾病相关的疾病。例如，脆性斑块病变引起的心血管疾病如下文所定义
的，可被称为“脆性斑块疾病”。与脆性斑块疾病有关的临床事件包括脆性斑块破
裂及后随的急性血栓形成或远端栓塞为特点的那些体征和症状。脆性斑块疾病的例
子包括某些中风和心肌梗塞。作为另一个例子，闭塞性病变导致的心血管疾病可被
称作“闭塞性疾病”。与闭塞性疾病相关的临床事件包括其中动脉的渐进式闭塞影
响到达目标组织的循环量的那些体征和症状。如果循环量不足以维持组织，渐进式
动脉闭塞可导致渐进式缺血，其最终可发展成组织死亡。闭塞性疾病的体征和症状
包括跛行、休息时疼痛、绞痛、坏疽，以及表示血管狭窄和减少的远端灌注的生理
和实验室发现。作为另一个实施例，再狭窄导致的心血管疾病可被称为支架内狭窄
病。支架内狭窄病包括动脉支架渐进性堵塞导致的体征和症状，该动脉支架是作为
经皮穿刺动脉成形术等方法的一部分放置的，支架的存在是为了帮助将血管保持在
新的扩张构型。伴随支架内狭窄病的临床事件是由于重建动脉再次狭窄引发的。
“冠状动脉病”指与服务于心脏的动脉堵塞有关的血管疾病。堵塞可能由于诸
如斑块破裂或栓塞的机制突然发生。堵塞可渐进发生，伴随由于肌内皮增生和斑块
形成导致的动脉变窄。服务于心脏的动脉堵塞导致的临床体征和症状是冠状动脉病
的表现。冠状动脉病的表现包括绞痛、缺血、心肌梗塞、心肌病、充血性心力衰竭、
心律失常和动脉瘤形成。应理解冠状循环中的脆性斑块病与动脉血栓形成或远端栓
塞形成有关，其自身也表现为心肌梗塞。应理解冠状循环内的闭塞性疾病与伴随有
心绞痛症状的动脉狭窄有关，后者常用药物干预和血管成形术治疗。
“外周血管病”或(“PVD”)是外周(即非冠状)动脉堵塞导致的心血管疾病。堵塞
可能由于诸如斑块破裂或栓塞的机制在脆性斑块病中突然发生的。堵塞可渐进发
生，伴随由于肌内皮增生和斑块形成导致的动脉变窄，如在闭塞性疾病中。堵塞可
以是完全的或部分的。外周动脉堵塞导致的那些临床体征和症状是外周血管病的表
现。外周血管病的表现包括但不限于跛行、缺血、肠绞痛、基于血管的肾机能不全、
瞬时缺血性发作、动脉瘤形成、外周栓塞形成和中风。缺血性脑血管病是一类外周
血管病。
当怀疑有PVD时，可测量踝肱压力指数(ABPI/ABI)。当踝内血压读数低于臂
内读数，可怀疑在从心脏至踝供血的动脉内有堵塞。约或小于0.9的ABI比与PVD
一致；约或低于0.8的ABI指示中度疾病，且约或低于0.5的比指示严重缺血疾病。
约或小于0.5或0.4的ABI比可用作诊断阈值。
血管壁变硬的疾病(例如慢性糖尿病发生时产生的钙化)通常(但不必然)会产
生由异常的高ABI(约或＞1.3)指示的假阴性。这些结果和怀疑有助于进一步调查和
更高水平的研究。如果ABI异常，下一步通常是下肢多普勒超声检查，来检视动
脉硬化的位置和程度。其他显像也可通过血管造影术进行，其中导管被插入股总动
脉，选择性引导到有问题的动脉。当注射辐射密度造影剂时，可拍摄X光片。可
识别出在X光片中发现的任何流动限制性狭窄，并用经皮腔内斑块旋切术、血管
成形术或支架放置来治疗。多层螺旋计算机化断层扫描(CT)扫描仪可提供动脉系统
的直接显像，作为血管造影术的一个替代。CT能促进动脉和下肢动脉的评估，而
不需要血管造影术中在动脉内注射造影剂。
外周动脉疾病(PAD)是外周血管疾病(PVD)的一种形式，其中对肢体，通常是
腿的血液供应被部分或完全阻断，引起组织中血流受损和缺氧。当PAD发展时，
其达到重症肢体缺血(CLI)的阶段，伴有皮肤溃疡、坏疽和可能不可避免的截肢。
已用肢体缺血动物模型来评估各种与干细胞移植有关的治疗方法。
目前的PAD护理标准包括戒烟，减少胆固醇，抗血小板剂，治疗糖尿病，治
疗高血压，ACE抑制剂，锻炼，和西洛他唑。其他治疗选择可涉及支架，例如药
物洗脱性支架。例如紫杉醇洗脱性支架。本文所述的方法和组合物都已考虑与这些
治疗选择一起提供。见例如，Burns等,BMJ.2003年3月15日；326(7389):584–588。
外周动脉疾病通常以Fontaine分期划分，其由ReneFontaine在1954年为缺血
建立：1)行走时轻度疼痛(跛行)，不完全血管闭塞；2)行走相对较短距离时严重疼
痛(间歇性跛行)，行走“大于150m，II-a阶段和小于150m，II-b阶段”引发的疼
痛；3)静息时疼痛(静息痛)，主要是在足部，当举起肢体时增加；4)生物组织丧失(坏
疽)和行走困难。本文所述的组合物和方法已考虑能改善外周动脉疾病，可在从开
始治疗至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、
36小时、数天、数周或数月内，与对照相比，提高约或至少1、2、3或4期的患
者的Fontaine分期。
或者，Rutherford的外周动脉病分类由六个阶段组成：1)轻度跛行；2)中度跛
行；3)严重跛行；4)静止时缺血疼痛；5)少量组织丧失；和6)大量组织丧失。本文所
述的组合物和方法已考虑能改善外周动脉疾病，可在从开始治疗至少或约1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36小时、数天、数周或数
月内，与对照相比，提高约或至少1、2、3、4、5或6期的患者的Rutherford分期。
在本发明的一个实施方式中，本文所要求的组合物导致血管生成或使其增强。
理想的，组合物导致或增强血管生成，其与对照相比至少增加20％。
在本发明的一个实施方式中，本文所要求的组合物包含药学上可接受的运载
体。
“肢体功能评估”在本文中指对本文所公开的方法和组合物的效力进行相对测
量。另外，肢体功能级别为：“0”代表蜷曲脚趾以抵抗轻柔扯动尾部，“1”代表脚
底蜷曲，“2”代表无拖动，但无脚底蜷曲，而“3”代表足拖动。本文所述的组
合物和方法已考虑可在从开始治疗至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、
