耐热人纤维蛋白原的生产方法.pdf

本发明涉及人纤维蛋白原，具体为一种耐热人纤维蛋白原的生产方法。其特点是：包装本发明的优点是：经分离、提纯，并经S/D法和干热法二步病毒灭活制成；第一步、新鲜分离的液体血浆或冰冻血浆，均可用于生产；第二步、分离后无菌的血浆，在血浆在0～4℃下离心去除冷沉淀；第三步、8％-10％乙醇反应：去冷沉淀血浆用醋酸缓冲液调pH至6.8～7.2，加50％-55％乙醇至反应液最终浓度为8％-10％，反应液温度至-1-3℃；第四步、离心得沉淀，用10-15倍沉淀量的溶解液搅拌至溶解。本发明优点是：纯度≥95％、杂质少、在临床应用时负反应发生率低，用药更安全。

权利要求书
1.  一种耐热人纤维蛋白原的生产方法，其特征在于：经分离、提纯，并经S/D法和干热法二步病毒灭活制成；
第一步、新鲜分离的液体血浆或冰冻血浆，均可用于生产；
第二步、分离后无菌的血浆，血浆在0～4℃下离心去除冷沉淀；
第三步、8％-10％乙醇反应：去冷沉淀血浆用醋酸缓冲液调pH至6.8～7.2，加50％-55％乙醇至反应液最终浓度为8％-10％，反应液温度至-1～-3℃；    
第四步、离心得沉淀，将该沉淀用10-15倍沉淀量的溶解液搅拌至溶解；
第五步、S/D法灭活病毒处理：在搅拌下加入含有11％吐温-80、3.3％磷酸三丁酯的S/D浓液，使最终蛋白液中含吐温-80为1％、磷酸三丁酯为0.3％，24～26℃缓慢搅拌保温6小时；
第六步、8％-10％乙醇第一次纯化反应：将上步处理结束的蛋白液降温至0-2℃，加50％--55％乙醇使最终乙醇浓度为8％-10％，温度降至-1～+1℃；
第七步、离心得沉淀，将该沉淀用10-15倍沉淀量溶解液搅拌溶解；
第八步、8％-10％乙醇第二次纯化反应：将上步溶解蛋白液降温至0-2℃，加50％-55％乙醇使最终乙醇浓度为8％-10％，温度降至-1～+1℃；
第九步、离心得沉淀，将该沉淀用溶解液搅拌至溶解，调pH为6.8～7.2，蛋白浓度在2～3％；
第十步、用无石棉的介质澄清及除菌过滤；
第十一步、原液检定
按照中国药典方法检定；
第十二步、半成品配制
按成品规格配制，加4％-6％蔗糖做稳定剂；
第十三步、半成品检定
按照中国药典方法检定；
第十四步、分装及冻干
应符合“中国药典生物制品分装和冻干规程”规定，分装后的制品经外观检查合格后立即冻结，冻干过程中制品温度是-40℃～+35℃，真空封口；
第十五步、干热病毒灭活
冻干制品检真空后放在98-100℃水浴中加热30分钟；
第十六步、成品检验
按中国药典的方法检验；
第十七步、包装。

2.  根据权利要求1所述的一种耐热人纤维蛋白原的生产方法，其特征在于：第四步、第七步、第九步所述的溶解液是含有0.9％氯化钠+1.2％柠檬酸钠+0.27％三羟甲基氨基甲烷的水溶液构成。

说明书耐热人纤维蛋白原的生产方法
技术领域:本发明涉及人纤维蛋白原，具体为一种耐热人纤维蛋白原的生产方法。
背景技术:“人纤维蛋白原”这一药物作为一种临床上治疗大出血等症的急救药品，在国内已经生产多年，包括哈尔滨世亨公司、上海莱士、江西博雅等三家公司都在生产，但是原来这三家的工艺中都有一个共同的缺点:在病毒灭活工艺中只对脂包膜病毒效果好，对非脂包膜病毒的效果不好，(即不完全的病毒灭活)，这在理论上就存在潜在的病毒传播的可能性，所以国家2005版药典就要求在该产品的生产工艺中要有对脂包膜病毒和非脂包膜病毒都有效果的工艺方法，原有的生产工艺和生产文号同时废止，因此国内各家生产和研发单位都以新标准要求进行新的工艺开发，对于脂包膜病毒S/D法病毒灭活是一种较好的方法，各家均采用，而对于非脂包膜病毒，公认比较好的灭活方法是干热灭活方法，但是由于产品纯度不高(杂质含量多)，保护剂选择不合适及生产工艺条件的差异，在经过干热灭活后产品均出现了缩坨、外观变色、溶解困难及溶解后有大量变性蛋白析出等问题，成为该产品工艺开发的主要特点。
