说明书二苯并二氮杂酮类似物，它们的生产方法和它们作为药物的用途
技术领域
本发明涉及具有改善性能的dibenzodiazepinone(二苯并二氮杂酮)类似物，它们是化合物1的化学衍生物。本发明进一步涉及它们的药学上可接受的盐、溶剂化物和前药，和涉及获得所述化合物的方法。一种获得所述衍生物的方法涉及化合物1的生物合成后化学修饰。本发明进一步涉及二苯并二氮杂酮类似物、它们药学上可接受的盐、溶剂化物和前药作为药物的用途，特别是涉及它们作为癌细胞生长抑制剂、哺乳动物脂氧合酶和用于治疗急性和慢性炎症的用途，并且涉及含有二苯并二氮杂酮类似物或者其药学上可接受的盐、溶剂化物或者前药的药物组合物。
发明背景
真放线菌是通称为放线菌属的庞大和复杂革兰氏阳性菌组的亚型。在过去的数十年间，由于可以形成作为次级代谢产物的大量治疗有效化合物，特别是抗生素，因此人们对这些在土壤中富集的有机体产生了显著的商业和科学研究兴趣。可以产生新抗生素的菌株深入研究引起了对数百种新物质的鉴定。
已经对多种真放线菌，特别链霉菌属和密切相关的糖多孢菌属进行了广泛研究。这两种菌种都能产生显著多样性的生物学活性代谢产物。因为这些化合物的商业重要性，人们非常熟知这些有机体的遗传学和生理学。真放线菌的另一代表性的种属，小单孢菌属同样具有商业利益。例如，美国专利No.5,541,181(Ohkuma et al.)公开了由已知的真放线菌株——小单孢菌属M990-6(ATCC 55378)形成的二苯并二氮杂酮化合物，其中明确公开了5-法呢基-4，7，9-三羟基-二苯并二氮杂-11-酮(名称为“BU-4664L”)。ECO-4601(化合物1)和小单孢菌属株046-ECO11以及[S01]046公开于CA 2,466,340中。其治疗癌症的用途公开于PCT/CA2005/000751中。
ECO-4601(化合物1)
具有抗组胺性能的合成二苯并二氮杂酮类似物公开于公开的加拿大专利申请2,248,820中。
虽然多种生物学活性化合物已经从细菌中得到了鉴定，但是仍然需要获得具有增强性能的新颖化合物。由此，非常需要以高经济效益的方式和高产率获得药学活性化合物。本发明通过提供新的治疗学化合物和经过生物合成后化学修饰从而形成这些新颖化合物的方法，解决了上述这些问题。
发明概述
在本发明的一方面中，二苯并二氮杂酮类似物由如下所定义的式I化合物或者氢化或者氢化烷氧基化法呢基衍生物表示，或者式I化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物或者前药表示。在另一实施方案中，二苯并二氮杂酮类似物由如下所定义的化合物2～27中的任意一种或者药学上可接受的盐、溶剂化物或者前药表示，或者化合物2～25的任意一种的前药的盐表示。在另一实施方案中，二苯并二氮杂酮类似物由化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22中的任何一种表示，或者由化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22中任何一种的药学上可接受的溶剂化物或者前药表示。
在本发明的另一方面，二苯并二氮杂酮类似物由如下所定义的化合物23～25中的任何一种表示，或者由化合物23～25中任何一种的药学上可接受的溶剂化物或者前药表示。
本发明进一步包括通过以下方法获得的二苯并二氮杂酮类似物，所述方法包括以下步骤：(a)提供ECO-4601的分离形式，(b)化学改性化合物1。在另一实施方案中，二苯并二氮杂酮类似物是式I化合物，或者其氢化或者氢化烷氧基化法呢基衍生物，或者其药学上可接受的盐、溶剂化物或者前药。在另一实施方案中，化学修饰步骤(b)是选自N-烷基化、O-三酰基化、芳基溴化和法呢基氢化或者氢化烷氧基化的一个或者多个步骤。在另一实施方案中，二苯并二氮杂酮类似物选自化合物2～27。在另一实施方案中，二苯并二氮杂酮类似物选自化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22。在另一实施方案中，二苯并二氮杂酮类似物选自化合物23～25。
本发明进一步包括制备二苯并二氮杂酮化合物的方法，包括化学修饰法呢基二苯并二氮杂酮化合物1，和任选分离与纯化由此产生的二苯并二氮杂酮化合物。在一种实施方案中，所述化学修饰步骤包括选自N-烷基化、O-酰基化、芳基溴化和修饰法呢基侧链双键(包括氢化和氢化烷氧基化)的至少一个步骤。在该实施方案的亚类中，法呢基侧链修饰反应是部分(修饰一个或者两个双键)或者完全(修饰所有三个双键)修饰。
本发明进一步包括式I化合物或者其氢化或氢化烷氧基化法呢基衍生物或者药学上可接受的盐、溶剂化物或者前药作为抗癌剂用于治疗哺乳动物癌症前期或者癌症症状的用途。在一种实施方案中，所述化合物选自化合物2～27。在另一实施方案中，所述化合物选自化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22。在另一实施方案中，所述化合物选自化合物23～25。
本发明进一步包括式I化合物或者其氢化或氢化烷氧基化法呢基衍生物或者药学上可接受的盐或前药作为抗癌剂用于治疗哺乳动物增殖疾病的用途。在一种实施方案中，所述化合物选自化合物2～27。在另一实施方案中，所述化合物选自化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22。在另一实施方案中，所述化合物选自化合物23～25。
本发明进一步包括式I化合物或者其氢化或氢化烷氧基化法呢基衍生物或者药学上可接受的盐或前药在制备用于治疗哺乳动物癌症前期或者癌症症状的药物中用途。在一种实施方案中，所述化合物选自化合物2～27。在另一实施方案中，所述化合物选自化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22。在另一实施方案中，所述化合物选自化合物23～25。
本发明进一步包括含有式I化合物或者氢化或氢化烷氧基化法呢基衍生物或者其药学上可接受的盐或前药连同说明书的商业包装，其用于治疗瘤或癌症前期或者癌症症状。在一种实施方案中，所述化合物选自化合物2～27。在另一实施方案中，所述化合物选自化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22。在另一实施方案中，所述化合物选自化合物23～25。
在一种实施方案中，上述用途中的癌细胞、瘤、癌症前期或者癌症症状选自血癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠或者结肠直肠癌、前列腺癌或者CNS癌症。在另一实施方案中，上述方法和用途中的癌症前期或者癌症症状选自血癌、乳腺癌、前列腺癌和CNS癌症。
附图简述
图1：表示由丸剂(bolus)给药肿瘤细胞接种一天之后的带有C6恶性胶质瘤的鼠10～30mg/kg化合物1后产生的肿瘤生长抑制作用。
图2：表示由丸剂给药肿瘤细胞接种十天之后的带有恶性胶质瘤的鼠20～30mg/kg化合物1后产生的肿瘤生长抑制作用。
图3：表示带有恶性胶质瘤并且用盐水或者化合物1处理的鼠肿瘤部分的显微照片。用化合物1处理的肿瘤细胞密度表现出下降趋势和由肿瘤细胞得到的细胞核较大，并且呈现表明细胞毒素作用的固缩。
图4：表示由丸剂给药肿瘤细胞接种11～20天的带有C6恶性胶质瘤的鼠20～75mg/kg化合物2后产生的肿瘤生长抑制作用。
图5：表示以30mg/kg静脉内(iv)、腹膜内(ip)、皮下(sc)和口服(po)丸剂(bolus)给药之后，在瑞士鼠中的化合物1的平均(±SD)血浆浓度。
图6：表示以30mg/kg静脉内(iv)和腹膜内(ip)丸剂(bolus)给药之后，在CD-1鼠中的化合物1和2的平均(±SD)血浆浓度。
图7：表示在以30mg/kg静脉内(iv)、腹膜内(ip)和皮下(sc)丸剂给药之后，化合物1在多种组织中的平均浓度。
发明详述
本发明涉及具有改良性能的新颖二苯并二氮杂酮类似物，在此是指式I化合物和氢化或者氢化烷氧基化法呢基衍生物以及化合物2～27。本发明进一步涉及二苯并二氮杂酮化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物和前药。本发明进一步涉及通过化学修饰化合物1获得所述类似物的方法。化合物1从放线菌属株，小单孢菌属种046-ECO11(也称为046(ECO11))或者[S01]046中进行分离，如PCT/CA04/000069中所述。
本发明还涉及通过化学修饰由发酵和分离获得的法呢基二苯并二氮杂酮而形成新颖的二苯并二氮杂酮类似物的方法。在该实施方案的亚类中，形成的化合物为式I化合物或者其氢化或氢化烷氧基化法呢基衍生物，或者选自化合物23～27的化合物。
本发明还涉及含有选自式I化合物、化合物2～27和它们药学上可接受的盐、溶剂化物和衍生物的化合物的药物组合物。所述化合物可以用作药物，特别是可以用作赘生性细胞生长抑制剂。
以下详细说明公开了如何制备和应用二苯并二氮杂酮类似物和含有这些化合物的组合物抑制肿瘤生长。
据此，本发明的某些方面涉及含有本发明二苯并二氮杂酮化合物连同药学上可接受的载体的药物组合物，和应用该药物组合物治疗癌症前期或者癌症症状的方法。
I.定义
所有在本文中使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解相同的含义。为方便起见，将用于说明书、实施例和附属权利要求中的某些术语和短语的含义提供如下。
在此使用的术语“法呢基二苯并二氮杂酮”是指化合物1，即10-法呢基-4，6，8-三羟基-5，10-二氢二苯并[b，e][1，4]二氮杂-11-酮，还称为ECO-4601。
在此使用的术语“本发明化合物”、“二苯并二氮杂酮类似物”、“二苯并二氮杂酮化合物”及其等价表达是指含有法呢基部分或者由法呢基部分衍生的一类二苯并二氮杂酮化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物和前药。该术语包括式I化合物，选自化合物2～27的化合物，或者本发明例证的化合物，化合物2～5、7、13、14、15、18和21～25，或者任意上述化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物或者前药。在此使用的术语“二苯并二氮杂酮类似物”包括在化学合成中可以用作中间体的该类化合物或者含有不同于最丰同位素原子的同位素的变体(例如，替换H的D，替换12C的13C等等)。有时还将本发明化合物称为“活性成分”。
在此使用的术语“化学修饰”是指通过化学合成修饰称为“原料”的二苯并二氮杂酮化合物的一种或者多种步骤。优选在化学修饰方法中用作原料的化合物为化合物1。化学修饰步骤的实例包括N-烷基化、O-酰基化、芳香溴化和修饰法呢基侧链的双键(包括氢化和氢化烷氧基化)。法呢基侧链修饰反应可以是部分(修饰一个或者两个双键)或者完全(修饰三个双键)修饰。化学修饰步骤还在部分IIIB的方案中进行了限定并且在实施例4～8中进行了例证说明。
术语“酯”是指根据以下方案1(b)中所定义的O-酰基化反应，通过C(O)R”替换基团替换醇中的氢原子获得的二苯并二氮杂酮类似物，其中C(O)R”还可以为C-偶联的氨基酸。术语酯还包括酯的等价物，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯等等。更具体而言，术语“酯”包括在4、6和8位上醇的酯(原子编号参见实施例3～8)。
