一种用于防治糖尿病的组合物.pdf

本发明涉及一种药用或保健品用组合物、制备方法及其应用，所述组合物含有天然植物提取物或单体为活性成分。本发明药物组合物可用于治疗和/或预防糖尿病及心脑血管疾病。

权利要求书
1.  一种药用或功能性保健品用组合物，包括以下活性组分：
a.含有单和/或二咖啡酰奎宁酸的植物或者植物部位提取物，或单和/或二咖啡酰奎宁酸单体；和
b.含有栀子总苷的栀子提取物，或栀子总苷，或栀子苷单体；
其中组分a中单或二咖啡酰奎宁酸与组分b中栀子苷的重量比例为0.1-10∶1。

2.  如权利要求1的组合物，所述二咖啡酰奎宁酸选自1，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、1，3-二-O-咖啡酰奎宁酸、1，4-二-O-咖啡酰奎宁酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸，或者它们的混合物。

3.  如权利要求1的组合物，所述单咖啡酰奎宁酸选自3-咖啡酰奎宁酸、5-咖啡酰奎宁酸，或者它们的混合物。

4.  如权利要求1的组合物，所述植物或者植物部位选自：苍耳子、向日葵、艾叶、茼蒿、灯盏细辛、茵陈、旋覆花、紫菀、菜蓟、山莴苣、林荫千里光，蜂胶、杜仲、金银花、继木、咖啡、可可树、北刘寄奴、狭叶紫锥花、苦丁茶、甘薯叶、甘薯、栀子、土豆、常春藤属植物、或鱼眼草属植物。

5.  如权利要求1的组合物，所述组分a为含有单和/或二咖啡酰奎宁酸的咖啡提取物。

6.  如权利要求5的组合物，所述咖啡提取物中还含有咖啡酸。

7.  如权利要求5或6的组合物，所述咖啡提取物不含咖啡因。

8.  如权利要求1的组合物，所述活性组分a为含有单和/或二咖啡酰奎宁酸的金银花提取物。

9.  如权利要求1的组合物，所述活性组分a为含有单和/或二咖啡酰奎宁酸的灯盏细辛提取物。

10.  如权利要求1的组合物，所述活性组分a为含有单和/或二咖啡酰奎宁酸的杜仲提取物。

11.  如权利要求1-10之一的组合物，是经口服或非肠道施用的产品。

12.  权利要求1-11之一的药物组合物在制备用于治疗和/或预防糖尿病及其并发症、心脑血管疾病、老年痴呆症、高脂血症的药物中的应用。

说明书一种用于防治糖尿病的组合物
技术领域
本发明涉及药用或功能性保健品用组合物，具体地说，是一种含有天然植物提取物或单体的组合物及其在药物、功能性保健品方面的应用。
背景技术
随着现代科学的高速发展，人们越来越重视“天然”药物。近年来，医药界在治疗心脑血管疾病、降血糖等药用植物研究方面做了诸多工作，加强了对生物活性物质的分析和研究，以期进一步明确其功效。然而，取得的成效是有限的。这主要是由于心脑血管疾病、糖尿病的致病机理复杂，常伴有不同类别的一种或多种并发症，已有的单一天然活性成分难以全方位奏效。
自由基损伤是II型糖尿病的重要发病因素之一，而高血糖又会导致自由基生成。据报道，咖啡酸、绿原酸可以抗氧化，而栀子能降低血糖，但是各自作用机制并不十分清楚(中国纪检监察报2000/6/21；郭婷等，国外医学·生理、病理科学与临床分册1999，19(4)；桅子降血糖作用的实验研究中药新药与临床药理2006年1月，第17卷第1期)，这对于科学地利用二者的优缺点来进一步改善糖尿病的治疗是不利的。另外，糖尿病及其并发症均需要长期服药，所以在改善疗效的基础上，减少给药剂量/次数、降低治疗成本是医药工作者必须解决的一项迫切任务。
不同药物的联用，似乎总是一种不错的解决方案。然而，迄今为止，针对单/二咖啡酰奎宁酸能否与栀子联合应用，二者的作用机制是加合、协同还是拮抗等基础问题，现有技术没有提供科学依据。至于二者是否能联合用于其它疾病(例如心脑血管疾病)，现有技术甚至没有类似的暗示或尝试。
发明内容
本发明人在这方面进行了大量的有益探索，并取得了诸多喜人的结果。
本发明的一个目的在于提供单和/或二咖啡酰奎宁酸与栀子的组合在治疗和/或预防糖尿病及其并发症、心脑血管疾病、老年痴呆症、高脂血症等疾病中的应用。
以下对本发明作进一步阐述。
糖尿病
在前期对于含有单/二咖啡酰奎宁酸的药用组合物研究的基础上，本发明人对于本发明组合在糖尿病治疗方面的药效及其作用机制做了详细的研究，得出了相当满意的结果。
我们根据以下机制设计了本发明药物联用：①栀子的降血糖机制与提高胰岛素分泌有关。②单/二咖啡酰奎宁酸、咖啡酸具有抗炎性反应、抗氧化、降低血粘度、抑制血小板聚集等作用，改善微循环；③单/二咖啡酰奎宁酸、咖啡酸增强了栀子的降血糖作用④栀子苷增强了单/二咖啡酰奎宁酸、咖啡酸抗炎性反应及抗氧化作用，降低胰腺自由基损伤。
所有这些作用，对于糖尿病(尤其是II型糖尿病)的发生、发展过程中的病理生理改变都是有益的。