目前，国内有了4家单位工艺开发较早，主要开发重点一个是工艺条件的选择上，一个是在保护剂的选择上，但他们主要存在的问题是，一方面，纯度不高(一般≤80％以下)杂质较多，杂质较多的缺点就是这些杂质导致在临床应用时副反应发生率较高，用药安全性差。另一方面其他厂家多采用一种或两种氨基酸作保护剂，氨基酸作保护剂一个主要缺点就是，大量使用氨基酸时，会引起病人体内的酸碱代谢失衡，及对肝肾功能不全者的用药禁忌，造成临床用药的不方便，目前在新的药典标准下还没有重新被批准上市的产品。
二、国际同类产品的生产研发情况
目前，在国际上血液制品的生产研发主要集中在欧洲、美国、日本等发达国家，“人纤维蛋白原”作为一种血液制品，同样存在着理论上的病毒传播的危险性，目前这种工艺产品已经停止销售，而新研发上市的产品多采用色谱层析的方法进行生产，此方法的生产成本比传统方法高出3-4倍，对于发达国家来说是可以承受的而对于像我国这样发展中国家则是不适用的，如韩国绿十字，美国百特等。
发明内容:本发明的目的在提供一种纯度≥95％、杂质少、在临床应用时负反应发生率低，用药更安全的耐热人纤维蛋白原的生产方法。本发明的目的是这样实现的：经分离、提纯，并经S/D法和干热法二步病毒灭活制成；
第一步、新鲜分离的液体血浆或冰冻血浆，均可用于生产；
第二步、分离后无菌的血浆，血浆在0～4℃下离心去除冷沉淀；
第三步、8％-10％乙醇反应：去冷沉淀血浆用醋酸缓冲液调pH至6.8～7.2，加50％-55％乙醇至反应液最终浓度为8％-10％，反应液温度至-1～-3℃；
第四步、离心得沉淀，将该沉淀用10-15倍沉淀量的溶解液搅拌至溶解；
第五步、S/D法灭活病毒处理：在搅拌下加入含有11％吐温-80、3.3％磷酸三丁酯的S/D浓液，使最终蛋白液中含吐温-80为1％、磷酸三丁酯为0.3％，24～26℃缓慢搅拌保温6小时；
第六步、8％-10％乙醇第一次纯化反应：将上步处理结束的蛋白液降温至0-2℃，加50％-55％乙醇使最终乙醇浓度为8％-10％，温度降至-1～+1℃；
第七步、离心得沉淀，将该沉淀用10-15倍沉淀量溶解液搅拌溶解；
第八步、8％-10％乙醇第二次纯化反应：将上步溶解蛋白液降温至0-2℃，加50％-55％乙醇使最终乙醇浓度为8％-10％，温度降至-1～+1℃；
第九步、离心得沉淀，将该沉淀用溶解液搅拌至溶解，调pH为6.8～7.2，蛋白浓度在2～3％；
第十步、用无石棉的介质澄清及除菌过滤；
第十一步、原液检定
按照中国药典方法检定；
第十二步、半成品配制
按成品规格配制，加4％-6％蔗糖做稳定剂；
第十三步、半成品检定
按照中国药典方法检定；
第十四步、分装及冻干
应符合“中国药典生物制品分装和冻干规程”规定，分装后的制品经外观检查合格后立即冻结，冻干过程中制品温度是-40℃～+35℃，真空封口；
第十五步、干热病毒灭活
冻干制品检真空后放在98-100℃水浴中加热30分钟；
第十六步、成品检验
按中国药典的方法检验；
第十七步、包装。第四步、第七步、第九步所述的溶解液是含有0.9％氯化钠+1.2％柠檬酸钠+0.27％三羟甲基氨基甲烷的水溶液构成。S/D法是表面活性剂、有机溶剂法构成。本发明的优点是：纯度≥95％、杂质少、在临床应用时负反应发生率低，用药更安全。