术语“N-烷基化衍生物”是指根据如以下方案2(a)所定义的N-烷基化反应，通过R替换基团替换N原子上的氢原子获得的二苯并二氮杂酮类似物。更具体而言，术语“N-烷基化衍生物”包括在5位氮原子上的取代衍生物(原子编号参见实施例3～8)。
在此使用的术语“氢化或者氢化烷氧基化法呢基衍生物”是指分别根据部分IHB方案3(a)和(b)中所定义的一般方法，并且更明确而言在实施例4和7中所定义的方法产生的在一至三个位置上具有通过饱和化(加入两个氢原子)或者通过加入醇分子(H和OC1-6烷基)而得到修饰的法呢基侧链的化合物。
在此使用的缩略语具有它们的一般含义。除非另有说明，缩略语“Ac”、“Me”、“Et”、“Pr”、“i-Pr”、“Bu”、“Bz”、“Bn”和“Ph”分别是指乙酰基、甲基、乙基、丙基(正丙基或者异丙基)、异丙基、丁基(正丁基、异丁基、仲丁基或者叔丁基)、苯甲酰基、苄基和苯基。说明书中的缩略语对应于以下测量、工艺、性能或者化合物：“RT”和“Rt”是指保留时间，“min”是指分钟，“h”是指小时，“μL”是指微升，“mL”是指毫升，“mM”是指毫摩尔，“M”是指摩尔，“mmole”是指毫摩尔，“eq”是指摩尔当量。“高压液相色谱”或者“高效液相色谱”简写为HPLC。
术语“烷基”是指直链、支链或者环状饱和烃基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、戊基、己基、庚基、环戊基、环己基和环己基甲基等等。烷基可以任选被选自以下的取代基取代：酰基、氨基、酰胺基、酰氧基、烷氧基羰基、羧基、羧酰胺基、氰基、卤素、羟基、硝基、硫基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、亚硫酰基、磺酰基、氧代、胍基和甲酰基。
其中n为2～12的整数的术语“C1-n烷基”是指具有1至所表明的“n”个碳原子的烷基。所述C1-n烷基可以为环状或者直链或支链烷基。
其中n为2～10的整数的术语“直链C1-n烷基”是指具有1至所表明的“n”个碳原子并且为直链的烷基，即在连接的原子(在此为氮原子)附近不是环状或者支链。所述C1-n烷基可以任选被比如氨基、氰基、卤素、羟基、硝基、硫基和烷氧基的基团取代。
术语“烯基”是指含有1～6个碳-碳双键的直链、支链或者环状不饱和烃基。烯基的实例包括但不限于乙烯基、1-丙烯-2-基、1-丁烯-4-基、2-丁烯-4-基和1-戊烯-5-基等等。烯基可以任选被选自以下的取代基取代：酰基、氨基、酰胺基、酰氧基、烷氧基羰基、羧基、羧酰胺基、氰基、卤素、羟基、硝基、硫基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、亚硫酰基、磺酰基、甲酰基、氧代和胍基。不饱和烃链的双键部分可以为顺式或者反式构型。
其中n为3～12的整数的术语“C2-n烯基”是指具有2至所表明数目“n”个碳原子的烯基。所述C2-n烯基可以为环状或者直链或支链烯基。
术语“炔基”是指含有至少一个碳-碳三键的直链、支链或者环状不饱和烃基。炔基的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔-3-基、1-丁炔-4-基、2-丁炔-4-基和1-戊炔-5-基等等。炔基可以任选被选自以下的取代基取代：酰基、氨基、酰胺基、酰氧基、烷氧基羰基、羧基、羧酰胺基、氰基、卤素、羟基、硝基、硫基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、亚硫酰基、磺酰基、甲酰基、氧代和胍基。
其中n为3～12的整数的术语“C2-n炔基”是指具有2至所表明数目“n”个碳原子的炔基。所述C2-n炔基可以为环状或者直链或支链炔基。
术语“环烷基”或者“环烷基环”是指在具有3～15个环原子的单或者稠合碳环系统中，进一步包括饱和或者部分不饱和碳环的如上所定义的烷基。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯-1-基、环戊烯-2-基、环戊烯-3-基、环己基、环己烯-1-基、环己烯-2-基、环己烯-3-基、环庚基、二环[4，3，0]壬基和降莰烷基等等。环烷基可以任选被选自以下的取代基取代：酰基、氨基、酰胺基、酰氧基、烷氧基羰基、羧基、羧酰胺基、氰基、卤素、羟基、硝基、硫基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、亚硫酰基、磺酰基和甲酰基。
其中n为4～15的整数的术语“C3-n环烷基”是指具有3至所表明的“n”个碳原子的环烷基环或者环状系统。
术语“杂环烷基”、“杂环”或者“杂环烷基环”是指进一步在具有3～15个环原子的单或者稠合杂环(例如四氢呋喃基具有五个环原子，包括一个氧原子)中包括1～4个杂原子(例如N、O、S、P)或者杂基团(例如NH、NRX、PO2、SO、SO2)的如上所定义的环烷基。杂环烷基、杂环或者杂环烷基环的实例包括但不限于吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢二噻吩基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉代、硫代吗啉代、噻烷基、哌嗪基、氮杂环丁烷基、oxetanyl(氧环丁基)、thietanyl、高哌啶基、oxepanyl、thiepanyl、氧氮杂基、二氮杂草基、硫氮杂基、1，2，3，6-四氢吡啶基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二烷基、1，3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二四氢噻吩基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂双环[3，1，0]己基、3-氮杂双环[4，1，0]庚基、3H-吲哚基和喹嗪基。可能时，由上述所列化合物衍生得到的上述杂环烷基可以为C-连接或者N-连接。杂环烷基、杂环或者杂环烷基环可以任选被选自以下的取代基取代：酰基、氨基、酰胺基、酰氧基、氧代、硫代羰基、亚氨基、烷氧基羰基、羧基、羧酰胺基、氰基、卤素、羟基、硝基、硫基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、亚硫酰基、磺酰基和甲酰基。
其中n为4～15的整数的术语“C3-n杂环烷基”是指在环中具有3至所表明的数字“n”个原子并且具有至少一个如上所定义的杂基团的杂环烷基。
术语“卤素”是指溴、氯、氟或者碘取代基。
术语“芳基”或者“芳环”是指在共轭单环或者多环系统中具有“4n+2”个π(pi)电子并且具有5～14个环原子的一般芳香基团，其中n为1～3的整数。芳基可以直接进行连接或者经C1-3烷基进行连接(还称为芳烷基)。芳基的实例包括但不限于苯基、苄基、苯乙基、1-苯乙基、甲苯基、萘基、联苯基和三联苯基等等。芳基可以任选被一个或者多个选自以下的取代基取代：酰基、氨基、酰胺基、酰氧基、叠氮基、烷硫基、烷氧基羰基、羧基、羧酰胺基、氰基、卤素、羟基、硝基、硫基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、亚硫酰基、磺酰基和甲酰基。
其中n为5～14的整数的术语“C5-n芳基”是指具有5至所表明的数字“n”个原子(包括碳、氮、氧和硫)的芳基。所述C5-n芳基可以为单环或者多环芳基。
术语“杂芳基”或者“杂芳基环”是指进一步含有1～4个选自氧、氮、硫或者磷的杂原子的如上所定义的芳环。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异唑基、噻唑基、唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、中氮茚基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异氮杂茚基、蛛吮基、嘌呤基、二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。杂芳基可以任选被一个或者多个选自以下的取代基取代：酰基、氨基、酰胺基、酰氧基、叠氮基、烷硫基、烷氧基羰基、羧基、羧酰胺基、氰基、卤素、羟基、硝基、硫基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、亚硫酰基、磺酰基和甲酰基。杂芳基可以直接进行连接或者经C1-3烷基进行连接(还称为杂芳烷基)。可能时，由上述所列化合物所衍生的上述杂芳基可以进行C-连接或者N-连接。
其中n为5～14的整数的术语“C5-n杂芳基”是指具有5至所表明的数字“n”个原子(包括碳、氮、氧和硫原子)的杂芳基。所述C5-n杂芳基可以为单环或者多环杂芳基。
术语“氨基酸”是指含有氨基的有机酸。该术语包括天然存在和合成氨基酸；因此，所述氨基可以但非需要连接在与酸相邻的碳原子上。C-偶联的氨基酸取代基经它的羧酸官能连接在母体分子的杂原子(氮或者氧)上。当杂原子是氧时，C-偶联的氨基酸与母体分子形成酯，当杂原子是氮时，形成酰胺。氨基酸的实例包括但不限于丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、锁链赖氨素、鸟氨酸、2-氨基丁酸、环己基丙氨酸、二甲基甘氨酸、苯基甘氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、羟基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、异锁链赖氨素、别-异亮氨酸、乙基甘氨酸、β-丙氨酸、氨基已二酸、氨基丁酸、乙基天冬酰胺和N-甲基氨基酸。氨基酸可以为纯L或者D异构体或者L和D异构体的混合物。
本发明化合物可以具有一个或多个不对称碳原子并且可以作为形成外消旋或者非外消旋化合物的混合物的旋光异构体存在。本发明化合物可以以单个异构体使用或者以立体化学异构形式的混合物使用。非对映异构体，即非重叠立体化学异构体可以通过传统方法进行分离，比如色谱法、蒸馏、结晶或者升华。所述旋光异构体可以通过根据常规方法拆分外消旋混合物得到制备，所述方法包括手性色谱法(例如HPLC)、免疫测定方法或者使用共价(例如Mosher’s酯)或者非共价(例如手性盐)结合手性试剂以形成对对映酯或者盐，随后可以通过常规方法(比如色谱法、蒸馏、结晶或者升华)对其进行进一步分离。然后，通过常规方法对所得手性酯或者盐进行裂解或者交换，从而回收期望的异构体。
本发明包括得到分离或者纯化的化合物。得到“分离”或者“纯化”的化合物是指表示按重量计为混合物至少10％、20％、50％、80％或者90％的化合物，条件是当在本领域熟练技术人员熟知的常规生物测定法中进行测试时，含有本发明化合物的混合物具有明显的(即，统计上显著的)生物活性，包括抑制细胞、细胞毒素、酶抑制或者受体结合作用。