期望不受任何理论或组方所限，在大量实验的基础上，本发明人推测这是由于栀子苷和单/二咖啡酰奎宁酸作用于不同靶点，尤其是在不同病理阶段发挥治疗作用，发挥了药物联用的整体治疗优势。
心脑血管疾病、老年痴呆症
二者联用的有益效果并不仅局限于糖尿病及其并发症中。在心脑血管疾病的防治中同样是适用且有益的。
现代医学认为，如果冠心病、脑卒中已经发生，无论是急性期还是恢复期治疗也同样有共同的干预靶点，比如：抗氧化及抗炎。对于急性期治疗，抗氧化及抗炎药物可以减少细胞的死亡，最大限度的保留功能。对于恢复期治疗，抗氧化及抗炎及降低血脂可以延缓动脉粥样硬化的发生，降低再次发生血栓(或出血)的可能性。
基于上述糖尿病研究所得出的结论，我们可以认为本发明组合对于冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的防治是适用的。进一步的研究证实了本发明药物组合在心脑血管疾病(尤其是缺血性疾病)、老年痴呆症的治疗和/或预防中表现出极好的治疗效果。
所述心脑血管疾病例如包括冠心病、脑卒中(也称脑中风)、心肌梗塞，和所述老年痴呆症包括阿尔茨海默病(简称AD)或脑血管性痴呆(简称VD)。
高脂血症
在针对上述疾病的研究中，还发现本发明组合具有调节血脂的作用。
功能性保健品
本发明的另一个目的在于本发明组合在制备功能性保健品中的应用。
由于本发明组合物具备上述功效，也符合功能性保健品安全性的要求。因此，本发明上述组合也可作为制备功能性保健食品的主要功能成分、或作为增益剂掺加到食品、饮料中，供适应人群长期使用。而且，在本发明试验的基础上，本领域技术人员可以理解的是，含有本发明上述组合的功能性保健品至少具有下述保健功能：辅助降血脂功能、辅助降血糖功能、辅助调节血压、抗氧化功能、辅助改善记忆功能、功能。
同样，功能性保健品制备技术也属于已知技术。相对于可药物而言，本发明组合物用于功能性保健品的来源、条件可以更为广泛和宽松。例如，可以使用含有单和/或二咖啡酰奎宁酸的提取物和栀子提取物组合，也可以直接选择单和/或二咖啡酰奎宁酸和栀子苷组合，也可以选择含有咖啡酸酯的其它植物提取物或使用其化学全合成、半合成物。在功能性保健品的功效成分构成中，可以仅含有本发明组合，也可以是本发明组合加其它辅助或加强功效的成分，如：添加维生素E用以增强抗氧化功效，在此不再赘述。
本发明组合及相应制剂
本发明组合是指：以单独含有单和/或二咖啡酰奎宁酸、栀子的独立制剂形式供联合施用，或者以同时含有二者的组合物/产品形式提供。
因此，本发明的另一个目的在于提供用于含有栀子和单和/或二咖啡酰奎宁酸的药用组合物，其中以单/二咖啡酰奎宁酸和栀子中的栀子苷计，二者的重量比例为0.1-10∶1，优选0.1-8∶1，更优选0.2-5∶1，和更优选0.5-2∶1。
本发明组合物中，栀子可以选择药味直接粉碎成粉末入药，也可以相当于上述中药材生药量的提取物或其它形式入药。因此，本发明药物组合物的栀子活性组成包括药材原粉、脂或水溶性提取物、有效部位、或有效成分，或者采用现有技术中已有的制品形式。例如，所述活性组成包括：
a).以栀子苷(即京尼平苷，Geniposide)为主要活性成分的物质：含有栀子总苷的栀子提取物，例如栀子的水提取物、醇提取物，或栀子总苷，或栀子苷单体或其衍生物。栀子总苷是指环烯醚萜总苷，其中的主要活性成分栀子苷，还可含有羟异栀子苷(gardenoside)、、山栀子苷(shazhiside)、栀子酮苷(gardoside)及京尼平酸苷的混合物，其中也可含有藏红花素(crocin)、藏红花酸(crocetin)。本领域技术人员可以理解的是，栀子总苷、栀子苷的提取和制备方法为已知技术(例如中国专利申请CN200510026143.0、CN02124158.9、ZL03109126、ZL 03122071、ZL 03137512、ZL03137512、ZL 200310111038)，在此不作赘述。
b).以单和/或二咖啡酰奎宁酸为主要活性成分的物质：咖啡酰奎宁酸是一类由奎宁酸(quinic acid)与数目不等的咖啡酸(caffeic acid)通过酯化缩合而成的酚酸类天然成分，也称为咖啡酸酯。根据奎宁酸分子上连接的咖啡酰基数目不同可以将该类成分分为单(一)咖啡酰奎宁酸、二咖啡酰奎宁酸、三咖啡酰奎宁酸和四咖啡酰奎宁酸等类别。
可以自多种植物提取出来的单/二咖啡酰奎宁酸，如：含有单和/或二咖啡酰奎宁酸的植物提取物，例如灯盏细辛水提取物；含有咖啡酸、单宁酸(丹宁酸)、单咖啡酰奎宁酸(如绿原酸)的咖啡提取物，优选其中不含咖啡因；含有绿原酸和/或异绿原酸的金银花、杜仲提取物；或直接取绿原酸、异绿原酸、或者其它单咖啡酰奎宁酸、或者二咖啡酰奎宁酸。