30、31、32、33、34、35、36小时、数天、数周或数月内，与对照相比，将患者
的肢体功能提高至少1、2、3或4级。
“缺血性损伤评估”可用于评估各种与干细胞移植有关的治疗方法。在一个实
施方式中，可将缺血性损伤表示成形态学级别。各形态学级别为：“0”代表基本不
存在坏死，“1”代表坏死限于脚趾(脚趾丧失)，“2”代表坏死延伸至足背(足丧失)，
“3”代表坏死延伸至腿(膝丧失)，“4”代表坏死延伸至大腿(整条后肢丧失)。本
文所述的组合物和方法已考虑可在从开始治疗至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、31、32、33、34、35、36小时、数天、数周或数月内，与对照
相比，减少患者的缺血损伤至少1、2、3或4级。
“肢体血流评估”在本文中指对本文所公开的方法和组合物的效力进行额外的
相对测量。优选例如用非接触激光多普勒在治疗前后测量双侧腿的血流。本文所述
的组合物或方法考虑能在从治疗开始至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、
30、31、32、33、34、35、36小时、数天、数周或数月内，与对照相比，将患者
肢体血流改善到正常血液灌注水平的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、
31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、
50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、
68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、
86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或100％。
“在外周动脉疾病患者中减少截肢率”指由于感染或坏死，PAD患者需要截去
肢体、趾和/或组织的发生率。有能够方便确定的与MSC治疗相关的标准截肢率。
优选地，用包含MSC和NMII拮抗剂组合的组合物治疗患者能够相对于标准(例如
标准护理)或对照(例如单独的MSC治疗或NMII拮抗剂治疗，而不是组合)将截肢
率减少约或至少百分之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、
54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、
72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、
90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、100、125、150、175、200、
250、300、350、400、500或以上。
本文所述的“心血管病药物”指用于治疗糖尿病、高血压(例如ACE抑制剂)、
胆固醇(例如他汀)、和抗血小板药(例如阿司匹林、氯吡格雷)、抗凝血药(例如华法
林)、利尿剂和β-阻断剂。另外，西洛他唑或己酮可可碱是心血管糖尿病药物。
术语“血管生成”定义为从现存血管长出新血管的生理过程。血管新生是用
于自发血管形成的术语，而内填是通过从现存血管分枝形成新血管的术语。血管生
成是生长发育也是伤口愈合中的常规过程。它也是肿瘤从休眠状态转向恶性状态的
一个基础步骤。当在一个给定区域内，与相同组织在血管生成之前，或与标准(例
如标准护理)或对照(例如单独的MSC治疗或NMII拮抗剂治疗，而不是组合)相比，
存在约或至少百分之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、
54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、
72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、
90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、100、125、150、175、200、
250、300、350、400、500或以上的新血管生长增加，认为发生血管生成。
“加速愈合”指适合干细胞疗法的疾病响应本文所述组合物的治疗而加快显
示改善迹象的速度(相对于与所调查疾病有关的清楚界定的定性或定量形态学或功
能学量度)。优选治愈速度相对于对于标准(例如标准护理)或对照(例如MSC治疗或
NMII拮抗剂治疗单独，而不是组合)提高约或至少百分之2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、
46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、
64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、
82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、
99.5、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500或以上。
本文所用的“患者”指诊断或怀疑患有或发生心血管疾病的哺乳动物对象。示
范性的患者可以是人、猿、犬、猪、牛、猫、马、山羊、绵羊、啮齿动物和其他哺
乳动物，其可获益于干细胞治疗。
“给予”在本文中指向患者提供本发明的组合物。通过举例而不是限制，可通
过静脉内(i.v.)注射，皮下(s.c.)注射，皮内(i.d.)注射，腹膜内(i.p.)注射，或肌肉内(i.m.)