术语“药学上可接受的盐”是指由含有碱性或者酸性部分的本发明化合物通过常规化学方法合成的无毒盐类。通常，所述盐类可以通过在水或者有机溶剂或者二者的混合物中，使这些化合物的游离酸或者碱形式与化学计量的适当碱或者酸反应得到制备；通常优选比如醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、异丙醇或者乙腈的非水介质。另一种制备盐的方法是利用离子交换树脂。术语“药学上可接受的盐”包括母体化合物或者其前药或溶剂化物的酸加成盐和碱加成盐。所述盐的性质并不是决定性的，条件是它是药学上可接受的盐即可。用于酸加成盐中的例证性的酸包括但不限于氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸、磺酸、磷酸、甲酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、草酸、苹果酸、谷氨酸、丙酸、乙二酸、葡糖酸、马来酸、embonic(帕莫酸)、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、泛酸、苯磺酸、甲苯磺酸、磺胺酸、甲磺酸、环己氨基磺酸、硬脂酸、藻酸、β-羟基丁酸、丙二酸、半乳糖二酸和半乳糖醛酸等等。适宜的药学上可接受的碱加成盐包括但不限于由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制备的金属盐类或者有机盐，比如由N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、赖氨酸和普鲁卡因等等制备的有机盐。药学上可接受的盐的其它实例列于Berge等人(1977)，Journal ofPharmaceutical Sciences，vol 66，no 1，pp 1-19中，其全部内容在此引入作为参考。
术语“溶剂化物”是指本发明化合物与一种或者多种溶剂分子(不论是有机或者无机溶剂分子)的物理结合。所述物理结合包括氢键键合。在某些情形中所述溶剂化物可以进行分离，例如，当一个或者多个溶剂分子结合入结晶固体的晶格中时。“溶剂化物”包括溶液相和可分离的溶剂化物。示例性的溶剂化物包括水合物、乙醇化物、甲醇化物和半乙醇合物等等。
术语“药学上可接受的前药”是指本发明化合物的任何药学上可接受的酯、酯的盐或者任何其它衍生物，通过给药至受者，能够直接或者间接提供本发明化合物或者其生物学活性代谢产物或者残基。特别优选的盐或者前药是当将所述化合物给药至哺乳动物(例如，使得口服给药的化合物更易于吸收到血液中)时，那些具有改良性能(比如本发明化合物的溶解性、效能或者生物利用度)盐或者前药，或者相对于母体物质提高母体化合物向生物学部分(例如，脑或者淋巴系统)的递送的盐或者前药。在此使用的前药是具有一个或者多个共价结合至载体的官能团的药物，其中当将该药物给药至哺乳动物对象时，在体内发生所述药物的新陈代谢或者化学解除。本发明化合物的药学上可接受的前药包括其羟基衍生物，比如但不限于酰氧基甲基醚、酰氧基乙基醚和酰基硫代乙基醚、酯、氨基酸酯、磷酸酯、磺酸盐和硫酸酯以及它们的金属盐等等。
II.本发明化合物
在一方面，本发明涉及新颖的二苯并二氮杂酮类似物，在此称为本发明化合物，并且涉及其药学上可接受的盐、溶剂化物和前药。
本发明化合物，化合物2～5、7、13、14、15、18和21～25可以通过它们任意的物理化学和光谱性能进行表征，比如质谱和NMR光谱，详细描述在实施例4～8中。
在另一方面，本发明化合物由式I进行表征：
式I
其中，
R1为直链C1-10烷基；
或者其法呢基衍生物，其中所述法呢基衍生物具有一个、两个或者三个得到氢化或者氢化烷氧基化的双键；
或者其药学上可接受的盐或者前药。
在一种实施方案中，R1为直链C1-10烷基，和所有其它基团如先前所公开。在该实施方案的亚类中，所述烷基任选被选自卤素、氟、氨基和羧基的取代基取代，或者其药学上可接受的盐。在另一实施方案中，R1为甲基。在另一实施方案中，R1为乙基。在另一实施方案中，R1为正丙基。在另一实施方案中，R1为正丁基。在另一实施方案中，R1为正戊基。在另一实施方案中，R1为正己基。在另一实施方案中，R1为甲基，和法呢基得到了完全氢化(即饱和)。在另一实施方案中，R1为甲基，和法呢基的一个双键得到了氢化。在另一实施方案中，R1为甲基，和法呢基的两个双键得到了氢化。在另一实施方案中，R1为直链C1-10烷基，和法呢基的一个双键得到了氢化。在另一实施方案中，R1为直链C1-10烷基，和法呢基的两个双键得到了氢化。在另一实施方案中，R1为直链C1-10烷基，和法呢基得到了完全氢化(即饱和)。在另一实施方案中，R1为直链C1-10烷基，和法呢基的一个双键得到了氢化甲氧基化。在另一实施方案中，R1为直链C1-10烷基，和法呢基的两个双键得到了氢化甲氧基化。在另一实施方案中，R1为甲基，和法呢基的一个双键得到了氢化烷氧基化。在另一实施方案中，R1为甲基，和法呢基的两个双键得到了氢化烷氧基化。在另一实施方案中，R1为乙基，和法呢基的一个双键得到了氢化烷氧基化。在另一实施方案中，R1为乙基，和法呢基的两个双键得到了氢化烷氧基化。本发明包括所有的酯或者N-烷基化衍生物和上述化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物及其前药。
以下为本发明的例证性化合物，这些加以命名的化合物并不意图以任何方式限制本发明的范围：
A.N-烷基化产品：
化合物2； 化合物3；
化合物4； 化合物5；
化合物6； 化合物7；
化合物8； 化合物9；
化合物10； 化合物11；
化合物12； 化合物13；
B.N-烷基化产品的氢化衍生物：
化合物14； 化合物15；
化合物16；
C.N-烷基化产品的氢化烷氧基化衍生物：
化合物17； 化合物18；
化合物19； 化合物20；
化合物21； 化合物22；
D.其它选择：
化合物23； 化合物24；
化合物25； 化合物26；和
化合物27；
或者化合物2～27中任何一种化合物的前药的药学上可接受的盐、溶剂化物。
本发明进一步提供任何一种上述化合物的酯和N-烷基化衍生物。某些实施方案明确排除了一种或者多种式I化合物。
本发明化合物的前药包括，其中4、6和8-羟基中的一个或多个羟基或者分子上的任意其它羟基与任何给药至哺乳动物对象时裂解从而形成游离羟基的基团键接的化合物。前药的实例包括但不限于羟基官能团的乙酸酯、甲酸酯、半琥珀酸酯、苯甲酸酯、二甲基氨基乙酸酯和磷酰氧基羰基衍生物；羟基官能团的二甲基甘氨酸酯、氨基烷基苯基酯、氨基烷基酯或者羧烷基酯。还包括羟基的氨基甲酸酯和碳酸酯衍生物。还包括的羟基衍生化为(酰氧基)甲基和(酰氧基)乙基醚，其中所述酰基含有任选被包括但不限于醚、氨基和羧酸官能的基团取代的烷基，或者其中所述酰基为氨基酸酯。还包括磷酸酯和膦酸酯、硫酸酯、磺酸酯，它们为烷基化形式(比如，二-新戊酰氧基甲基(POM)磷酸三酯或者-P(O)O2Et2)或者盐形式(比如磷酸酯钠(-P(O)O-2Na+2))。关于其它用于抗癌疗法中的前药和它们的代谢作用的其它实例，参见Rooseboom等人(2004)，Phamacol.Rev.，vol 56，53-102，其在此引入作为参考。当所述前药含有酸性或者碱性部分时，还可以将所述前药制备成它的药学上可接受的盐。
可以将本发明化合物配制成包括本发明化合物连同药学上可接受的载体的药物组合物，如以下部分IV所述。
III.生产二苯并二氮杂酮类似物的方法
A.发酵
在此使用的术语“生产法呢基二苯并二氮杂酮的微生物”和“法呢基二苯并二氮杂酮生产者”是指带有生产法呢基二苯并二氮杂酮所需的遗传信息的微生物，不论该有机体是否天然形成该化合物。该术语同样应用于当有机体在其自然环境中存在时，在其中发现形成法呢基二苯并二氮杂酮化合物的遗传信息的有机体，和适用于其中遗传信息通过重组工艺得到引入的有机体。
化合物通过分离小单孢菌属株046-ECO11和[S01]046的发酵肉汤得到形成，如USSN 10/762,107中所述，其全文在此引入作为参考。应当理解，化合物1的形成并不限于使用特定菌株046-ECO11和[S01]046。而是可以使用其它形成ECO-4601的有机体，比如可以通过已知方法由该有机体衍生得到的046-ECO11和[S01]046的变种或者变体，所述方法比如X-射线辐照、紫外线照射、氮芥子气处理、噬菌体曝置和抗生素抗性选择等等；或者通过利用重组细胞遗传工程工艺。例如，参见Manual of Industrial Microbiology and biotechnology，Demain和Solomon，American Society for Microbiology，WashingtonD.C.，1986；Hesketh等人(1997)，J.Antibiotics，vol 50，no 6，532-535；和Hosoya等人(1998)，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，vol42，no 8，2041-2047，其全部内容在此引入作为参考。
所述法呢基二苯并二氮杂酮化合物可以通过多种微生物进行生物合成。可以合成法呢基二苯并二氮杂酮化合物的微生物包括但不限于放线菌目细菌(也称为放线菌)。属于放线菌属成员的非限制性实例包括诺卡氏菌属、地嗜皮菌属、游动放线菌属、小单孢菌属、类诺卡氏菌属、糖丝菌属、拟无枝菌酸菌、Kutzneria、糖单孢菌属、糖多孢菌、Kitasatospora、链霉菌属、小双孢菌属、链孢子囊菌属和马杜拉放线菌属。放线菌的分类非常复杂以及可以合成本发明化合物的属参见Goodfellow，Suprageneric Classification of Actinomycetes(1989)；Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology，Vol.4(Williams和Wilkins，Baltimore，pp.2322-2339)；和Embley和Stackebrandt，“Themolecular phylogeny and systematics of the actinomycetes”，Annu.Rev.Microbiol.(1994)48：257-289。所述参考文献的全部内容都在此引入作为参考。
将形成法呢基二苯并二氮杂酮的微生物培养在含有已知的放线菌营养源的培养介质中。该介质具有可吸收的碳源、氮源加上任意的无机盐和其它已知的生长因子，pH值为约6～约9。适宜的介质包括但不限于提供于表1中的生长介质。在约18℃～约40℃的培养温度下将微生物培养约3～40天。
表1
用于化合物1生产的发酵介质的实例组分 QB MA KH RM JA FA XX CL
pH*1 7.2 7.5 7 6.85 7.3 7.0 7.0 7.0
葡萄糖 12 10 10 10
蔗糖 100
生蔗废糖蜜 15
玉米淀粉 30
可溶性淀粉 10 25
马铃薯糊糖 20 40 20 20
淀粉糖浆干粉 5
玉米浆 5 15
干酵母 2
酵母提取物 5 8.34
麦芽提取物 35
PharmamediaTM 10 15
甘油 30 20
NZ-胺A 5 10
大豆粉 15
鱼粉 10
细菌蛋白胨 2.5 5
MgSO4·7H2O 1
CaCO3 4 1 2 2 3 2
NaCl 5
(NH4)2SO4 2 2
K2SO4 0.25
MgCl2·6H2O 10
Na2HPO4 3
酪蛋白氨基酸 0.1
Proflo oilTM(mL/L) 4 0.05
硅质去沫油(mL/L) 0.3
MOPS 21
痕量元素溶液*2ml/L 2
除非另有说明，所有成分的单位都是g/L。
*1在加入CaCO3之前对所标记的pH值进行调节。
*2痕量元素溶液含有：每升中含有ZnCl240mg；FeCl3·6H2O(200mg)；CuCl2·2H2O(10mg)；MnCl2·4H2O；Na2B4O7·10H2O(10mg)；(NH4)6MO7O24·4H2O(10mg)。