单/二咖啡酰奎宁酸、咖啡酸则来源很为广泛。本领域技术人员可以理解的是，本发明所用单/二咖啡酰奎宁酸的来源并不局限于上述植物。试验表明，只要含有单和/或二咖啡酰奎宁酸，其它植物或植物部位(提取物)也可实现本发明，例如：茜草科咖啡属咖啡豆或菊科植物，苍耳子、向日葵、艾叶、茼蒿、灯盏细辛、茵陈、旋覆花、紫菀、菜蓟、山莴苣、林荫千里光，及蜂胶、杜仲、金银花及其它忍冬科植物、继木、咖啡、可可树、北刘寄奴、狭叶紫锥花、苦丁茶及其它冬青属植物、甘薯叶、甘薯、栀子、土豆、常春藤属植物、或鱼眼草属植物。同时，需要指出的是，采用这些植物提取单和/或二咖啡酰奎宁酸或相应单体的提取和制备方法为已知技术，例如：药物分析杂志2005年，25(7)：751-755、泸州医学院学报1999年，22(6)：469-470、医学综述2004年，10(4)：249-250、EP0299107、US5401858、ZL01115358X、ZL031287298、ZL99105113、ZL200310113536、ZL94102414、ZL97109109、ZL01144170、ZL02133448、ZL02811814、ZL02824704、ZL03110999、ZL03134575、ZL200310111180、ZL200510000484、ZL03117754，在此不作赘述。
由于单咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸，其药理功效具有极大的相同性，并且，自植物中提取的咖啡酰奎宁酸往往是单、二咖啡酰奎宁酸的混合物，甚至还含有少量三咖啡酰奎宁酸，且单、二咖啡酰奎宁酸也常是各种同分异构体的混合物质(也即总咖啡酸酯)。因此，本发明既可以采用含有单咖啡酰奎宁酸、或含有二咖啡酰奎宁酸的植物提取物或单体，也可采用单咖啡酰奎宁酸单体、二咖啡酰奎宁酸单体的混合物，也可以采用含有单、二、三咖啡酰奎宁酸的提取物。
单咖啡酰奎宁酸可以取自3-咖啡酰奎宁酸(绿原酸)、5-咖啡酰奎宁酸(异绿原酸)，或者它们的混合物。
根据咖啡酰基取代位置不同，二咖啡酰奎宁酸分为1，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、1，3-二-O-咖啡酰奎宁酸、1，4-二-O-咖啡酰奎宁酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸。
可单独或者采用上述单、二咖啡酰奎宁酸的混合物，例如绿原酸、异绿原酸、3，4-位、3，5-位、1，5-位二咖啡酰奎宁酸的混合物，或者例如含有1，5-位二咖啡酰奎宁酸的提取物，或者例如绿原酸单体(即3-咖啡酰奎宁酸)、异绿原酸单体(即5-咖啡酰奎宁酸)、或者绿原酸和异绿原酸的混合物，或者3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸单体、和/或1，5-位二咖啡酰奎宁酸单体。上述单、二咖啡酰奎宁酸衍生物或药用盐也适于本发明。
有利的是，上述活性成分当以提取物形式入药时，栀子苷在所述提取物中的纯度为2-98wt％、优选25％、50％、75％或92wt％，和单/二咖啡酰奎宁酸在所述提取物中的纯度为5-98wt％、优选40％、75％或96wt％。
在上下文中，“本发明药用组合”所涉及术语“单/二咖啡酰奎宁酸”、“栀子”、“栀子(总)苷”具有上述定义。
下面的试验将证实：按照本发明描述的具有上述定义之“单/二咖啡酰奎宁酸”与“栀子”的组合，具有本发明所述的有益效果。鉴于现有技术中业已存在着相当成熟有效的制备上述定义组分的技术，在此不作重点描述。例如，可以采用现代提取和分离技术以提高活性物质的纯度、尽量除去不需要的杂质，类似的技术在现有技术中已相当成熟有效。
可针对栀子苷类、单/二咖啡酰奎宁酸的溶解特性和体内吸收特点(中国药科大学学报2003，34(01)：65-9；沈阳药科大学学报1999，16(4)：250-3；中国药理学通报1992，8(4)：278-80)，采用标准制剂技术，与药用辅料一起制成适宜的口服或非肠道给药剂型，类似的技术在现有技术中也已相当成熟有效，例如：片剂(ZL01115358、ZL03112999)；分散片(ZL03112974、ZL02153445)；口腔速崩片(ZL03102405、ZL200410016510、ZL200410041256)；混悬剂(ZL200410080266)、乳剂(ZL200410080265)、缓控释制剂(ZL01117620、ZL02109758、ZL02116795、ZL02129313、ZL02134118、ZL03100021、ZL03133897)、滴丸(ZL01133515、ZL03135325、ZL200310119222)；软胶囊(ZL01117620)；注射或输液剂(ZL03129007、ZL200410008734、ZL200410022438、ZL200410080023、ZL93106319、ZL95104038、ZL97101107、ZL02155001、ZL021332983、ZL031279953、ZL03141614、ZL03113037、ZL2003101210259、ZL200410013845)；或含磷脂制剂(ZL03111469、ZL01138902、ZL03153496)。