注射给予组合物。可采用一种或多种这样的途径。胃肠外施用可以是例如通过推注
或逐渐随时间灌注。或者或同时，可通过口服途径给药。另外，也可通过手术放置
大丸剂或细胞团块，或放置其中装载细胞的医疗装置例如支架来给药。优选的，在
缺血性心血管疾病的位点，例如缺血性心血管疾病损伤(例如血管狭窄/堵塞，坏死
组织或坏疽感染位点)处或附近(例如距离约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50毫米远)给予本
发明的组合物。给药可以是在或靠近疾病相关损伤位点的静脉内、肌肉内，和/或
在或靠近缺血性损伤位点的肌肉内。
本文所述的“有需要的患者”指诊断出或怀疑有心血管疾病的患者。在一个实
施方式中，患者患有或可能发生外周动脉疾病。
本文所述的“全能性”指一个细胞分化和/或产生一个生物体中所有分化后细
胞(包括胚胎外组织)的能力。全能性细胞包括芽孢和受精卵。在一些生物体内，
细胞能分化并保持全能性。
“多潜能”在本文中指能分化成三胚层中任一的潜能：内胚层(例如内部胃内
壁、胃肠道、肺)、中胚层(例如肌肉、骨、血液、泌尿生殖系统)或外胚层(例
如表皮组织和神经系统)。
“多潜能干细胞”包括天然多能干细胞和诱导的多潜能干细胞。它们可形成任
何胎儿或成人细胞类型。然而，它们单独并不能发育成胎儿或成年生物体，因为缺
乏生成胚胎外组织(例如胎盘)的能力。
“诱导性多潜能干细胞”或(“iPS细胞”)与天然多潜能干细胞，例如胚胎干
细胞(ES)在许多方面类似，例如表达一些干细胞基因和/或蛋白，染色质甲基化模
式，倍增时间，胚状体形成，畸胎瘤形成，存活的嵌合体形成以及潜能和可分化性。
诱导性多潜能干细胞可从例如成体胃、肝、皮肤细胞和血细胞中衍生。iPS细胞可
通过将某些干细胞相关基因转染到非多潜能细胞，例如成体成纤维细胞中来衍生。
在一些实施方式中，可通过病毒载体，例如逆转录病毒等实现转染。转染的基因可
包括但不限于主要转录调节因子Oct-3/4(Pou5f1)和Sox2Oct-4，Nanog和Lin28
转基因。转染细胞的亚群能开始变得与多潜能干细胞形态和生化上类似，可通过形
态选择、倍增时间或通过报道基因和抗生素筛选分离。
本文所述的“多能性”指多能祖细胞，其具有产生多种细胞类型，但谱系数比
起多潜能干细胞来说更有限。例如，多能干细胞是造血细胞，其能发育成多种血细
胞，但不能发育成脑细胞或其他类型的细胞。
本文所述的“间充质干细胞或多能基质细胞(在此都称作MSC)”是能够分化
成多种细胞类型的多能基质细胞，细胞类型包括但不限于:成骨细胞(骨细胞)，软骨
细胞(软骨细胞)和脂肪细胞(脂肪细胞)。
在一个实施方式中，间充质干细胞获自骨髓。在另一个实施方式中，通过培
育下颌第三臼齿的牙髓获得间充质干细胞。在另一个实施方式中，MSC获自羊水。
在另一个实施方式中，可从脐带组织，例如从华顿氏胶质和脐带血获得MSC。在
另一个实施方式中，从脂肪组织分离MSC。另外，也可从华顿氏胶质分离MSC。
在另一个实施方式中，从iPS细胞衍生MSC，如Guiliani等在“Humanmesenchymal
stemcellsderivedfrominducedpluripotentstemcellsdownregulateNKcellcytolytic
machinery(衍生自诱导型多潜能干细胞的人间充质干细胞下调NK细胞裂解机制)”
Blood,2011年7月29日中所述。
MSC优选具有小细胞体，其中一些细胞是细长的。细胞体可包含大的圆核，
具有明显的核仁，其被精细分散的染色质颗粒包围，给核提供了清晰的外观。细胞
体的剩余部分包含少量高尔基体，粗面内质网，线粒体和多核糖体。细长的MSC
广泛分布，邻近的胞外基质有一些内质网碎片，但并不存在其他类型的胶原碎片。
细胞附着不是均一过程，而是出现在特定的区域，即所谓黏着斑区域。一旦
附着，细胞通过内部马达蛋白产生张力。从而，细胞骨架变得有序且在多种过程中
行使功能，包括运输、支架和细胞存活。细胞脱落后，这些随着马达蛋白建立的内
部张力变化而快速收缩，而先前有序的内部结构(细胞骨架和其它)则受到扰乱。若
无法再附着至表面，这类细胞则会启动称为附着依赖性凋亡/失巢凋亡的细胞死亡
程序。
“肌球蛋白”包括一类ATP依赖性马达蛋白，通常由于其在肌肉收缩中的作用
及其对广泛的其他真核移动过程的参与为人熟知。它们一般负责基于肌动蛋白的移
动。通常肌球蛋白II(也称为传统肌球蛋白)是负责在肌肉细胞中产生肌肉收缩的肌
球蛋白类型。
负责产生细胞张力的主要细胞骨架马达蛋白是非肌肉型肌球蛋白II(称为肌球
蛋白II)。“非肌肉肌球蛋白II”或“NMII”是肌动蛋白结合蛋白，其能够交联肌动
蛋白并具有收缩性质，部分通过其轻链和重链的磷酸化调节。与肌肉肌球蛋白II
一样，NMII也具有下面三对肽：两条230kDa的重链，两条调节NMII活性的20kDa
的调节性轻链(RLC)，和两条稳定重链结构的17kDa必要轻链(ELC)。虽然这些肌
球蛋白在本文中称作“非肌肉”肌球蛋白II，以与其肌肉的相应蛋白分开，但它们
也存在于肌肉细胞中，此时它们在骨骼肌发育和分化过程中具有不同功能，还能维
持平滑肌中的张力。
通常三种哺乳动物NMII同种型具有重叠和独特的性质。NMII的两个球形头
部包含同时针对ATP和肌动蛋白的结合位点，然后是颈部，其各自与两种功能上
不同的轻链结合。颈部结构域作为杠杆臂放大头部旋转，从而将ATP的化学能转
化成肌球蛋白头部的机械运动。该颈部结构域后是长α-螺旋卷曲，形成延伸的杆状
结构域，其能够影响重链间二聚化，并终止于相对较短的非螺旋尾部。NMII的杆