可以通过利用搅拌培养接种的培养介质，对用法呢基二苯并二氮杂酮-形成微生物接种的培养介质进行通气，例如，在旋转摇瓶机上振摇、振摇水浴或者在发酵器中。通风还可以通过在培养期间，将空气、氧或者适当的气体混合物注入到受接种的培养介质中得到实现。在培养之后，可以通过本领域熟练技术人员和/或在此公开的工艺将法呢基二苯并二氮杂酮化合物从受培养的培养介质中提取和分离出来，所述工艺包括例如离心、色谱法、吸附、过滤。例如，所述受培养的培养介质可以任选进行酸化和用适宜的有机溶剂混合，所述有机溶剂比如甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、乙酸正丁酯或者4-甲基-2-戊酮。所述有机层可以通过例如离心和倾滤或者过滤从菌丝体滤饼中得到分离。任选进一步用有机溶剂对菌丝体滤饼进行提取，和将有机提取物合并。任选进一步对有机层进行处理，例如通过水洗涤、沉淀和过滤等等进行处理，随后例如通过真空下蒸干除去溶剂。可以任选用例如水、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、甲醇或者其混合物对所得残余物进行重构，和在二相系统中用适宜的有机溶剂对其进行再提取，所述有机溶剂比如己烷、四氯化碳、二氯甲烷或者其混合物。在除去溶剂之后，可以通过使用标准工艺对所得化合物进行进一步纯化，所述标准工艺比如正相和反相液相色谱法、结晶、升华、吸附、质量排阻色谱法等等。
B.化学修饰：
如本文所述和加拿大专利2,466,340(和PCT/CA04/000069)中所述，对法呢基二苯并二氮杂酮化合物1进行微生物生物合成和分离。对化合物1进行任意和/或直接化学修饰，从而形成为衍生物或者结构类似物的化合物。具有类似官能活性的上述衍生物或者结构类似物都在本发明的范围之内。可以利用本领域已知的方法和在此所述的方法，通过一个或者多个化学修饰步骤对法呢基二苯并二氮杂酮进行修饰。化学修饰方法的实例还提供于实施例4～8中。
为化合物1衍生物的二苯并二氮杂酮类似物，例如那些在此确定为式I化合物和它们的衍生物的类似物，和化合物2～27通过标准有机化学方法得到形成。制备和处理在此所述化合物(包括官能部分、反应性和一般记录)所需的有机化学一般原则描述在例如“AdvancedOrganic Chemistry”，第四版，Jerry March(1992)，Wiley-Interscience，USA中，其全部内容在此引入作为参考。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此所述的合成方法可以利用多种保护基，不论是否对它们进行了明确描述。在此使用的“保护基”是指用于阻断一个或者多个官能部分(比如包括氧、硫或者氮的活性基团)，从而使得反应可以选择性地在多官能化合物的另一活性位置进行的部分。使用保护基团、它们适用的具体官能团和它们的应用的一般原则，例如，描述在T.H.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，第三版，John Wiley & Sons，New York(1999)中，其全部内容在此引入作为参考。
如果必要，醇和酚用例如以下基团进行保护：甲硅烷基醚(TMS：三甲代甲硅烷基，TIPS：三异丙基甲硅烷基)、缩醛(MOM：甲氧基甲基，BOM：苄氧基甲基)、酯(乙酸酯，苯甲酰基)和醚(Bn：苄基)。醇在以下条件下进行去保护，比如：对于甲硅烷基醚使用TBAF(四丁基氟化铵)，对于缩醛和酯进行酸性水溶液催化作用，对于酯进行皂化反应，和对于Bn和BOM进行氢解。如果必要，使用标准氨基酸保护基团对胺进行保护，例如，氨基甲酸酯(比如叔丁基(BOC)和苄基(CBZ))、芴衍生物(比如FMOC：N-(9-芴甲氧基羰基)-)等等。对胺进行去保护的条件为，比如：对于BOC进行酸性水解，对于CBZ进行氢解，或者对于FMOC进行碱处理。所有的保护和去保护条件都表明在以上Greene等人的参考文献中。
本领域熟练技术人员将轻易理解，可以使用多种合成化学方法生产化合物1的衍生物。以下方案是用于形成本发明化合物的常规化学修饰的例证性方案。提供在此所述结构的领域的熟练技术人员已知的任何化学合成方法都可以使用，由此它们都包括在本发明中。
方案1：醇修饰(O-酰基化)
其中，R”为醋酸根。
在方案1中，当酚醇与活化羧酸(R”C(O)X)(比如酰基卤、酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺酯或者通过偶联剂(例如：EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-二异丙基乙基碳二亚胺盐酸盐)；或者HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐))用碱(例如，吡啶或者N，N-二异丙基乙胺(DIPEA))以及比如HOBt(1-羟基苯并三唑水合物)和/或DMAP(4-(二甲基氨基)吡啶)的任选催化剂进行活化的羧酸反应时，酚醇转化为酯。相同的反应可以在通过法呢基修饰反应形成的醇上实现(方案3)。
方案1用于，例如，由化合物1获得化合物25；和用于形成本发明化合物的酯。
方案2：胺修饰(N-烷基化)
其中，R选自任选取代的直链C1-10烷基。
在方案2中，对5位(关于位置，参见实施例3)上的胺基进行烷基化。在方案2(a)中，利用RX烷基化试剂(比如二烃基硫酸盐和卤代烃)，优选在碱(例如，碳酸氢钠和吡啶等等)存在下对胺进行烷基化。
方案2用于，例如，由化合物1制备化合物2～13，和由化合物23制备化合物14；和用于制备含有N-烷基的任意式I化合物。
方案3：双键修饰
其中Rz为OC1-6烷基。
在方案3中，双键通过以下方式进行修饰：(a)氢化；和(b)氢化烷氧基化。在(a)中，使用氢源(例如氢气、甲酸)和催化剂(比如铑、铂或者钯)进行氢化。在(b)中，对双键的亲电加成通过以下方法实现：通过在酸性条件(例如，对甲苯磺酸和烷基硫酸盐/NaHCO3/MeOH等等)下加入质子形成碳正离子，和用醇(C1-6烷醇，氢化烷氧基化)捕获碳正离子。
方案3用于获得，例如：在(a)中，由化合物1获得化合物23，和由化合物2获得化合物14～16；在(b)中，由化合物2获得化合物17～19，和由化合物3获得化合物20～22。方案3(a)和(b)还用于形成式I化合物的任何氢化和氢化烷氧基化法呢基衍生物。
方案4：芳香取代
其中，X为Br。
在方案4中，通过芳香取代(溴化)对芳基进行修饰。溴化剂包括溴、N-卤代酰胺(例如，N-溴琥珀酰亚胺(NBS)、四烷基多卤代铵)。
方案4用于由化合物1制备化合物24，由化合物2制备化合物26和由化合物14制备化合物27。
前药通过比如描述在Jerry March，supra中的常规的化学修饰进行制备，包括通过酯化(方案1)和烷基化反应，即，利用活化的酸或者混合酸酐(酰基卤化物，使用偶联试剂等等)，和通过使用烷基化试剂(R-X，其中X为离去基团，比如重氮基，和R为期望的基团)进行制备。磷酸盐前药通过磷酸化作用进行制备，例如，使用二烷基亚磷酸酯，利用比如Silverberg等人(1996)，Tet.Lett，Vol.37，711-774，美国专利5,561,122(Pettit等人)和Hwang和Cole(2004)，Org.Lett，vol 6，no 10，1555-1556(得自于(POM)2磷酰氯的(POM)2磷酸三酯)中所述的方法进行制备，其全部内容在此引入作为参考。
IV.含有本发明化合物的药物组合物
本发明提供含有结合药学上可接受的载体的本发明化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂化物或者前药的药物组合物。含有二苯并二氮杂酮类似物的药物组合物可以用于治疗与无控细胞生长和增殖相关的疾病和病症(比如，瘤形成症状)。所述药物组合物还可以用于治疗其它疾病和病症，包括炎症、自身免疫疾病、感染、神经变性疾病和紧张。可以将含有二苯并二氮杂酮类似物的药物组合物包装入适宜的商业包装中，该商业包装在适宜的容器中提供必要的物质，比如药物组合物和它用于治疗瘤形成症状的书面说明。
可以对本发明化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂化物或者前药进行配制，以用于治疗或者预防性治疗瘤形成和增殖疾病或者病症的口服、舌下、鼻内、眼内、直肠、透皮、粘膜、局部或者胃肠外给药方式。胃肠外给药模式包括但不限于真皮内、皮下(s.c.s.q.，sub-Q，Hypo)、肌内(i.m.)、静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)、动脉内、髓内、心内、关节内(关节)、滑膜内(滑液区域)、脑内或者颅内、脊柱内、脑池内和鞘内(脊髓液)给药模式。任何可用于药物制剂胃肠外注射或者输液的已知设备都可以用于实现所述给药。对于口服和/或胃肠外给药，可以将本发明化合物与常规的药物载体和赋形剂混合，并且可以以液剂、乳剂、片剂、胶囊、软凝胶剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂和板片剂等等的形式使用。含有本发明化合物的组合物将含有按重量计约0.1％～约99.9％，约1％～约98％，约5％～约95％，约10％～约80％或者约15％～约60％的活性化合物。
在此公开的药物制剂根据标准方法进行制备，并且选择以降低、预防或者消除癌症的剂量给药。(对于用于人类治疗的多种试剂的给药方法的一般说明，参见，例如，Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Easton，PA；和Goodman和Gilman，Pharmaceutical Basis of Therapeutics，Pergamon Press，NewYork，NY，其全部内容在此引入作为参考。)
在此使用的术语“单位剂量”是指适于作为人类对象和其它哺乳动物的单位剂量的物理分离单位，每个单位含有经计算能产生期望的治疗作用的预定量二苯并二氮杂酮类似物以及适宜的药学上可接受的载体。在一种实施方案中，单位剂量含有10～3000mg活性成分。在另一种实施方案中，单位剂量含有20～1000mg活性成分。本发明组合物可以利用控释递送系统(例如，胶囊)或者缓释递送系统(例如，可生物侵蚀基体)进行递送。用于药物递送的适用于给药本发明组合物的例证性缓释递送系统描述于美国专利Nos 4,452,775(授于Kent)、5,039,660(授于Leonard)和3,854,480(授于Zaffaroni)中，其全部内容在此引入作为参考。
本发明药学上可接受的组合物包含与一种或者多种无毒、药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或助剂和/或赋形剂(它们在此都称为“载体”物质)联用的一种或者多种本发明化合物，并且如果期望，可以含有其它活性成分。药学上可接受的载体包括，例如溶剂、赋形剂或者介质，比如盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、丙二醇、聚山梨酸酯80(Tween-80TM)、聚(亚乙基)二醇300和400(PEG 300和400)、PEG化的蓖麻油(E.g.Cremophor EL)、泊洛沙姆407和188、疏水载体及其组合。疏水载体包括，例如，脂肪乳剂、脂肪、PEG化的phopholids、聚合物基体、生物相容聚合物、脂球、水泡、颗粒和脂质体。该术语明确排除细胞培养介质。
取决于例如药物的性质和给药模式，包含在制剂中的赋形剂或者添加剂具有不同的目的。通常使用的赋形剂的实例包括但不限于：稳定剂、增溶剂和表面活性剂、缓冲液、抗氧化剂和防腐剂、强壮剂、填充剂、润滑剂、乳化剂、悬浮或者粘稠剂、惰性稀释剂、填料、崩解剂、粘合剂、润湿剂、润滑剂、抗菌剂、螯合剂、甜味料、香料、增香剂、着色剂、给药助剂及其组合。