具体实施方式：经分离、提纯，并经S/D法和干热法二步病毒灭活制成；
第一步、新鲜分离的液体血浆或冰冻血浆，均可用于生产；
第二步、分离后无菌的血浆，血浆在0～4℃下离心去除冷沉淀；
第三步、8％-10％乙醇反应：去冷沉淀血浆用醋酸缓冲液调pH至6.8～7.2，加50％-55％乙醇至反应液最终浓度为8％-10％，反应液温度至-1～-3℃；
第四步、离心得沉淀，将该沉淀用10-15倍沉淀量的溶解液搅拌至溶解；
第五步、S/D法灭活病毒处理：在搅拌下加入含有11％吐温-80、3.3％磷酸三丁酯的S/D浓液，使最终蛋白液中含吐温-80为1％、磷酸三丁酯为0.3％，24～26℃缓慢搅拌保温6小时；
第六步、8％-10％乙醇第一次纯化反应：将上步处理结束的蛋白液降温至0-2℃，加50％-55％乙醇使最终乙醇浓度为8％-10％，温度降至-1～+1℃；
第七步、离心得沉淀，将该沉淀用10-15倍沉淀量溶解液搅拌溶解；
第八步、8％-10％乙醇第二次纯化反应：将上步溶解蛋白液降温至0-2℃，加50％-55％乙醇使最终乙醇浓度为8％-10％，温度降至-1～+1℃；
第九步、离心得沉淀，将该沉淀用溶解液搅拌至溶解，调pH为6.8～7.2，蛋白浓度在2～3％；
第十步、用无石棉的介质澄清及除菌过滤；
第十一步、原液检定
按照中国药典方法检定；
第十二步、半成品配制
按成品规格配制，加4％-6％蔗糖做稳定剂；
第十三步、半成品检定
按照中国药典方法检定；
第十四步、分装及冻干
应符合“中国药典生物制品分装和冻干规程”规定，分装后的制品经外观检查合格后立即冻结，冻干过程中制品温度是-40℃～+35℃，真空封口；
第十五步、干热病毒灭活
冻干制品检真空后放在98-100℃水浴中加热30分钟；
第十六步、成品检验
按中国药典的方法检验；
第十七步、包装。第四步、第七步、第九步所述的溶解液是含有0.9％氯化钠+1.2％柠檬酸钠+0.27％三羟甲基氨基甲烷的水溶液构成。
下面举具体实施例进一步说明本发明技术方案：
例1、经分离、提纯，并经S/D法和干热法二步病毒灭活制成；
第一步、新鲜分离的液体血浆或冰冻血浆，均可用于生产；
第二步、分离后无菌的血浆，在血浆在0℃下离心去除冷沉淀；
第三步、8％乙醇反应：去冷沉淀血浆用醋酸缓冲液调pH至6.8，加50％乙醇至反应液最终浓度为8％，反应液温度至-1℃；
第四步、  离心得沉淀，将该沉淀用10倍沉淀量的溶解液搅拌至溶解；
第五步、S/D法灭活病毒处理：在搅拌下加入含有11％吐温-80、3.3％磷酸三丁酯的S/D浓液，使最终蛋白液中含吐温-80为1％、磷酸三丁酯为0.3％，24℃缓慢搅拌保温6小时；
第六步、8％乙醇第一次纯化反应：将上步处理结束的蛋白液降温至0℃，加50％乙醇使最终乙醇浓度为8％，温度降至-1℃；
第七步、离心得沉淀，将该沉淀用10倍沉淀量溶解液搅拌溶解；
第八步、8％乙醇第二次纯化反应：将上步溶解的蛋白液降温至0℃，加50％乙醇使最终乙醇浓度为8％，温度降至-1℃；
第九步、离心得沉淀，将沉淀用溶解液搅拌至溶解，调pH为6.8，蛋白浓度在2％；
第十步、用无石棉的介质澄清及除菌过滤；
第十一步、原液检定
按照中国药典方法检定，
第十二步、半成品配制
按成品规格配制，加4％蔗糖做稳定剂
第十三步、半成品检定
按照中国药典方法检定，
第十四步、分装及冻干
应符合“中国药典生物制品分装和冻干规程”规定，分装后的制品经外观检查合格后立即冻结，冻干过程中制品温度是-40℃～+35℃，真空封口；