状结构域自我结合，形成双极纤丝(肌球蛋白分子的反平行阵列)，其比在心脏和骨
骼肌中发现的小。
NMII的作用是整合驱动细胞迁移和附着的过程。其也是许多信号传递途径汇
合的一个重要终点，所述传递主要通过RhoGRP酶。NMII本身在不同水平上受
到严格调节，包括折叠，肌球蛋白纤丝装配和拆卸，肌动蛋白结合以及ATP酶和
马达活性。NMII对肌动蛋白细胞骨骼的调节控制多种相关过程，例如迁移，细胞
-细胞和细胞-基质附着，细胞分化，组织形态发生和发育。通过在不同细胞和组织
中的亚细胞定位和激活其调节性激酶对NMII进行时空调节对于控制NMII功能
而言是重要的。
调节NMII的Mg2+-ATP水解和纤丝形成涉及可逆磷酸化存在于20kDaRLC
对和重链对中的特定氨基酸。ELC对的功能是稳定NMHC，没有证据其经历可逆
磷酸化。另见Vicente-Manzanares等，NatRevMolCellBiol.2009年11月；10(11):
778–790。
“非肌肉肌球蛋白II拮抗剂”指直接或间接抑制、阻断或逆转肌球蛋白II天然
发生或在患有心血管疾病的患者患病或受损的组织内活性的试剂。这些试剂可以是
小分子(例如布雷他汀)；核酸包括rRNA,mRNA,tRNA,miRNA,siRNA(见例如Ma
等,Mol.Biol.CellNovember15,2010卷2122号3952-3962或Kim等,JBiol
Chem.2012年8月10日；287(33):27345-58),反义RNA,DNA,RNA/DNA杂交体，
核酶、PNA,适体(其中全部或任一可包含合成或非天然核苷酸碱基)；肽；或蛋白质，
例如抗体、抗体片段、抗体样分子或单链抗体，以及磷酸酶和激酶。例如，NMII
拮抗剂可以是siRNA，其靶向敲减编码NMII的mRNA或与NMII上调有关的基
因的mRNA的表达；或编码该siRNA的载体。
优选的，NMII拮抗剂包括血管紧张素II1型受体拮抗剂(例如非肽AT1受体
拮抗剂FK-739，见Fuji等,Hypertension,1999；33:975-980)以及血管紧张素II受体
拮抗剂，也称作血管紧张素受体阻断剂(ARBs),AT1-受体拮抗剂或沙坦(sartans)，
是一类调节肾素-血管紧张素-醛固酮系统的药物。其主要用途是治疗高血压，糖尿
病肾病(糖尿病引起的肾脏损伤)和充血性心脏衰竭。洛沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、
坎地沙坦和缬沙坦包括四唑基团(具有四个氮和一个碳的环)。洛沙坦、厄贝沙坦、
奥美沙坦、坎地沙坦和替米沙坦包含一个或两个咪唑基团。
非肌肉肌球蛋白II拮抗剂还包括ACE抑制剂。ACE抑制剂(或血管紧张素转
化酶抑制剂)是主要用于治疗高血压和弱心脏肌肉(充血性心力衰竭)的医疗药物。示
范性的ACE抑制剂包括卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、
培哚普利(perinodopril)、赖诺普利、贝那普利、咪达普利、佐芬普利、群多普利、
福辛普利、酪激肽(casokinins)和乳激肽(lactokinins),而且前生命期的瑞士乳杆菌
(Lactobacillushelveticus)产生或衍生自酪蛋白的乳三肽Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro也
显示具有ACE抑制性和抗高血压功能。
非肌肉肌球蛋白II拮抗剂也包括2,3-丁二酮-2-一肟(BDM)和肌球蛋白II腺苷
三磷酸酶(ATP酶)活性的抑制剂。
一种NMII拮抗剂是布雷他汀(1-苯基-1-2-吡咯烷酮衍生物)，是一种骨骼肌和
非肌肉肌球蛋白II腺苷三磷酸酶(ATP酶)活性的特异性药物学拮抗剂。布雷他汀是
能抑制细胞出泡的高度活跃的小分子。该化合物可透过细胞，良性，并且重要的是
容易可逆。已公开其作为干细胞培养中的存活因子。也公开它是细胞附着于通常不
具有或具有很低的亲和力的基质的促进剂(WO2012062819)，例如用于包覆移植药
物装置，例如起搏器、臀或骨骼移植物或支架。
布雷他汀如下所示：
在一些实施方式中，术语“布雷他汀”包括旋光混合物。在一些实施方式中，
术语布雷他汀指R-布雷他汀。在一些实施方式中，术语布雷他汀指S-布雷他汀。
本文包括布雷他汀变体、类似物和衍生物。其他适合和考虑用于本文的布雷
他汀变体、类似物和衍生物以及非肌肉肌球蛋白II拮抗剂如美国公开号
20080021035公开。另见例如：Straight等,Science299(5613):1743–47；Kovács等,
(2004年8月),JBiolChem.279(34):35557–63；Limouze等,(2004)JMuscleResCell
Motil.25(4–5):337–41。
在一些实施方式中，本文公开的治疗组合物包含或关联于至少一个非肌肉肌
球蛋白II拮抗剂，其中至少一个非肌肉肌球蛋白II拮抗剂各自以单剂存在，其浓
度为约、至少或高于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、
43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、
62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、
80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、