所述组合物可以含有一般载体和赋形剂，比如玉米淀粉或者凝胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸氢钙、氯化钠和藻酸。所述组合物可以含有crosarmellose钠、微晶纤维素、羟基乙酸淀粉钠和藻酸。
用于胃肠外给药的制剂可以为水或者非水等渗无菌注射液剂、混悬剂或者脂肪乳剂的形式，其中含有本发明化合物或者其药学上可接受的盐或者前药。用于注射的胃肠外形式必须是易于注射存在的流体。这些液剂或者混悬剂可以由无菌浓缩液体、粉剂或者粒剂进行制备。可以将所述化合物溶于比如溶剂或者赋形剂的载体中，例如聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、苄醇、四氢呋喃聚乙二醇醚、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、甘油、盐水、葡萄糖、水、甘油、疏水载体及其组合。
用于胃肠外制剂的赋形剂还包括但不限于稳定剂(例如碳水化合物、氨基酸和聚山梨酸酯)、增溶剂(例如溴化十六烷基三甲铵、多库酯钠、甘油单油酸酯、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙二醇(PEG))和表面活性剂(例如聚山梨酸酯、生育酚PEG琥珀酸盐泊洛沙姆和CremophorTM)、缓冲液(例如乙酸酯、柠檬酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、氨基酸等等)、抗氧化剂和防腐剂(例如BHA、BHT、龙胆酸、维生素E、抗坏血酸、和含硫试剂(比如亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、偏亚硫酸氢盐、硫代甘油、巯基乙酸盐等等))、强壮剂(用于调节生理相容性)、悬浮或者粘稠剂、抗菌剂(例如硫汞撒、氯化苄乙氧铵、苯扎氯铵、苯酚、甲酚和氯代丁醇)、螯合剂和给药助剂(例如局部麻醉药、消炎药、抗凝结剂、用于延长时间的血管收缩剂和增强组织渗透性的试剂)及其组合。
使用疏水载体的胃肠外制剂包括，例如，脂肪乳剂和含有脂肪、脂球、水泡、颗粒和脂质体的制剂。除了上述赋形剂之外，脂肪乳剂还包括脂肪和水相，以及添加剂，比如乳化剂(例如磷脂、泊洛沙姆、聚山梨酸酯和聚氧乙烯蓖麻油)和渗透剂(例如氯化钠、甘油、山梨醇、木糖醇和葡萄糖)。脂质体包括天然脂质体或者源于磷脂的脂质体，并且任选含有比如胆固醇的稳定剂。
在另一实施方案中，所述化合物的胃肠外单元剂型可以为在无菌、密封安瓿或者在无菌预负载注射器中的适宜载体中的即时使用化合物溶液。所述适宜的载体任选含有任何上述赋形剂。
另外地，本发明化合物的单元剂型可以为浓缩液体、粉剂或者颗粒形式，用于在递送时在适当的药学上可接受的载体中进行即时重构。除了上述赋形剂之外，粉剂形式任选含有膨胀剂(例如甘露醇、甘氨酸、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、羟乙基淀粉、聚蔗糖和凝胶)和低温或者溶解(lyo)保护剂。
例如，在静脉内(IV)使用中，可以将式I化合物和任选一种或者多种添加剂(包括增溶剂或者表面活性剂)的无菌制剂溶解或者悬浮在任何通常应用的静脉内流体中，和通过输注进行给药。静脉内流体包括但不限于生理盐水、磷酸盐缓冲盐水、5％葡萄糖或者Ringer’sTM溶液。
在另一实例中，在肌内注射制剂中，可以将本发明化合物或者适宜的可溶性盐或者形成所述化合物的前药的无菌制剂溶解在药物稀释剂(比如注射用水(WFI)、生理盐水或者5％葡萄糖)中并进行给药。可以将化合物的适宜的不溶性形式制备成水基或者药学上可接受的油基(例如长链脂肪酸酯，比如油酸乙酯)的混悬剂进行用药。
对于口服应用，固体剂型(比如片剂和胶囊)是特别有效的。还可以设计缓释或者全部包衣制剂。对于儿科和老年人应用，混悬剂、糖浆剂和咀嚼片剂是特别适宜的。对于口服给药，所述药物组合物为，例如片剂、胶囊、混悬剂或者液体糖浆剂或者酏剂、板片剂等等的形式。对于通常口服给药，赋形剂或者添加剂包括但不限于惰性稀释剂、填料、崩解剂、粘合剂、润湿剂、润滑剂、甜味料、增香剂、着色剂和防腐剂。
优选将口服药物组合物制备成含有治疗有效量的活性成分的单元剂型的形式。所述剂量单元的实例为片剂和胶囊。对于治疗学目的，除了活性成分之外，片剂和胶囊可以含有常规载体，比如：惰性稀释剂(例如，碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖)、粘合剂(例如，金合欢胶、淀粉、凝胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(Providone)、山梨醇或者西黄蓍胶甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和乙基纤维素)、填料(例如，磷酸钙、甘氨酸、乳糖、玉米淀粉、山梨醇或者蔗糖)、润滑剂(例如，硬脂酸镁或者其它金属的硬脂酸盐、硬脂酸、聚乙二醇、石蜡、油、二氧化硅和胶状二氧化硅、硅流体或者滑石)、崩解剂(例如，马铃薯淀粉、玉米淀粉和藻酸)、食用香料、着色剂或者可接受的润湿剂。载体还可以包括包衣赋形剂，比如单硬脂酸甘油酯或者二硬脂酸甘油酯，从而延迟在胃肠道中的吸收。
通常为水或者油液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂或者酏剂形式的口服液体制剂可以含有常规的添加剂，比如助悬剂、乳化剂、非水试剂、防腐剂、着色剂和增香剂。用于流体制剂的添加剂的实例包括阿拉伯胶、杏仁油、乙醇、分馏椰子油、凝胶、葡萄糖浆、甘油、氢化可食用脂肪、卵磷脂、甲基纤维素、甲基或者丙基对羟基苯甲酸酯、丙二醇、山梨醇或者山梨酸。
对于液体和固体口服制剂，还可以使用增香剂，比如胡椒薄荷、冬青油、樱桃、葡萄、水果调味剂等等。还可以合意地加入着色剂，从而使得剂型在外观上更为美观或者有助于区分产品。对于局部应用，还可以将本发明化合物制备成适宜的形式以应用到五官的皮肤或者粘膜上，并且可以采取乳膏剂、膏剂、液体喷雾剂或者吸入剂、锭剂或者喷口涂剂的形式。
这种局部制剂可以进一步包括比如二甲亚砜(DMSO)的化合物以促进活性成分的表面渗透。对于眼部或者耳部应用，本发明化合物可以以液体或者半液体的形式存在，在疏水或者亲水基中配制成膏剂、乳膏剂、洗剂、涂剂或者粉剂。对于直肠给药，可以将本发明化合物以与常规载体(比如可可脂、石蜡或者其它甘油酯)混合的栓剂形式进行给药。
V.在治疗瘤形成中的医药用途
在一方面，本发明涉及抑制哺乳动物中癌细胞生长和/或增殖的方法。在另一方面中，本发明提供了治疗哺乳动物瘤形成的方法。哺乳动物包括有蹄类(例如绵羊、山羊、牛、马、猪)和非有蹄类(包括啮齿类、猫科、犬科和灵长类动物(即人类和非人类灵长类动物))。在优选的实施方案中，所述哺乳动物是人类。
本发明的二苯并二氮杂酮类似物可以与其它与癌症相关的蛋白质和多肽结合或者相互作用，所述蛋白质和多肽包括但不限于致癌基因编码的多肽、诱发血管形成的多肽、涉及转移和/或侵入过程的蛋白质和调节细胞程序死亡和细胞周期的蛋白酶。不论作用机制如何，本发明的二苯并二氮杂酮类似物都已经证实在体外和体内具有抗癌活性。基于这些发现，本申请申请人开发了治疗瘤形成的方法。
在此使用的术语“瘤形成”、“瘤形成疾病”、“肿瘤形成”、“癌症”、“肿瘤”和“增殖疾病”是指具有自发增长能力的细胞，即，特征在于迅速增殖通常形成显著量的表现出部分或者完全缺少结构组织和与正常组织的官能配合的细胞生长的反常症状状态。该术语意指包括生血瘤形成(例如淋巴瘤或者血癌)以及固体瘤形成(例如肉瘤或者癌)，包括所有类型的癌前期和癌生长或者致癌过程，转移性组织或者恶性转化的细胞、组织或者器官，不论组织病理学的类型或者侵入阶段如何。生血瘤形成是影响免疫系统的生血结构(预形成血细胞相关的结构)和组分的恶性肿瘤，包括在骨髓、淋巴样或者红血球原生细胞系统的血癌(与血液和骨髓中的白细胞(白血球)和它们的前体相关)和淋巴瘤(涉及胸腺依赖性细胞)。固体瘤形成包括肉瘤，它是源于结缔组织(比如肌肉、软骨、血管、纤维组织、脂肪或者骨骼)的恶性瘤形成。固体瘤形成还包括癌，它是源于上皮结构(包括外部上皮(例如，胃肠道、肺和宫颈的表皮和内层)和排齐多种腺(例如，乳房、胰腺、甲状腺)的内部上皮的恶性瘤形成。对于本发明方法进行的治疗特别敏感的瘤形成的实例包括血癌和肝细胞癌、肉瘤、血管内皮癌、乳房癌、中枢神经系统癌症(例如星形细胞瘤、胶质肉瘤、成神经细胞瘤、少枝胶质瘤和恶性胶质瘤)、前列腺癌、肺和支气管癌、喉癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃肠癌、黑素瘤、卵巢和子宫内膜癌、肾和膀胱癌、肝癌、内分泌腺癌(例如甲状腺)和胰腺癌。
使二苯并二氮杂酮类似物与癌细胞或者组织接触或者将其引入到癌细胞或者组织中。通常，本发明用于体内递送本发明组合物的方法使用本领域认可的递送治疗剂的方案，唯一的实质性程序变型是使用本发明二苯并二氮杂酮类似物替换本领域认可的方案中的治疗剂。二苯并二氮杂酮类似物以及制剂、载体或者赋形剂的给药途径将取决于瘤形成的位置以及类型。可以使用多种给药途径。二苯并二氮杂酮类似物可以通过静脉内或者腹膜内输液或者注射进行给药。例如，对于可以进入的固体瘤，可以通过注射直接将本发明化合物给药到瘤中。对于生血瘤，可以静脉内或者血管内给药所述组合物。对于不易于体内进入的瘤，比如转移或者脑肿瘤，可以以一定方式给药所述化合物，使得它可以经哺乳动物体内进行系统运送并且从而达到瘤和遥远的转移位置，例如鞘内、静脉内或者肌内或者口服给药。另外地，可以直接将所述化合物给药至肿瘤。所述化合物还可以进行皮下、腹膜内、局部(例如对于黑素瘤)、直肠(例如结肠直肠瘤形成)、阴道(例如对于子宫颈或者阴道瘤)、经鼻或者通过吸入喷雾剂(例如对于肺瘤形成)给药。
二苯并二氮杂酮类似物以足以抑制瘤形成细胞生长或者增殖的量或者足以治疗瘤形成疾病的量进行给药。术语“抑制”是指压制、杀死、停滞或者破坏癌细胞。根据本发明方法对哺乳动物癌细胞进行的抑制可以通过数种方式进行监控。可以相对于不存在所述化合物进行培养的相同细胞，用所述化合物对体外癌细胞生长进行处理，和监控其生长或者死亡。停止生长或者放慢生长率(即，两倍速率)(例如在100微摩尔时降低50％或更多)即表现出癌细胞抑制作用(参见Anticancer Drug Anticancer Drug Development Guide：preclinicalscreening，clinical trials and approval；B.A.Teicher和P.A.Andrews主编，2004，Humana Press，Totowa，NJ)。另外地，癌细胞抑制作用可以通过将化合物给药至具有关心的癌症的动物模型进行监控。非人类动物癌症模型的试验实例是本领域所熟知的，在以下和本文的实施例中将进行描述。相对于没有用化合物处理的对照动物，在用化合物处理的动物中肿瘤停止生长(即，在大小上不会进一步增加)或者肿瘤大小降低(即，肿瘤大小降低58％)即表现出显著的肿瘤生长抑制作用(参见Anticancer Drug Development Guide：preclinical screening，clinical trials and approval；B.A.Teicher和P.A.Andrews主编，2004，Humana Press，Totowa，NJ)。