本发明组合物临床使用中，示例性的每日口服推荐剂量为：单/二咖啡酰奎宁酸40-1000mg(优选80-200mg)、栀子苷10-200mg(优选50-150mg)。
本发明的上述药物组合克服了已有药物存在的作用单一、服药量大等缺点，代表了天然药物治疗和预防糖尿病及其并发症、心脑血管疾病的新趋势。
                          药理药效学试验研究
一.糖尿病方面的药理作用
1.对链佐菌素所致糖尿病大鼠血糖和血清胰岛素的影响
方法：
取雄性SD大鼠按标准方法制备小剂量链佐菌素致糖尿病大鼠模型，3d后根据大鼠血糖值随机分组，每组8只。
各组连续灌胃给药8d，每日1次，空白组给予等量蒸馏水。最后一次给药后2小时(二甲双胍组1小时)摘眼球取血，测定血糖和血清胰岛素。
实验药物：阳性药二甲双胍组：300mg/kg；
咖啡酸酯组(mg/kg)：二咖啡酰奎宁酸120、50；
栀子组(mg/kg)：栀子提取物(栀子总苷含量50％)200、100；
组合A组(mg/kg)：【二咖啡酰奎宁酸∶栀子提取物(栀子苷含量60％)＝1∶5】200、100、50；
组合B组(mg/kg)：【单/二咖啡酰奎宁酸混合物∶栀子苷＝5∶1】100、50、30；
组合C组(mg/kg)：【二咖啡酰奎宁酸∶栀子苷＝1∶1】100、50、30；
结果：
表1对链佐菌素所致大鼠糖尿病血糖及血清胰岛素影响(X±s)  组别 N  空腹血糖(mmol/L)  空腹胰岛素(mIU/L)  给药前  给药后  给药前  给药后  空白组 8  17.8±2.0  15.6±2.3  9.7±3.4  9.2±3.1  二甲双胍组 8  17.6±1.9  10.9±2.1*  9.3±2.6  11.7±2.5  咖啡酸酯大剂量 8  16.8±1.3  16.7±1.4  9.9±2.9  10.5±3.7  咖啡酸酯小剂量 8  17.1±1.9  16.9±2.1  10.5±3.2  10.1±3.1  栀子A大剂量 8  17.6±2.1  16.8±1.8  9.6±2.8  13.7±2.8*  栀子A小剂量 8  17.5±1.4  16.6±1.5  10.8±3.5  10.6±3.3  组合A大剂量 8  17.6±1.6  8.7±1.2**  9.5±2.4  14.3±2.9*  组合A小剂量 8  17.5±1.4  11.6±1.5*  10.5±3.8  10.8±3.5  组合B大剂量 8  17.4±1.3  8.8±1.3**  9.7±3.1  14.1±3.1*  组合B小剂量 8  17.2±1.7  10.8±1.6*  9.9±2.1  10.8±2.1 组合C大剂量 8  17.6±1.6  8.6±1.4**  9.3±2.3  13.3±2.3* 组合C小剂量 8  17.3±2.2  11.2±1.6*  10.1±2.7  11.4±2.4
*：与空白组对比，前后差值P＜0.5；**：与空白组对比，前后差值P＜0.01
实验表明：二甲双胍组可以有效降低本模型大鼠血糖，差异有显著性，但不提高大鼠血清胰岛素水平。栀子大剂量组对血清胰岛素升高有显著性影响，但无明显降糖作用。二咖啡酰奎宁酸组对血糖及血清胰岛素均无显著性影响。
本发明组合物各剂量组均可降低大鼠血糖，其作用优于二甲双胍或与之相当，各大剂量组可以提高血清胰岛素。
二.心脑血管方面的药理作用
1.对大鼠试验性脑缺血的保护作用
对脑水含量的影响
将体重160-180g大鼠随机分组，试验前9天及术前1hr每天口服给药一次。结扎双侧颈动脉造成急性实验性不完全缺血模型。
组合物A：绿原酸+栀子提取物(栀子总苷含量80％)1∶2
组合物B：单咖啡酰奎宁酸(含绿原酸及异绿原酸)+栀子总苷1∶1