98或99各乘以10-9、10-8、10-7、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1摩尔/剂。
优选非肌肉肌球蛋白II拮抗剂存在于单剂中，浓度在约1-100、2-60、3-50、4-40、
5-30、6-20、7-15、8-10、2-18、3-16、4-14、5-12、6-10或7-8μM之间。
在一些实施方式中，本文所述的治疗组合物以约或至少或高于1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24
次/日、周或月的剂量在大约、至少或长于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24天、周或月的时间内给
予。
在一些实施方式中，NMII拮抗剂与组合物的细胞一起孵育约、至少或高于
0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、
48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、
66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、
84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99分钟、小
时或天，然后给予患者。
一些实施方式涉及含有细胞和NMII拮抗剂的试剂盒。一些试剂盒包含(a)含
有至少一种NMII拮抗剂的容器和(b)含有干细胞的容器。NMII可以是溶液或冻干
形式。试剂盒可任选的包含说明书，用于(i)溶剂的使用或(ii)冻干配方的重建和/或
使用；或(iii)用内容物治疗心血管疾病。试剂盒还可包含一或多种(iii)缓冲剂，(iv)
稀释剂，(v)滤器，(vi)针，(v)注射器，或(vi)自动化医疗装置。在一个实施方式中，
容器选自：瓶、小瓶、注射器、试管或多用途容器。在另一个实施方式中，目标肽
组合物是冻干的。
本文所述的疗组合物单剂可含有至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、
48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、
66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、
84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98，99或100各
乘以1、10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010或更多个细胞/公斤患
者体重。在一些实施方式中，一个剂量包含约、至少或高于1-20、2-19、3-18、4-17、
5-16、6-15、7-14、8-13、9-12或10-11各乘以106个干细胞。
在一些实施方式中，在发明组合物中添加NMII拮抗剂能够允许临床医师给
予患者与不添加时用不含NMII拮抗剂的一群干细胞实现同样疗效所需剂量相比
更低剂量的干细胞。在一些实施方式中，在发明组合物中添加NMII拮抗剂让临床
医师能够对患者提供与不添加时在一段确定时间内实现相同疗效所需剂量相比更
少的干细胞，每剂量减少至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、
60、65、70、75、80、90％或以上。
本文公开了治疗心血管疾病的方法和组合物；减少使用MSC治疗心血管疾病
时并发症的方法。另外，公开了包含细胞，NMII拮抗剂，药学上可接受的运载体
和可任选的合适说明书的试剂盒。
本发明还涉及一种降低用包含MSC的组合物治疗的外周动脉病患者截肢率的
方法，包括在治疗前使MSC接触非肌肉肌球蛋白II拮抗剂。理想的，非肌肉肌球
蛋白II拮抗剂是布雷他汀。
在一些实施方式中，治疗方法一般可涉及在CVD例如PAD造成的损伤位点
处或附近肌肉内注射一定剂量的用NMII拮抗剂，例如布雷他汀处理过的MSC组
合物。这样的注射通常导致肢体功能、血流和缺血性症状改善。另外，在组合物中
使用NMII拮抗剂，例如布雷他汀显著加速受损组织的MSC触发的再生。另外，
施用MSC和布雷他汀剧烈减少与PAD和/或对患有PAD的患者移植MSC有关的
并发症。
这些方法和试剂盒还可包括其他心血管药物，或医疗装置，例如支架(可以是
或不是药物洗脱性的)。在另一个实施方式中，这样的支架可装载MSC，其在移植
前或过程中与NMII拮抗剂接触。
其他文献：
Armstrong,L.,Lako,M.,Buckley,N.,Lappin,T.R.J.,Murphy,M.J.,Nolta,J.a,
Pittenger,M.,等(2012).社论:最近30年来我们在干细胞生物学上的10大进展。
Stemcells(Dayton,Ohio),30(1),2-9.doi:10.1002/stem.1007
RenG,ChenX,DongF,LiW,RenX,ZhangY,ShiY:简短回顾：间充质干细胞
和翻译药物：出现的问题。StemCellsTranslMed.2012年1月；1(1):51-8.综述。
MasuzawaK,JesminS,MaedaS,KajiY,OshikaT,ZaediS,ShimojoN,YajiN,
MiyauchiT,GotoK.通过结膜下注射内皮缩血管肽-1的视网膜缺血-再关注损伤的
大鼠模型。ExpBiolMed(Maywood).2006年6月；231(6):1085-9.