术语“治疗”是指将二苯并二氮杂酮类似物应用或者给药至患有瘤形成疾病、瘤形成疾病症状或者倾向于患有瘤形成疾病的哺乳动物，或者将二苯并二氮杂酮类似物应用或者给药至患有瘤形成疾病、瘤形成疾病症状或者倾向于患有瘤形成疾病的哺乳动物的分离组织或者细胞系，目的是医治、治愈、缓和、减轻、改变、改善、改良或者控制疾病、疾病症状或者患有疾病的倾向。术语“治疗”的定义是给药哺乳动物足以导致预防、降低或者消除哺乳动物中瘤形成细胞的作用的量(“治疗有效量”)的二苯并二氮杂酮类似物。所述治疗有效量和剂量定时将基于个体基础进行确定，并且可以至少部分基于考虑受体对象的年龄、体重、性别、饮食和通常健康状况，基于疾病症状的性质和严重程度以及基于先前治疗和存在的其它疾病进行确定。其它因素还包括给药的途径和频率、给药化合物的活性、新陈代谢稳定性、化合物的作用和代谢时间长度、药物联用、患者经受化合物的耐受性和瘤或者增殖疾病的类型。在一种实施方案中，治疗有效量的化合物为约0.01～约750mg/千克哺乳动物体重。在另一种实施方案中，治疗有效量为约0.01～约300mg/千克体重/天。在另一种实施方案中，治疗有效量为10～约50mg/千克体重/天。在人类患者的情形中，上述实施方案中的治疗有效剂量还可以表示为毫克每平方米(mg/m2)。不同哺乳动物种类之间的换算系数可以发现于：Freireich等人，Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse，rat，dog，monkey and man，Cancer Chemoth.Report，1966，50(4)：219-244，其全部内容在此引入作为参考。在可能要求特定需求(例如，对于儿童患者)时，如上所述的治疗有效剂量可以在在此所述的范围之外。这种较高或者较低剂量都包括在本发明范围内。
为了监控人类中进行肿瘤治疗的效果，在开始治疗之前和之后的肿瘤尺寸和/或肿瘤形态进行测量，如果肿瘤尺寸停止进一步生长或者如果肿瘤尺寸得到降低，则认为治疗有效，例如，降低至少10％或更多(例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者甚至100％，即不存在肿瘤)。生存延期、疾病随时间的发展、部分响应和目标响应率都是研究试剂的临床活性的替代测量。认为肿瘤皱缩是一种特殊的治疗响应。该系统受患者具有经得起精确测量的内脏质量的要求所限制。确定体内肿瘤尺寸的方法随肿瘤类型的变化而变化，并且包括多种医学成象或者肿瘤学领域技术人员熟知的成像工艺(MRI、CAT、PET等等)，以及组织学方法和流式细胞计。对于某些癌症类型，还利用对血清肿瘤标记物的评价评估响应(例如，用于前列腺癌的前列腺具体抗原(PSA)，和用于结肠癌的癌胚抗原(CEA))。其它监控癌症生长的方法包括血液中细胞计数(例如，血癌中)或者缓解骨骼疼痛(例如，前列腺癌)。
所述二苯并二氮杂酮化合物可以每日给药一次，或者所述化合物可以在一天之中以适当的时间间隔给药两个、三个、四个或者更多个亚剂量。在那种情形中，为了获得总每日剂量，必须将包含在各个亚剂量中的二苯并二氮杂酮化合物相应缩小。为了在数天进行递送，还可以对剂量单元进行复合，例如，利用常规的提供二苯并二氮杂酮化合物在数天时间内缓释的缓释制剂。缓释制剂是本领域所熟知的。在该实施方案中，剂量单元含有相应日剂量的倍数。所述有效剂量可以作为单个给药事件(例如，弹丸注射)进行给药，或者以缓慢注射或者输注进行给药(例如，在30分钟至约24小时的时间内)。作为一个疗程，所述化合物可以给药高达30天。此外，用治疗有效量组合物对对象进行的治疗可以包括单次治疗或者系列治疗(例如，四周疗程重复三次，各个疗程之间间隔两个月)。本发明包括的二苯并二氮杂酮化合物的有效剂量、毒性和体内半衰期的测定可以根据常规方法进行确定，或者基于利用适当动物模型的体内试验进行确定。
所述二苯并二氮杂酮化合物可以结合已知的其它抗癌疗法(比如放射疗法)或者其它已知的抗癌化合物或者化学治疗剂一起给药。所述治疗剂包括但不限于5-氟脲嘧啶、丝裂霉素C、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、氮烯唑胺、米托蒽醌、对氨茴环霉素(表柔比星和Doxurubicin)、依托泊甙、pregnasome、铂化合物(比如碳铂和顺氯氨铂)、紫杉醇(比如PaclitaxelTM和DocetaxelTM)；激素疗法，比如他莫昔芬和抗雌激素；受体抗体，比如赫赛汀和易瑞沙；芳香化酶抑制剂、妊娠前试剂和LHRH类似物；生物反应调节物，比如IL2和干扰素；多药转化试剂，比如环胞霉素类似物PSC 833。
二苯并二氮杂酮化合物的毒性和治疗效果可以通过标准药物方法在细胞培养或者试验动物中进行确定。治疗效果在如上所述的动物模型和本文所述的实施例中进行确定。进行毒性研究，以确定致死10％试验动物的剂量(LD10)。对动物进行治疗的最高耐药剂量(MTD)：不会导致死亡或者大于20％体重下降的最高剂量。在给定的肿瘤模型中，有效剂量(ED)与MTD的关系确定化合物的治疗指数。认为接近1.0的治疗指数(MTD/ED)对于一些化学治疗药物是可以接受的，对于传统的化学治疗药物，优选治疗指数为1.25或者更高。
由细胞培养测定法和动物研究获得的数据可以用于拟定用于人类的剂量范围。本发明组合物的剂量通常将位于包括MTD的循环浓度范围内。取决于所使用的剂型和所利用的给药途径，所述剂量可以在此范围内变化。对于任何用于本发明方法中的化合物，其治疗有效剂量可以首先根据细胞培养测定法进行确定。可以将剂量配制在动物模型中，从而获得所述化合物的循环血浆浓度范围。这些信息可以用于更精确地确定用于人类的有效剂量。在血浆中的水平可以通过例如HPLC进行测量。
确定化合物抗癌效果的动物模型通常在鼠中进行。或者将鼠肿瘤细胞皮下接种到相同种类的鼠的后肋中(同源模型)，或者将人类肿瘤细胞皮下接种到严重联合的免疫缺陷(SCID)鼠或者其它免疫缺陷鼠(裸鼠)中(异种移植模型)。
鼠遗传学的进展已经形成了许多用于研究各种人类疾病(包括癌症)的鼠模型。由国家癌症学会资助的MMHCC(人类癌症的鼠模型联合会)网页(emice.nci.nih.gov)提供了已知癌症模型的疾病特异位置概略，并且具有可搜索的癌症模型数据库(cancermodels.nci.nih.gov)的链接，以及NCI-MMHCC鼠贮藏室。鼠贮藏室还可以发现于：The Jackson Laboratory，Charles RiverLaboratories，Taconic，Harlan，Mutant Mouse Regional ResourceCenters(MMRRC)National Network和European Mouse MutantArchive。这些模型都可以用来进行二苯并二氮杂酮化合物的体内试验以及确定治疗有效剂量。
除了本发明化合物之外，所述化合物药学上可接受的盐、溶剂化物或者前药也可以用于组合物中治疗或者预防以上确定的疾病。
实施例
除非另作说明，所有试剂都购自于Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)，Aldrich。
所有的NMR光谱都在氘化溶剂中，在Varian 500TM光谱仪(1HNMR在500MHz，13C NMR在125MHz)上采集。UV和质谱利用连接在Waters MicromassTM ZQTM质量检测器上的光二极管矩阵检测器(PDA，210-400nm)，由Waters 2690TM HPLC进行采集。
除非另有说明，所用在说明书和权利要求中用于表达成分、性能的量的数字(比如分子量、反应条件、摩尔当量(eq)、结合和/或抑制百分数、GI50、IC50等等)都应当理解为，在所有情形中，都由术语“约”进行修饰。据此，除非相反说明，在本发明说明书以及附属权利要求中所述的数值参数都是近似值。最低限度，而不是意图限制权利要求范围的等价物原则的应用，各个数值参数至少应当根据其有效数字和应用的一般整数方法进行推断。尽管在本发明宽泛范围内所列的数值范围和参数都是近似值，但是列于实施例、表和图中的数值都尽可能精确地进行了记录。任何数值都可能固有地含有某些源于试验变化、试验测定和统计分析等等地误差。
在以下部分中，实施例详细描述了本发明代表性化合物的化学合成。所述方法为例证性说明，不应当认为本发明限于它们所述的化学反应和条件。并没有试图最优化在这些反应中获得的产率，对于本领域熟练技术人员很显然反应时间、温度、溶剂和/或试剂的变化可以升高产率。
此外，所述物质、方法和实施例(包括体外和体内效果、生物利用度、毒性和药理学性能)仅仅是例证性说明，并不意图对其进行限制。虽然与本文中所述相似或者等价的方法和物质可以用于本发明实践或者试验中，但是适宜的方法和物质描述如下。所有在此提及的出版物、专利申请、专利和其它参考文献的全部内容都在此引入作为参考。发生冲突时，由本发明说明书(包括定义)控制准确度。
实施例1：通过发酵进行的化合物1的生产
例证性的发酵方法：
a)发酵方法
将小单孢菌属种(贮藏登记号IDAC 070303-01)(参见保藏存活证明：保藏日：2003年3月7日；微生物分类：3005-3P；加拿大国际微生物保藏中心)保持在ISP2琼脂的琼脂板(Difco Laboratories，Detroit，Ml)上。通过将表面生长的小单孢菌属种从琼脂板转移到含有25mL用一升自来水(pH值7.0)制备的包括葡萄糖10g、马铃薯糊精类IV(Sigma)20g、酵母提取物5g、N Z Amine-A 5g、1g CaCO3的无菌介质的125mL烧瓶中，对用于生产阶段的接种体进行制备。在大约28℃下，在设置为250rpm的旋转振荡器上培养大约70～72小时。在培养之后，将10mL培养物转入含有600mL包含20g/L马铃薯糊精类IV(sigma)、30g/L甘油、2.5g/L Bacto-蛋白胨、8.34g/L酵母提取物、3g/L CaCO3、pH 7.0的无菌生产介质的2L挡板烧瓶中。通过在设置为250rpm的旋转振荡器上在28℃下将培养物培养5天，对发酵肉汤进行制备。
b)替代方法：
利用提交于2004年1月21日的CA专利申请2,466,340中所述的改良方法，发酵作用可以在14.5L发酵器(BioFlo 110TM发酵器，NewBrunswick Scientific，Edison，NJ，USA)中实现，为1×10L批次。
将小单孢菌属种(贮藏登记号IDAC 070303-01)保持在ISP2琼脂的琼脂板(Difco Laboratories，Detroit，Ml)上。通过将表面生长的小单孢菌属种从琼脂板转移到含有500mL用一升自来水(pH值7.0)制备的包括10g葡萄糖、20g马铃薯糊精、5g酵母提取物、5g N ZAmine-A和1g CaCO3的无菌介质的2L烧瓶中，对用于生产阶段的接种体进行制备。在大约28℃下，在设置为250rpm的旋转振荡器上将培养物培养大约70小时。在培养之后，将300mL培养物转入含有10L无菌生产介质的14.5L发酵器中。每升生产介质都包括20g马铃薯糊精、30g甘油、2.5g Bacto-蛋白胨、8.34g酵母提取物、0.3mL硅氧烷消泡剂油(Chem Service)、0.05ml Proflo oilTM(Traders protein)和3g CaCO3，用蒸馏水制备成一升并且调节pH值为7.0。在28℃下，控制溶解氧气(dO2)为25％，在320-600RPM之间变化的搅拌串级回路下和设置为0.5v/v/m固定速率的通风条件下，对培养物进行培养。