第十五步、干热病毒灭活
冻干制品检真空后放在98-100℃水浴中加热30分钟；
第十六步、成品检验
按中国药典的方法检验；
第十七步、包装。
例2、经分离、提纯，并经S/D法和干热法二步病毒灭活制成；
第一步、新鲜分离的液体血浆或冰冻血浆，均可用于生产；
第二步、分离后无菌的血浆，在血浆在4℃下离心去除冷沉淀；
第三步、10％乙醇反应：去冷沉淀血浆用醋酸缓冲液调pH至7.2，加55％乙醇至反应液最终浓度为10％，反应液温度至-3℃；
第四步、离心得沉淀，将该沉淀用15倍沉淀量的溶解液搅拌至溶解；
第五步、S/D法灭活病毒处理：在搅拌下加入含有11％吐温-80、3.3％磷酸三丁酯的S/D浓液，使最终蛋白液中含吐温-80为1％、磷酸三丁酯为0.3％，26℃缓慢搅拌保温6小时；
第六步、10％乙醇第一次纯化反应：将上步处理结束的蛋白液降温至2℃，加55％乙醇使最终乙醇浓度为10％，温度降至+1℃；
第七步、离心得沉淀，将该沉淀用15倍沉淀量溶解液搅拌溶解；
第八步、8％乙醇第二次纯化反应：将上步溶解的蛋白液降温至2℃，加50％乙醇使最终乙醇浓度为10％，温度降至+1℃；
第九步、离心得沉淀，将该沉淀用溶解液搅拌至溶解，调pH为7.2，蛋白浓度在3％；
第十步、用无石棉的介质澄清及除菌过滤；
第十一步、原液检定
按照中国药典方法检定，
第十二步、半成品配
按成品规格配制，加入6％蔗糖做稳定剂
第十三步、半成品检定
按照中国药典方法检定，
第十四步、分装及冻干
应符合“中国药典生物制品分装和冻干规程”规定，分装后的制品经外观检查合格后立即冻结，冻干过程中制品温度是-38℃～+33℃，真空封口；
第十五步、干热病毒灭活    
冻干制品检真空后放在98-100℃水浴中加热30分钟；
第十六步、成品检验
按中国药典的方法检验；
第十七步、包装。
例3、经分离、提纯，并经S/D法和干热法二步病毒灭活制成；
第一步、新鲜分离的液体血浆或冰冻血浆，均可用于生产；
第二步、分离后无菌的血浆，在血浆在2℃下离心去除冷沉淀；
第三步、9％乙醇反应：去冷沉淀血浆用醋酸缓冲液调pH至7.0，加53％乙醇至反应液最终浓度为9％，反应液温度至-2℃；
第四步、离心得沉淀，将该沉淀用13倍沉淀量的溶解液搅拌至溶解；
第五步、S/D法灭活病毒处理：在搅拌下加入含有11％吐温-80、3.3％磷酸三丁酯的S/D浓液，使最终蛋白液中含吐温-80为1％、磷酸三丁酯为0.3％，25℃缓慢搅拌保温6小时；
第六步、9％乙醇第一次纯化反应：将上步处理结束的蛋白液降温至1℃，加53％乙醇使最终乙醇浓度为9％，温度降至0℃；
第七步、离心得沉淀，用13倍沉淀量溶解液搅拌溶解；
第八步、9％乙醇第二次纯化反应：将上步的蛋白液降温至1℃，加53％乙醇使最终乙醇浓度为9％，温度降至0℃；
第九步、离心得沉淀，用溶解液搅拌至溶解，调pH为7.0，蛋白浓度在2.5％；
第十步、用无石棉的介质澄清及除菌过滤；
第十一步、原液检定
按照中国药典方法检定，
第十二步、半成品配制
按成品规格配制，加入5％蔗糖做稳定剂
第十三步、半成品检定
按照中国药典方法检定，
第十四步、分装及冻干
应符合“中国药典生物制品分装和冻干规程”规定，分装后的制品经外观检查合格后立即冻结，冻干过程中制品温度是-35℃～+30℃，真空封口；
第十五步、干热病毒灭活
冻干制品检真空后放在98-100℃水浴中加热30分钟；
第十六步、成品检验
按中国药典的方法检验；
第十七步、包装。