StraightAF,CheungA,LimouzeJ,ChenI,WestwoodNJ,SellersJR,Mitchison
TJ.通过肌球蛋白II抑制剂对细胞动力学的时空控制的解析，Science.2003年3月
14日；299(5613):1743-7。
WalkerA,SuH,ContiMA,HarbN,AdelsteinRS,SatoN.非肌肉肌球蛋白II调
节多潜能干细胞的存活阈值。NatCommun.2010年9月7日；1:71。
Daigh,Christine；Fuhrken,Peter；Salvagiotto,Giorgia:干细胞分化的方法和组合
物。US20100216181A1,美国专利申请，2010
Schenk,Judith；vandenBos,Christian；Rosenbaum,Claudia；Nie,Ying:控制细胞
与基质结合的方法2012WO2012062819,专利申请
CaiL,JohnstoneBH,CookTG,LiangZ,TraktuevD,CornettaK,IngramDA,
RosenED,MarchKL..干细胞生长因子生产的抑制损害脂肪衍生的干细胞促进缺血
组织再血管化的能力。StemCells.2007年12月；25(12):3234-43.Epub2007年9月
27日
GotoT.,FukuyamaN.,AkuA.,KanabuchiK.,KimuraK.,TairaH.,TanakaE.,,
WakanaN.,MoriH.,和InoueH..对在小鼠中建立稳定后肢缺血的合适的实验方法
的研究。TokaiJExpClinMed.,卷.31，第3期，第128-132页,2006
良好的实验室实践的OECD原则ENV/MC/CHEM(98)17.
StabileE.,BurnettM.S.,WatkinsC.,KinnairdT,BachisA.,laSalaA.,Miller
J.M.,ShouM.,EpsteinS.E.,FuchsS.在CD4敲除小鼠中对急性后肢缺血受损的动
脉生成反应。Circulation，2003；15；108(2):205-210
实施例
实施例1-实验建立
本文公开的是在后肢外周缺血的小鼠模型中测试BMMSC。外周动脉疾病
(PAD)是外周血管疾病(PVD)的一种形式，其中对肢体，通常是腿的血液供应被部
分或完全阻断，引起组织中血液流动受损和缺氧。当PAD发展，其达到重症肢体
缺血(CLI)的阶段，伴有皮肤溃疡、坏疽和不可避免的截肢。糖尿病血管并发症最
有希望的创新治疗之一是基于干细胞的产品，其增强血管生成(TRef1-3)。已用后
肢缺血动物模型来评估各种致力于干细胞移植的治疗方法。
根据国立卫生研究院(NIH)和实验动物评估和认证委员会(AAALAC)处理动
物。将动物养在尺寸为42.5×265.6×18.5cm，具有不锈钢顶架，以及丸状食物投
喂设施和装在玻璃状透明的聚碳酸酯瓶内的饮用水和寝具的聚砜(PSU)笼内(每笼
7-8只)：用蒸汽消毒的清洁稻壳(Harlan,Sani-chip,批号#:106S8216)，寝具材料和
笼子一起至少一周换两次。用市售啮齿动物饲料(TekladCertifiedGlobal18％
ProteinDiet批次#:106S8216)自由投喂动物。动物可自由接触来自城市供水系统的
高压灭菌和酸化的饮用水(pH在2.5-3.5之间)。动物被安置在标准实验室条件下，
配有空调并提供充足的经过滤(HEPA6/6)新鲜空气供应(最少每小时空气交换15
次)。动物置于温度受控的环境下。温度范围是20–24℃，且RH范围是30-70％，
12小时光照/避光循环。物种/品系：小鼠/无胸腺裸鼠；性别/数量/年龄：雄性/152/9-10
周龄；来源:哈伦实验室，以色列；体重：在研究初始(第1天)平均体重为28.4g。
组中最小和最大重量在组平均重量的±20％范围内；驯化期：5-10天；命名：三处
耳部打孔，以及笼卡。未发现动物处于濒死状态，或显示有严重疼痛或具有严重压
力的状态。手术日在该研究中被定为“第0日”。在手术日，用1.5-3.0％异氟烷、
1.5％N2O和0.5％O2进行麻醉。
测试项目：人骨髓间充质干细胞(隆萨科隆有限公司)。载体：DMEM+10％
FCS,可任选:10μM布雷他汀(BB)。
在麻醉状态下，将小鼠背侧向上放置。在腹股沟的皮肤上切开0.5-1.0cm的