表2对实验性脑缺血大鼠脑水含量的影响(X±S)(n＝10)  组别与剂量  脑水含量(％)  正常对照组  43.9±2.83  脑缺血模型  76.6±2.45  依达拉奉10mg/kg  69.2±3.06*  组合物A组 高剂量100mg/kg  61.1±2.79**  组合物A组 中剂量50mg/kg  62.3±2.58**  组合物A组 低剂量30mg/kg  70.9±3.01*  组合物B组 高剂量80mg/kg  61.8±3.02**  组合物B组 中剂量40mg/kg  63.6±2.89**  组合物B组 低剂量20mg/kg  70.3±3.76*  绿原酸组40mg/kg  72.9±3.33  栀子提取物组80mg/kg  72.6±2.92
与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
由上表可知，本发明各组及依达拉奉组对不完全性脑缺血引起的脑水肿均显示出保护作用，但是与脑缺血模型组比较，组合物组中剂量以上组使脑含水量减少更加显著(P＜0.01)，表明其对不完全性脑缺血引起的脑水肿有显著的保护作用。而单独施用的绿原酸及栀子提取物没有保护作用。
2.对缺血性脑损伤的影响
对大鼠脑梗塞组织重量的影响
取SD大鼠，雌雄各半，随机分组【假手术组、生理盐水组(NS)、本发明组合物A(单/二咖啡酰奎宁酸混合物(2∶1)+栀子苷1∶5)3个剂量组、本发明组合物B(灯盏细辛提取物+栀子提取物(栀子苷含量65％)3∶1)3个剂量组、阳性药组(单/二咖啡酰奎宁酸混合物组(2∶1)、栀子总苷组)】，每组10只。按照已知药理学方法做成大鼠大脑中动脉结扎(MCAO)模型。结果见下表。
表3对MCAO所致大鼠脑梗塞组织重量的影响(n＝10)  组别与剂量  梗塞脑组织重量百分比  对照组  4.2±2.2  NS  32.2±5.3  本发明组合物A高剂量50mg/kg  20.9±4.8**  本发明组合物A中剂量30mg/kg  21.2±4.0**  本发明组合物A低剂量15mg/kg  23.0±3.2*  本发明组合物B高剂量50mg/kg  20.4±3.9**  本发明组合物B中剂量30mg/kg  21.8±4.5**  本发明组合物B低剂量15mg/kg  22.8±5.2*  单/二咖啡酰奎宁酸混合物组30mg/kg  22.8±5.7*  栀子总苷组30mg/kg  23.1±6.0*
与NS比较，*P＜0.05，**P＜0.01
结果表明，大鼠MCAO后明显有脑梗塞发生，本发明组合各组各剂量(iv)组可明显降低脑梗塞组织重量百分比(P＜0.01，P＜0.05)，而单/二咖啡酰奎宁酸混合物、栀子苷组也有较明显的降低效果(P＜0.05)，但是与组合物大、中剂量相比，阳性对照组效果明显不如本发明组合。
同样，在采用与上表相同的药物及其剂量，对MCAO所致大鼠缺血损伤行为学指标的影响的实验中，结果显示了并可以得出与上述相类似的结论，即组合物、单/二咖啡酰奎宁酸混合物和栀子苷组均显示了相关的作用，但以本发明组合大、中剂量组的效果最好，明显优于单纯的单/二咖啡酰奎宁酸混合物和栀子总苷组。
3对肿瘤坏死因子损伤大鼠心脏微血管内皮细胞炎症因子的影响
材料
本发明组合物A：栀子苷+总咖啡酸酯(含有绿原酸、异绿原酸、二咖啡酰奎宁酸及咖啡酸共85％)1∶12，(25、50、100μg/ml)；
本发明组合物B：栀子总苷(含量85％)+总咖啡酸酯(含有绿原酸、异绿原酸、二咖啡酰奎宁酸及咖啡酸共85％)10∶1，(25、50、100μg/ml)；
对照药：栀子总苷(含量85％)(50μg/ml、100μg/ml)；总咖啡酸酯(含有绿原酸、异绿原酸、二咖啡酰奎宁酸及咖啡酸共85％)(50μg/ml、100μg/ml)；
方法
通过CMEC体外培养技术，建立TNF-α损伤的细胞模型，以细胞活力(MTT)、乳酸脱氢酶(LDH)为评价指标，观察药物对损伤的CMEC的保护作用。以双抗体夹心ELISA法检测损伤CMEC上清液中白介素6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白介素8(IL-8)的含量；以实时定量PCR方法检测损伤CMEC IL-6、MCP-1、IL-8mRNA的表达为评价指标，观察药物在不同浓度对损伤的CMEC合成释放炎症介质的影响。
结果及结论
显示本发明组合物各组25～100μg/ml均可提高TNF-α损伤CMEC的细胞活力，降低LDH的释放，以50μg/ml效果最佳。栀子总苷组无此作用，总咖啡酸酯100μg/ml有微弱作用，与本发明组合物A、B组中的25μg/ml相当。
本发明组合物各组在25～100μg/ml范围内能够浓度依赖性的抑制TNF-α损伤CMEC IL-6的释放及mRNA的表达。栀子总苷无此作用，总咖啡酸酯100μg/ml有微弱作用，但稍弱于本发明组合物A、B组中的25μg/ml。