除了上述介质之外，其它用于通过发酵生产化合物1的优选介质提供于表1中(QB、MA、KH、RM、JA、FA、CL)。小单孢菌属种046-ECO11或者[S01]046的任何一种都可以用于这些例证性的方法中。
实施例2：化合物1的分离
例证性的分离方法：
a)分离方法1：
将500mL乙酸乙酯加入到如以上实施例1所制备的500mL发酵肉汤中。在定轨振荡器上在200rpm下将上述混合物搅拌30分钟，从而形成乳液。通过离心和倾析将各相分离。将4～5g无水MgSO4加入到有机相中，然后将其过滤并且在真空中将溶剂除去。
在水(300mL)中，将2L发酵物的乙酸乙酯提取物与HP-20树脂(100mL；Mitsubishi Casei Corp.，Tokyo，Japan)混合。在真空中将乙酸乙酯除去，在布氏漏斗上对树脂进行过滤并且将滤液除去。然后对吸附的HP-20树脂顺序用2×125mL 50％乙腈水溶液、2×125mL 75％乙腈水溶液和2×125mL乙腈进行洗涤。
将含有化合物1的组分蒸干，并且将其中100mg溶解在5mL由氯仿、环己烷、甲醇和水按体积比例为5∶2∶10∶5的比例制备的混合物的上相中。利用装配有200mL柱体和预装有该二相系统上相的高速逆流色谱法(HSCC)系统(Kromaton Technologies，Angers，France)对该样品进行离心分配色谱分离。HSCC按较低相移动方式运行，和化合物1在大约一半柱体积时得到洗脱。对馏分进行收集，在市售Kieselgel 6OF254板上通过小份馏分的TLC对化合物1进行检测。可以通过以下方式对化合物进行显像观察：在UV光线下对干片进行检查，或者用含有香草醛(0.75％)和浓硫酸(1.5％，v/v)的乙醇溶液的喷雾剂对板进行喷雾，和随后加热该板。该馏分含有基本上纯的化合物1，不过是高度有颜色的。暗黄色样品可以通过色谱法在HPLC上按照如下方式获得。
将6mg样品溶于乙腈中并且将其注射入制备HPLC柱(XterraTMODS(10μm)，19×150mm，Waters Co.，Milford，MA)中，流速为9mL/min和在300nm下进行UV峰值检测。该柱用乙腈/缓冲液(5mMNH4HCO3)根据下表2中所示梯度进行洗脱。
表2
制备HPLC梯度 时间(min) 水(％) 乙腈(％)
0 10 20 25 30 50 0 0 50 50 50 100 100 50 50
对含有化合物1的组分进行合并、浓缩和冷冻干燥，从而得到3.8mg化合物的收率。
b)分离方法2：
化合物1还可以利用以下替代方案进行分离。在培养期结束时，对得自于实施例1的挡板烧瓶的发酵肉汤进行离心分离，将上清液从含有细菌菌丝体的丸粒中倾倒出来。将100mL 100％MeOH加入到菌丝体丸粒中，将所得样品搅拌10分钟并且将其离心15分钟。将甲醇上清液倾倒出并且对其进行储存。然后，将100mL丙酮MeOH加入到菌丝体丸粒中，搅拌10分钟然后将其离心15分钟。将丙酮上清液倾倒出，并且将其与甲醇上清液合并。最后，将100mL 20％MeOH/H2O加入到菌丝体丸粒中，搅拌10分钟并且将其离心15分钟。将所得上清液与丙酮和甲醇上清液合并。
将合并的上清液加入到在1000mL水中的400ml HP-20树脂中并且在真空中将有机物除去。将所得浆液滤过布氏漏斗并且将所得滤液除去。先后用2×500mL 50％MeOH/H2O、2×500mL 75％MeOH/H2O和2×500mL MeOH对HP-20树脂进行洗涤。
分别对每次洗涤进行收集，并且通过如上所述的TLC对其进行分析。将这些含有化合物1的馏分蒸发至接近干燥，并且对其进行冷冻干燥。将冻干物溶于甲醇中并且将其注射入制备HPLC柱(XterraTMODS(10μm)，19×150mm，Waters Co.，Milford，MA)中，流速为9mL/min和在300nm下进行峰值检测。
该柱用乙腈/缓冲液(5mM NH4HCO3)根据下表3中所示梯度进行洗脱。
表3
制备HPLC梯度 时间(min) 缓冲液(％) 乙腈(％)
0 15 20 30 35 95 45 5 5 95 5 55 95 95 5
对含有化合物1的组分进行合并、浓缩和冷冻干燥，从而得到约33.7mg化合物。
c)分离方法3：
用等体积乙酸乙酯对由实施例1得到的10升全肉汤进行两次提取，将两次提取物合并并且将其浓缩至干燥。对干燥的提取物称重，对于每克干燥提取物，加入100mL MeOH-H2O(2∶1v/v)和100mL己烷。对上述混合物进行温和地涡旋，使其充分实现溶解。将两层分离，所得水层用100mL己烷进行洗涤。将两个己烷层合并，合并的己烷溶液用100mL甲醇∶水(2∶1，v/v)进行洗涤。将两个甲醇：水层合并并且用200mL EtOAc和400mL水进行处理。将各层分离，所得水层进一步用200mL份的EtOAc提取两次。将EtOAc层合并并且对其进行浓缩。由此获得的残余物(220mg)适于通过如上所述的HSCC或者通过HPLC进行最后纯化。当与用于(a)或者(b)中的提取记录进行比较时，该提取工艺的纯度高十倍。
实施例3：化合物1结构的说明
化合物1的主要同位素的计算分子量(462.25)和分子式(C28H34N2O4)通过质谱分析进行确认：负离子化得到461.2的(M-H)-分子离子和正离子化得到463.3的(M+H)+分子离子。UVmax确定为230nm，同时在290nm处存在肩峰。
NMR氢和碳光谱分析示于表4中。溶于含有质子、碳和多元脉冲序列gDQCOSY、gHSQC、gHMBC和NOESY的MeOH-d4中，对NMR数据进行收集。在结构确定中，在化合物1的2D光谱中的多个交叉峰是关键。例如，在gHMBC试验中，法呢基链被置于酰胺氮上的情况由该链位于4.52ppm的末端亚甲基的质子信号与位于170ppm的酰胺羰基碳之间的强交叉峰所引起。在NOESY光谱中，该结论由位于4.52ppm的相同亚甲基信号和四取代苯环的两个质子中的一个质子的位于6.25ppm的芳香质子信号之间的交叉峰证实。质子和碳信号的归属示于表4中。
表4
化合物1在MeOH-D4中的1H和13C NMR(δH，ppm)数据 归属 1H 13C 基团
1 2 3 4 4a 5a 6 7 8 9 9a 11 11a 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 8’ 9’ 10’ 11’ 12’ 1” 2” 3” 7.15 6.74 6.83 - - - - 6.20 - 6.25 - - - 4.52 5.35 - 2.03 2.08 5.09 - 1.95 2.02 5.06 - 1.64 1.72 1.59 1.55 122.3 121.0 116.9 146.0 142.0 126.0 148.2 100.0 153.0 101.0 135.0 170.0 125.0 48.7 121.1 138.5 39.5 26.7 124.1 135.0 39.6 26.3 124.4 130.9 24.8 15.5 14.9 16.5 CH CH CH C-OH C C C-OH CH C-OH CH C C(O) C CH2 CH C CH2 CH2 CH C CH2 CH2 CH C CH3 CH3 CH3 CH3
基于质谱、UV和NMR光谱学数据，可以确定该化合物的结构为以上所示的化合物1的结构。
实施例4：二烷基硫酸酯化反应
a)化合物2和18的合成和结构说明
化合物2，即10-法呢基-4，6，8-三羟基-5-甲基-5，10-二氢-二苯并[b，e][1，4]二氮杂-11-酮，和
化合物18，即10-(7-甲氧基-3，7，11-三甲基十二-2，10-二烯基)-4，6，8-三羟基-5-甲基-5，10-二氢-二苯并[b，e][1，4]二氮杂-11-酮，被制备和确认如下：
制备：
将化合物1(500.0mg)溶于甲醇(MeOH，20mL)中，并且在室温下将其与硫酸二甲酯(0.5mL)和NaHCO3(250mg)一起搅拌48小时。通过加入水将上述反应混合物稀释至200mL并且用乙酸乙酯(EtOAc，300mL×3)对其进行提取。将有机层分离并且在真空下对其进行干燥，将其再溶于甲醇中并且滤过0.45μm 13mm AcrodiscTMGHP针筒式滤器。在连接在光二极管矩阵检测器的Waters HPLC上对所得滤液进行分离。通过在Nova-PackTM HR C18 6μm25×200mm柱上进行多重注射(20mL/min，H2O/CH3CN梯度80∶20-30∶70，0-8min；30∶70-0∶100，8-18min)，化合物18(12.1mg)和化合物2(308.5mg)得到分离，分别在14.5和16.8min时得到洗脱。
化合物2和18的结构说明：
化合物2的主要同位素的计算分子量(476.27)和分子式(C29H36N2O4)通过质谱分析进行确认：负离子化得到475.6的(M-H)-分子离子和正离子化得到499.4的(M+Na)+分子离子。NMR氢和碳光谱分析示于表5中。基于化合物1的结构知识，可以很容易地确定信号的归属。化合物18的主要同位素的计算分子(508.29)和分子式(C30H40N2O5)量通过质谱分析进行确认：负离子化得到507.3的(M-H)-分子离子和正离子化得到509.3的(M+H)+分子离子。如表5中所示，通过将甲醇加入到法呢基链上得到的特征N-甲基(信号5)、甲氧基(信号7’-OMe)和亚甲基(6’)易于明确归属。
表5
化合物2和18在MeOH-D4中的NMR(δ，ppm)数据 归属 化合物2 化合物18 基团
1H 13C 1H
1 2 3 4 4a 5-N-Me 5a 6 7 8 9 9a 11 11a 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 7’OMe 8’ 9’ 10’ 11’ 12’ 1” 2” 3” 7.21 7.14 7.02 - - 2.92 - - 6.22 - 6.34 - - - 4.83，4.58 5.44 - 2.07b 2.12b 5.10 - N/A 1.95b 2.04b 5.07 - 1.65 1.78 1.60 1.55 122.1 127.3 118.4 152.6 139.3 41.1 125.4 154.8 99.6 156.8 101.4 142.0 168.2 133.5 47.7 119.8 139.3 39.5 26.2 123.8 135.1 N/A 39.8 26.8 124.3 130.8 24.9 15.8 15.1 16.6 7.21 7.14 7.02 - - 2.93 - - 6.20 - 6.34 - - - 4.89，4.57 5.42 - 2.06 1.42 1.42 - 3.13 1.42 1.93 5.12 - 1.68 1.77 1.10 1.60 CH CH CH C-OH C N-CH3 C C-OH CH C-OH CH C C(O) C CH2 CH C CH2 CH2 CH(CH2)a C OCH3 CH2 CH2 CH C CH3 CH3 CH3 CH3
N/A：不适用，在分子中不存在该基团
a.化合物2中的CH，化合物18中的CH2
b.4’、5’、8’和9’的信号非常接近；基于化合物1确定归属
b)化合物3、21和22的合成和结构说明
化合物3：10-法呢基-4，6，8-三羟基-5-乙基-5，10-二氢-二苯并[b，e]1，4]二氮杂-11-酮；
化合物21：10-(11-甲氧基-3，7，11-三甲基-2，6-十二烷二烯基)-4，6，8-三羟基-5-乙基-5，10-二氢-二苯并[b，e][1，4]二氮杂-11-酮；