切口。用6-0号丝线结缝合股动脉两次，在缝线之间切断。用4-0丝线闭合创口，
让小鼠恢复。
在第1天，手术后24小时，每只动物在肌肉内的两个位点(手术创口的近端和
远端侧)注射，或在尾静脉内静脉内注射。对于肌肉内注射，动物在每个位点注射
50μl，每只动物共注射100μl。对于静脉内注射，每只动物注射200μl。分组见表1。
表1：分组
在研究日-1，手术前和之后每周测量体重。
血液流动测量：用非接触激光多普勒在术前和手术后1、3、7、14、21、28
和35日测量两侧腿中的血流。血流测量值表示成缺血肢体与正常肢体之间流动的
比例(Goto等，TokaiJExpClinMed.,31卷，第3期，第128-132,2006)。一致地，
在用MSC_BB处理的第4组动物中显示最佳再生(图1)。
缺血严重性的宏观评估：手术后每周一次，用坏死区域的形态学级别来进行
缺血肢体的宏观评估(Goto等):参见表2。
表2坏死区域的形态学级别
级别
描述
0
不存在坏死
1
坏死限于脚趾(脚趾丧失)
2
坏死延伸至足背(足丧失)
3
坏死延伸至腿(膝丧失)
4
坏死延伸至大腿(整条后肢丧失)
体内评估肢体功能和缺血损伤。用以下评分表在术后一周一次对缺血肢体
的受损运用进行半定量评估(Stabile等,Circulation.2003；15；108(2):205-210).参见表
3。
表3肢体功能的评估
级别
描述
0
蜷曲脚趾以抵抗轻柔扯动尾部
1
脚底蜷曲
2
无拖动，但无脚底蜷曲
3
足拖动
在部分或完全肢体截肢的情况下，肢体功能定级为“不适用”。此时，在统
计学分析中不包括血流测量值。
肢体功能的体内评估。用分级功能性评分表在第7到35日进行缺血肢体的受
损运用的半定量评估。自第14日起，在用细胞治疗的第4组动物中，相对于用第
1和2组对照动物发现了改善的肢体功能(图2A)。在缺血后第35日，在第3和5
组动物中发现了这种改善。在静脉内给予测试物的动物中，在第9组中相对于对照
组6和7从第28日起发现了肢体功能改善(图2B)。
实施例2-统计学分析
该研究的目的是测试受测干细胞作为缓解动物裸鼠模型中HLI症状的可能
性。
研究终点为：临床评分；体重测量；血流测量
定级分析：对于首先测试的3个终点(％血流、肢体功能和缺血严重性评分)，
对各组给予1-10中的一个级别。级别＝1最高，级别＝10最低。当两组接近时，都
被指定为同样的级别“在中间”，例如如果两组的级别都为4，就都被指定为评分
4.5(其乘以2是级别4和5的和)。对于每个终点，对每组计算中间值(用中间值确
保极端数值不影响结果)。对每个终点，用中值分拣组，每组分别定级。用所有的
终点，计算各组的平均级别。
用的混合模型进行统计学测试。提供的主要比较是在两个最有效的治疗
和所有其他之间。Maincomparisonspresentedarebetweenthetwomosteffective
treatmentsandalltheothers.本文提供了完整的统计学测试。在报告和附录内提供的
P值未经多重性调整。为了确定显著性，使用P<0.0056。根据对有意义和无意义
的测试的解读，在此有许多方法来调整多重测试。由于这是一个探索性尝试，决定
在每组内单独考虑调整。因此例如，第4组与其他9组比较，因此我们确定显著性
结果是P<0.05/9＝0.0056。
斜率：计算得到的斜率是从手术到第35日的线性趋势。对于每只动物的单个
数字表示其在随时间在终点上的变化。在每个终点(除了体重)，用盒形图提供各组
的斜率分布。这些图提供了在一张图表表现许多组的便利方法。它们应如下解读：
25％的数据点(在我们的例子内，斜率)在下方的铰链(hinge)和盒底部之间-百分
位0-25；50％的数据点位于盒与盒顶部之间-百分位25-75。这也被称为“四分位
间范围”(IQR)。25％的数据点位于盒顶部到上方铰链之间-百分位75-100。然而，
上方和下方栅栏(fence)限定为从盒底部和顶部开始1.5*IQR的距离。虽然并不
在图中显示，但这些栅栏外的值被认为是异常值。因此，如果有数据点在上方栅栏
上方，或低于下方栅栏，它们会单独在盒形图中标出；换言之，极端点不被包括在
盒形图的下方和上方铰链之间。
表4动物处置
1.由于以下原因从所有其他分析中排除：
(a)在手术后14天前或时截肢-由于模型失败。
(b)与治疗无关的死亡。