本发明组合物各组对TNF-α损伤CMEC作用3～12h内均可减少IL-6的释放，其中在9h时作用最为明显。在25～100μg/ml范围内能够浓度依赖性的抑制TNF-α损伤CMEC的MCP-1释放，且作用随时间的增长抑制作用逐渐减弱。25～50μg/ml的本发明组合物有降低损伤CMEC的MCP-1mRNA表达的趋势，100μg/ml的本发明组合物降低MCP-1的表达。本发明组合物对TNF-α损伤CMEC释放IL-8有降低的趋势。栀子苷无此作用，总咖啡酸酯100μg/ml有微弱作用，但稍弱于本发明组合物25μg/ml。本试验表明，本发明组合物能够抑制TNF-α诱导CMEC分泌IL-6、MCP-1的作用，降低其mRNA表达，阻抑炎症级联反应，减轻炎性因子对CMEC的损伤。单独给予的栀子总苷无此作用，总咖啡酸酯高浓度(大剂量)有微弱作用。可以得出栀子苷和总咖啡酸酯合用具有协同抗炎作用的结论。
4脑细胞保护作用
材料和方法
实验动物：健康Wistar大鼠72只，体重260±15g；
药物：
本发明组合物A：栀子提取物(栀子苷含量75％)+总咖啡酸酯(含有单、二、三咖啡酰奎宁酸及咖啡酸)7∶1，20mg/kg；
本发明组合物B：栀子提取物(栀子苷含量75％)+总咖啡酸酯(含有单、二、三咖啡酰奎宁酸及咖啡酸)1∶7，20mg/kg；
阳性对照药(注射)：栀子苷，20mg/kg；总咖啡酸酯(含有单、二、三咖啡酰奎宁酸及咖啡酸)，20mg/kg；依达拉奉注射液，10mg/kg；
实验方法：大鼠随机分为6组，每组12只。正常对照组：给0.9％氯化钠液3ml/kg；模型组：参照Kaizumis栓线法建立脑缺血再灌注动物模型。
脑水肿及脑钙含量的测定：取右前脑50～100mg，烘干至恒重，即为干重。
脑含水量测定：用公式：(湿重-干重)/湿重，计算脑含水量。
结果
(1)大鼠脑组织梗塞区观察：
光镜下：模型组神经元轮廓模糊，胞体着色变深，胞质分界不清。细胞周围亮区变宽与正常对照组有显著差异(P＜0.01)。本发明组合物各组及依达拉奉组神经元结构尚清晰，胞核与胞质界限尚能分清，细胞周围亮区较宽，与模型组相比虽有缩小，但无显著性差异。栀子苷组和总咖啡酸酯组神经元结构欠清晰，胞核与胞质界限能分清，细胞周围亮区较宽，与模型组相比未见明显缩小。
电镜下：模型组神经元变形，明暗神经元不易区分，胞核变形，核内异染色质增多、核膜及核周隙模糊不清、核质分界不清、网状结构消失、细胞器减少或变形、结构不清。线粒体呈气球样肿胀、质膜结构不清或消失断裂、细胞周围有大量水肿液呈低电子密度亮区。本发明组合物各组及依达拉奉组神经元核周核膜清晰、核内异染色质稍增多、核周间隙较狭窄、胞质内细胞器较明显、但线粒体均有水肿样改变、细胞周围有少量水肿液。栀子苷组和总咖啡酸酯组神经元核周核膜欠清晰、核内异染色质稍明显增多、核周间隙较狭窄、胞质内细胞器不明显、线粒体有水肿样改变。模型组星形胶质细胞水肿、胞质电子密度降低、细胞器减少、局部细胞膜结构不清。本发明组合物组及依达拉奉组星形胶质细胞的水肿表现较模型组轻，细胞器与模型组相比明显较多。栀子苷组和总咖啡酸酯组星形胶质细胞则与模型组基本相似。
(2)脑组织钙、丙二醛、超氧化物歧化酶、脑水分含量的实验结果：模型组脑组织丙二醛含量、钙含量、脑水分均较正常对照组明显升高(P＜0.01)，而SOD活性则明显低于正常对照组(P＜0.01)；本发明组合物各组能抑制灌注后脑组织丙二醛含量的升高和升高SOD活性(P＜0.01)，改善脑水含量(P＜0.01)，效果与依达拉奉相当，明显优于总咖啡酸酯和栀子苷组。
结论
本发明组合物能显著抑制脑缺血再灌注大鼠脑组织MDA含量的升高和提高SOD活性，改善脑水含量，并从超微结构上证实对膜性结构尚有一定保护作用。本发明组合物主要通过提高SOD活性，清除氧自由基，从而对脑细胞起保护作用，其作用与依达拉奉相当，明显优于单独施用的栀子苷和总咖啡酸酯。
三.老年痴呆方面的药理作用
对缺血再灌注制备的VD模型的作用
大鼠分为假手术组、模型组、单咖啡酰奎宁酸组(含有绿原酸、异绿原酸)、栀子苷组和本发明组合物A组【单咖啡酰奎宁酸(含有绿原酸、异绿原酸)+栀子苷8∶1，注射用药】和本发明组合物B组【单咖啡酰奎宁酸(含有绿原酸、异绿原酸)+栀子苷1∶8，口服给药】，在制备模型前连续给药，然后用反复缺血再灌注制备VD大鼠模型，测定海马组织中MDA的含量。
表4.对再灌注制备的VD大鼠海马组织中MDA含量的影响比较(n＝10)  组别与剂量  MDA(nmol/mg)  假手术组  6.495±1.31  模型组  6.012±0.68  本发明组合A高剂量20mg/kg  3.835±0.65***  本发明组合A中剂量10mg/kg  4.135±0.62**  本发明组合A低剂量5mg/kg  4.866±0.59*  本发明组合B高剂量80mg/kg  4.127±0.58**  本发明组合B低剂量40mg/kg  4.211±0.49**  单咖啡酰奎宁酸组10mg/kg  5.977±0.42  栀子苷组10mg/kg  4.896±0.59*
与假手术组比较，*P＜0.1，**P＜0.05，***P＜0.01
上表显示，本发明组合物各组均可降低大鼠海马MDA含量，有抗氧化作用，但以本发明组合物(中、高剂量的A组和B组)的作用最显著，栀子苷组也降低了MDA含量，而单组分的单咖啡酰奎宁酸组则较弱。
四.抗氧化及降血脂方面的药理作用
对高血脂症大鼠的抗氧化作用
材料
本发明药物组合物A：栀子苷+杜仲提取物1∶10，80mg/kg、40mg/kg灌胃；
本发明药物组合物A：栀子苷+金银花提取物8∶1，80mg/kg、40mg/kg灌胃
正常对照组：生理盐水；
高血脂组：生理盐水；
阳性对照药：杜仲提取物(50mg/kg)；金银花提取物(50mg/kg)；栀子提取物(50mg/kg)；罗格列酮组：3mg/kg；灌胃。
实验方法
模型的建立：SD大鼠适应性饲养1周后，随机分组，每组8只。正常组喂基础饲料，饮用清洁的自来水。其余大鼠喂高脂、高糖饲料(基础饲料42％、猪油23％、蔗糖24％、食盐5％)，并饮用1％的食盐水。每日一次，药物灌胃，连续4周后取血测定观察指标。
结果
抗氧化作用：实验表明，单独施用的杜仲提取物及金银花提取物存在一定的抗氧化活性(对血清和肝脏LPO和SOD的影响，P＜0.05)，栀子组则没有抗氧化活性。本发明组合物各组的低、高剂量组均有抗氧化活性，尤其是高剂量组的活性更显著(p＜0.01)，明显优于单独施用的杜仲提取物及金银花提取物和罗格列酮对照药。
调血脂作用：表5对高脂血症大鼠血脂的影响  TC  TG  HDL  LDL-C  正常组  1.41±0.13  0.61±0.21  0.83±0.16  0.63±0.09  高血脂组  2.25±0.35△△  1.73±0.56△△  0.66±0.12  1.05±0.21△△  罗格列酮组  1.71±0.33*  1.38±0.48  0.75±0.11  1.00±0.27  栀子提取物  2.18±0.52△△  1.70±0.52△△  0.62±0.15  1.08±0.19△△  杜仲提取物  1.65±0.35*  1.33±0.38  0.76±0.16  0.92±0.21  金银花提取物  1.70±0.39*  1.31±0.42  0.68±0.15  0.96±0.24  组合A(低)  1.69±0.37*  0.79±0.38*  0.75±0.12  0.88±0.29  组合A(高)  1.52±0.21**  0.69±0.29*  0.78±0.18  0.73±0.18*  组合B(低)  1.65±0.28*  0.80±0.35*  0.70±0.13  0.89±0.26  组合B(高)  1.55±0.26**  0.76±0.21*  0.76±0.15  0.72±0.20*
与高血脂组比较*p＜0.05**p＜0.01；与正常组比较△△p＜0.01
结论
上述实验表明，单独施用的杜仲提取物及金银花提取物可以降低TC，但对血脂其他指标没有影响，而栀子则对所有血脂指标都没有作用。本发明组合物各组均具有显著的降低血脂TC、TG和LDL-C的作用，效果优于所有对照药。
本实验表明，栀子的加入，显著增强了杜仲提取物及金银花提取物的抗氧化及调节血脂作用，这种协同作用很大可能性上来源于栀子和咖啡酸酯的协同，具有良好的药用前景。
五.抗动脉粥样硬化的药理作用
对兔实验性动脉粥样硬化(AS)血管重构的影响
材料
本发明药物组合物A：栀子苷+单/二咖啡酰奎宁酸1∶8，50mg/kg灌胃；
本发明药物组合物B：栀子总苷+单/二咖啡酰奎宁酸9∶1，50mg/kg灌胃；
正常对照组：生理盐水；模型组：生理盐水；
阳性对照药：单/二咖啡酰奎宁酸(50mg/kg)、栀子总苷(50mg/kg)、普罗布考(25mg/kg)。
实验方法
将纯种雄性新西兰兔，随机分组，饲养1周后，采用球囊损伤内皮继喂食高脂饲料的方法复制家兔实验性AS模型。观察12周。
测定项目及结果
组织病理学：光学显微镜下，正常对照组内皮细胞完整未见异常改变；模型组动脉内皮细胞缺损，内膜增生，6周时内膜增生严重，管腔明显狭窄而且大小不规则，细胞胞质嗜酸性不明显，出现大量大小不规则的泡沫细胞，有的可见脂肪坏死中心，内膜下层可见大量梭形增生细胞；各给药组内皮缺损面减少，增厚明显减轻，泡沫细胞减少，尤其以本发明组合物各组及普罗布考为最优。