2.由于在14天后，即从第21天起截肢因此估算-由于治疗失败。
3.完成35天的随访。
在进一步分析中，用以下方法处理缺失数据的估算：血流(％):手术后的第一个
测量值(假设治疗失败，因此相对于手术后立刻观察到的结果没有改善)；缺血严重
性评分：4＝“完全后肢丧失”(最坏的可能评分)；肢体功能：3＝“足拖动”(最坏的可
能评分)；重量(g):在任何时间点(最高至且包括截肢日)测量动物的最低重量。
虽然进行了配对比较，中心结果表示成统计学相关的方式，并在图中清楚标
出。数据在各终点和不同分析中都是一致的。为了获得这张图，我们没有考虑重量
描述性统计和测试指出，重量并不是该模型中一个有意义的效果量度。每组在第
35日对剩余3个终点进行评级，并评估各组的平均级别-综合所有终点结果的量度
在第35日同时评估所有参数。步骤：对于每个参数(血流(％)、肢体功能和缺
血严重性评分)，计算每组所有动物的中值。所有组基于它们的中值，对以下参数
从1-10评级，其中1最佳：血流(％)-最高为1，最低为10；肢体功能-最高为10，
最低为1(最坏类别为3，最佳为0)；缺血严重性评分-最高为10，最低为1(最坏类
别为4，最佳为0)；最后我们根据这三个参数计算各组的平均级别。
表5在第35日对处理组的评级，估算数据
使用每个处理组的中值
*因子-与最高级别组(4)的平均级别差异
**因子2-相邻评级的组之间的差异
从表格可见，评级有4个一般的量级:
组4(BM.MSC在DMEM+BB中(肌肉内))具有最高级别，且与第2最有效
组(5)差距甚大：平均级别＝1.2,而与下一组的差距为2。
组5远在组4之后(如上文粗体所示)，但也远在其后各组之上。具体说，它
比第3最有效组(9)高1.2个级别。
接下去的7组(9、3、2、7、6、1和8)为第3类，最佳和最差之间差2.5(6.8-4.3),
与第1和第3位之间的距离(3.1)相比也要小很多。
组10(BM.MSC在DMEM中，BB预处理(静脉内))比起上面的粗体“7个组
的方阵”也要差3个级别。注意到组10因为大量的截肢而特别无效，因此第35
日估算的数值无效。
在表6中，显示了显著性测试的结果。最佳两组与所有其他组比较所有终点。
表6组4和5相对于所有其他的配对比较，估算数据
注：下划线表示P值小于0.05
血管生成受损是缺血性疾病的特征之一。然而，尝试缓解缺血的临床尝试令
人失望，意味着需要新的分子和治疗靶标来治疗缺血性疾病。干细胞疗法是心血管
疾病中理想的方法。为了评估干细胞对缺血组织的治疗活性，使用了小鼠后肢缺血
模型。
本文中，MSC在动物小鼠模型中显示再生潜能，而单用布雷他汀没有有益效
果。这验证了该模型。
在这些实验中，对缺血肢体单次静脉内或局部给予测试细胞，惊人和出乎意
料地将血液灌注恢复到了达其正常值的65-84％。血流恢复与其他在小鼠后肢缺血
模型中显示肢体功能改善以及缺血严重性减少和延迟的结果一致。在用测试细胞局
部(组4和5)或静脉内(组9)处理的组中都实现了该效果。
布雷他汀急剧加速了受损组织MSC引发的再生。施用布雷他汀和MSC显著
减少了治愈过程中的严重并发症，如组4(BM.MSC在DMEM+BB中(肌肉内))所示，
它与所有组相比在％血流和肢体功能上都更有效，包括组5(BM.MSC在DMEM
中，用BB预处理(肌肉内))。另外，布雷他汀通过减少治愈中的严重并发症，显
著提高MSC的再生潜能。
组4(BM.MSC在DMEM+BB中(肌肉内))与所有组相比在％血流和肢体功能
上都更有效，包括组5(BM.MSC在DMEM中，用BB预处理(肌肉内))。
本文所示结果显示，肌肉内使用时，在布雷他汀存在下施用BM.MSC提供最
强的效力。这种组合施用显示损伤的最快速恢复，导致最有效的治疗。最佳组中相
对较小的变动显示各动物之间效力的一致性。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明领
域普通技术人员通常所理解的同样含义。尽管可以任何组合物、方法、试剂盒和手
段来传播与本文所述的类似或等价的信息，来实施本发明，本发明描述了优选的组
合物、方法、试剂盒和传播信息的手段。
本文所引用的所有文献以法律允许的最大程度引入以供参考。这些文献的讨
论内容仅仅是为了总结其作者的主张。并不承认任何文献(或任何文献的一部分)是
相关现有技术。申请人保留攻击任何引用文献的准确性和相关性的权利。