组织形态学：最大内膜厚度(MIT)、最小管腔直径(MLD)、管腔面积(LA)、内弹力膜围绕面积(IELa)、外弹力膜围绕面积(EELa)，并得出内膜面积(IA)、中膜面积(MA)、管腔狭窄百分比(LS)，其中，IA＝IELa-LA；MA＝EELa-IELa；LS＝IA/IELa。
内膜厚度已经被证实可以作为早期动脉硬化的有用指征，在减小MIT、IA和LS、增加LA方面，各给药组表现出不同程度作用。在抑制内膜增殖方面，以本发明组合物和普罗布考组作用尤为明显(P＜0.01)，显著优于栀子和单/二咖啡酰奎宁酸组(P＜0.05)。
讨论
已知栀子和咖啡酰奎宁酸对AS都有一定治疗作用，但其抗AS的机理并不清楚。由于植物药多组分的特性使得其药理作用往往也是呈现出“多靶点”的特性，当然，也正是由于这种特性，使得详细研究其药理机制显得较为困难。同样的原因，本发明人目前尚无法准确认定本发明组合协同作用的机理，只能以药效学资料作为结论，而暂时忽略其具体机制。
栀子苷与咖啡酰奎宁酸水溶性都很好，二者的合用，配伍相对稳定，也不会产生化学反应而减损药效，相反，可能由于治疗机理的侧重方向不同，可产生更显著的协同作用，这也是临床医学实践中对药物特性极为需要的——单药多靶点药理特性。
                              实施例
实施例1胶囊剂
取栀子5g，粉碎成粗粉，加75％乙醇回流提取三次，第一、二次各2小时，第三次1小时，合并提取液，减压浓缩至约400ml，用正丁醇提取三次，每次300ml，合并正丁醇提取液，减压浓缩至无正丁醇味，加水200ml，加热溶解，滤过，滤液喷雾干燥，得提取物I备用；
取提取物I一份、取金银花提取物(绿原酸含量不低于50％)1g，加入淀粉、硬脂酸镁，混匀，装入硬胶囊中。经检测，每胶囊中含有绿原酸500mg、和栀子苷100mg。
实施例2片剂
取咖啡豆5kg，用95％的乙醇提取，提取物溶于水后分别以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得石油醚部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分。乙酸乙酯部分经硅胶柱层析和MCI柱层析分别得二咖啡酰氧基奎宁酸8g和奎宁酸4g。然后把二咖啡酰氧基-奎宁酸100mg，溶于1000ml水中制成0.1％浓度的水溶液加热溶解，混合均匀后，装入药瓶中密封，消毒制成产品，得提取物II备用。
取实施例1的提取物I两份、提取物II一份，加入低取代羟丙基纤维素、硬脂酸镁、淀粉、微晶纤维素，按照标准制粒和压片工艺制粒。经检测，含有二咖啡酰奎宁酸100mg/片、栀子苷200mg/片。
实施例3软胶囊剂
取实施例1的提取物I半份、提取物II五份，加入淀粉、硬脂酸镁，混匀，按照标准工艺制成软胶囊。经检测，每胶囊中含有含有二咖啡酰奎宁酸500mg、栀子苷50mg。
实施例4水针剂
取灯盏细辛全植物30kg，用95％的乙醇提取，提取物溶于水后分别以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得石油醚部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分。乙酸乙酯部分经硅胶柱层析和MCI柱层析得提取物III。
另取栀子总苷5g，加注射用水及氯化钠适量，溶解后再加入上述提取物III，加注射用水至2000ml，滤过，灌封(10ml/支)，灭菌，即得。经检测，含有总咖啡酸脂150mg/支、和栀子总苷25mg/支。
实施例5冻干针剂
无菌条件下取单/二咖啡酰奎宁酸混合物25g、适量药用碱，加注射用水约至900ml，搅拌使溶解，调节pH值至6.5-7.5，加入栀子苷75g至溶解，混合均匀、微孔滤膜过滤，加注射用水至1000ml。然后，加配制量的0.02％活性炭搅拌5-10min，用无菌抽滤漏斗过滤，再用灭菌垂熔漏斗精滤或超滤，滤液检验合格后分装于1000支5ml安瓿中，低温冷冻干燥，无菌熔封即得。经检测，含有单咖啡酰奎宁酸8mg/支、二咖啡酰奎宁酸15mg/支、和栀子苷75mg/支。
实施例6功能性保健食品
取蜂胶提取物100g(含咖啡酸、单咖啡酰奎宁酸不低于70％)、栀子提取物(栀子苷含量不低于65％)100g、维生素E 50g、甜味添加剂适量，加入淀粉等辅料至总质量300g，混匀，按标准工艺压片成1000片，即得功能性保健食品片剂。
实施例7功能性保健食品
取咖啡豆提取物(总咖啡酸酯含量不低于50％，不含咖啡因)400g、栀子苷5g、甜味添加剂、淀粉适量，按标准工艺制备成颗粒剂。