化合物22：10-(7，11-二甲氧基-3，7，11-三甲基-2-十二烯基)-4，6，8-三羟基-5-乙基-5，10-二氢-二苯并[b，e][1，4]二氮杂-11-酮；
制备：
在室温下，在硫酸二乙酯(2.0mL)和NaHCO3(99.9mg)的甲醇(2mL)混合物中，将化合物1(85.3mg)搅拌72小时。将所得混合物滤过0.45μm13mm AcrodiscTM GHP针筒式滤器。通过制备HPLC，在NovaPackTM HR C-18 25×200mm柱(20mL/min，H2O/CH3CN梯度80∶20-30∶70，0-8min；30∶70-0∶100，8-18min)上进行多重注射，对上述溶液进行纯化，从而得到四个主峰：化合物3(20.0mg，含有一些杂质，RT：16.6min)，化合物21(17.54mg，RT：14.3min)和化合物22(7.82mg，RT：12.6min)。含有化合物21和22的非乙基化类似物的馏分还分别得到了分离，其量分别为5.65mg(RT：11.6min)和2.20mg(RT：10.3min)。使用相同柱(20mL/min，H2O/CH3CN梯度80∶20-30∶70，0-8min；30∶70-0∶100，8-18min，曲线7)对含有化合物3的馏分进行进一步纯化，从而得到基本上纯的化合物3(13.85mg，RT：17.9min)。
化合物3、21和22的结构说明：
化合物3的主要同位素的计算分子量(490.28)和分子式(C30H38N2O4)通过质谱分析进行确认：负离子化得到489.3的(M-H)-分子离子和正离子化得到491.3的(M+H)+分子离子。基于化合物1和2的结构知识，可以很容易地确定质子NMR信号的归属。特征N-乙基(5-N-Et)很容易确定归属，如表6中所示。
化合物21的主要同位素的计算分子量(522.31)和分子式(C31H42N2O5)通过质谱分析进行确认：负离子化得到521.3的(M-H)-分子离子和正离子化得到523.5的(M+H)+分子离子，和491.3的(M+H-HOCH3)+分子离子的片段。通过将甲醇加入到法呢基链上得到的特征N-乙基(5-N-Et)和甲氧基(11’-OMe)以及亚甲基(10’)基团很容易确认归属，如表6中所示。
化合物22的主要同位素的计算分子量(554.34)和分子式(C32H46N2O6)通过质谱分析进行确认：负离子化得到553.4的(M-H)-分子离子和正离子化得到555.4的(M+H)+分子离子，和分别具有523.5和491.3的(M+H-HOCH3)+和(M+H-HOCH3-HOCH3)+分子离子的片段。通过将两个甲醇分子加入到法呢基链上得到的特征N-乙基(5-N-Et)和甲氧基(7’-OMe和11’-OMe)基团很容易确认归属，如表6中所示。发现亚甲基基团(5’、6’、8’、9’和10’)全部具有类似的化学位移，这与饱和烷基一致。
表6
化合物3，21和22在MeOH-D4中的1H NMR(δH，ppm)数据 归属 3 21 22 基团
1 2 3 5-N-Et(C1) 5-N-Et(C2) 7 9 1’ 2’ 4’ 5’ 6’ 7’-OMe 8’ 9’ 10’ 11’-OMe 12’ 1” 2” 3” 7.20 7.13 7.02 3.23，3.15 1.07 6.22 6.34 4.58，4.56 5.41 2.06 2.11 5.10 N/A 1.95 2.04 5.07 N/A 1.65 1.77 1.60 1.55 7.20 7.14 7.03 3.23.3.15 1.09 6.22 6.34 4.82，4.56 5.41 2.07 2.13 5.11 N/A 1.95 1.38 1.38 3.13 1.08 1.78 1.10 1.08 7.20 7.14 7.03 3.24，3.16 1.09 6.22 6.34 4.91，4.54 5.38 2.05 ** ** 3.17 ** ** ** 3.12 1.14 1.78 1.10 1.14 CH CH CH CH2 CH3 CH CH CH2 CH CH2 CH2 CH(CH2)a OCH3 CH2 CH2 CH(CH2)b OCH3 CH3 CH3 CH3 CH3
N/A：不适用，在分子中不存在该基团
**信号1.22-1.49ppm，10个质子
a.化合物3和21中的CH，化合物22中的CH2
b.化合物3的CH，化合物21和22中的CH2
c)化合物4的合成和结构说明
化合物4，即10-法呢基-4，6，8-三羟基-5-正丙基-5，10-二氢-二苯并[b，e][1，4]二氮杂-11-酮，被制备和确认如下：
制备：
在室温下，在硫酸二丙酯(0.5mL)和NaHCO3(46.3mg)的甲醇(3mL)混合物中，将化合物1(46.7mg)搅拌72小时。将所得混合物滤过0.45μm13mm AcrodiscTM GHP针筒式滤器。通过制备HPLC(在NovaPackTM HR C-18 25×200mm柱上进行多重注射：20mL/min，H2O/CH3CN梯度80∶20-30∶70，0-8min；30∶70-0∶100，8-18min)对所得溶液进行纯化，从而得到基本上纯的化合物4(18.0mg，RT：17.3min)。
化合物4的结构说明：
化合物4的主要同位素的计算分子量(504.30)和分子式(C31H40N2O4)通过质谱分析进行确认：负离子化得到503.4的(M-H)-分子离子和正离子化得到505.5的(M+H)+分子离子。基于化合物1和2的结构知识，可以很容易地确定质子NMR信号的归属。特征N-丙基(5-N-Pr(C1～C3))很容易确定归属，如表7中所示。
d)化合物13的合成和说明
化合物13：10-法呢基-4，6，8-三羟基-5-(三氘代甲基)-5，10-二氢-二苯并[b，e][1，4]二氮杂-11-酮，根据以下方法进行制备和确认：
制备：
将化合物1(121.3mg)溶于甲醇(3.0mL)中，将硫酸二甲酯-d6(150μL，CDN isotopes Inc.)和NaHCO3(58.1mg)加入其中，并且在室温下将该反应搅拌过夜。对上述反应混合物进行过滤，并且使所得滤液经受Waters HPLC纯化(在Nova PackTM HR C-18 25×200mm柱上进行多重注射：20mL/min，H2O/CH3CN梯度70∶30-20∶80，0-4min；20∶80-0∶100，4-9min，100％CH3CN，9-12min)，从而得到化合物13(82.7mg，RT 9.4min)。
结构说明：
化合物13的主要同位素的计算分子量(479.29)和分子式(C29H33D3N2O4)通过质谱分析进行确认：负离子化得到478.5的(M-H)-分子离子和正离子化得到480.6的(M+H)+分子离子。通过质子核磁共振谱对其结构进行进一步确认，如下表7所示。
表7
化合物4和13在MeOH-D4中的1H NMR(δH，ppm)数据 归属 化合物4 化合物13 基团
1 2 3 5-N-Pr(C1) 5-N-Pr(C2) 5-N-Pr(C3) 7 9 1’ 2’ 4’ 5’ 6’ 8’ 9’ 10’ 12’ 1” 2” 3” 7.19 7.12 7.01 3.04，3.15 1.50 0.91 6.22 6.34 4.54，4.88 5.40 2.07 2.12 5.09 1.96 2.03 5.07 1.65 1.78 1.60 1.55 7.21 7.14 7.02 - N/A N/A 6.22 6.34 4.83，4.59 5.44 2.07 2.12 5.10 1.95 2.03 5.07 1.65 1.77 1.60 1.55 CH CH CH CH2a CH2 CH3 CH CH CH2 CH CH2 CH2 CH CH2 CH2 CH CH3 CH3 CH3 CH3
N/A：不适用，在分子中不存在该基团
a.化合物4中的CH2，化合物13中的CD3。
实施例5：烷卤化反应
a)化合物5的合成和结构说明
化合物5，即10-法呢基-4，6，8-三羟基-5-正丁基-5，10-二氢-二苯并[b，e][1，4]二氮杂-11-酮，制备和确认如下：
制备：
在1-溴丁烷(2.0mL)中，将化合物1(43.5mg)与吡啶(50μL)在80℃下搅拌过夜。所得反应混合物用甲醇(1.0mL)进行稀释、过滤并且进行如上所述(实施例4(c)中)的Waters HPLC分离，从而得到半纯化的化合物5(RT：18.1min)。利用相同条件(除曲线7之外(except with curre 7))对半纯化的化合物进行进一步纯化，从而得到基本上纯的化合物5(10.5mg，RT：17.9min)。
结构说明：
化合物5的主要同位素的计算分子量(518.31)和分子式(C32H42N2O4)通过质谱分析进行确认：负离子化得到517.4的(M-H)-分子离子和正离子化得到519.5的(M+H)+分子离子。特征N-正丁基(5-N-烷基(C1-C4))很容易确认归属，如下表8中所示。
b)化合物7的合成和结构说明
化合物7，即10-法呢基-4，6，8-三羟基-5-正己基-5，10-二氢-二苯并[b，e][1，4]二氮杂-11-酮，制备和确认如下：
制备：
在1-溴己烷(2.0mL)中，将化合物1(39.2mg)与吡啶(50μL)在80℃下搅拌过夜。所得反应混合物用甲醇(1.0mL)进行稀释，对其进行过滤，并且使其经受Waters HPLC(在NovaPackTM HR C-1825×200mm柱上进行多重注射：20mL/min，H2O/CH3CN梯度80∶20-30∶70，0-8min；30∶70-0∶100，8-18min；等浓度CH3CN 18-24min)对所得溶液进行纯化，从而得到基本上纯的化合物7(14.0mg，RT：20.1min)。
结构说明：
化合物7的计算分子量(546.35)和分子式(C34H46N2O4)通过质谱分析进行确认：负离子化得到545.6的(M-H)-分子离子和正离子化得到547.6的(M+H)+分子离子。基于化合物1的结构知识，可以很容易地确定质子NMR信号的归属。特征N-正己基(5-N-烷基(C1-C6))很容易确认归属，如下表8中所示。
c)化合物2～4、6和8～12的合成
化合物2～4、6和8～12通过a)和b)中所述方法形成，分别将这些方法中的烷基化试剂替换为以下烷基化试剂：碘代甲烷、溴乙烷、1-溴丙烷、1-溴戊烷、1-溴庚烷、1-氯辛烷、三氟甲基碘、六氟-1-碘丙烷和2-碘-1，1，1-三氟乙烷。
表8
化合物5和7在MeOH-D4中的1H NMR(δH，ppm)数据 归属 5 7 基团
1 2 3 5-N-烷基(C1) (C2) (C3) (C4) (C5) (C6) 7 9 1’ 2’ 4’a 5’a 6’ 8’a 9’a 10’ 12’ 1” 2” 3” 7.20 7.13 7.02 3.18，3.09 1.46 1.35 0.89 N/A N/A 6.22 6.34 4.89，4.54 5.40 2.06 2.12 5.09 1.96 2.04 5.07 1.65 1.78 1.60 1.55 7.20 7.12 7.02 3.18，3.08 1.48 1.30 1.30 1.30 0.89 6.23 6.33 4.92，4.52 5.39 2.06 2.11 5.09 1.96 2.04 5.07 1.64 1.78 1.60 1.56 CH CH CH CH2 CH2 CH2b CH2 CH3 CH CH CH2 CH CH2 CH2 CH CH2 CH2 CH CH3 CH3 CH3 CH3
N/A：不适用，在分子中不存在该基团
a.4’、5’、8’和9’的信号非常接近；基于化合物1确定归属
b.化合物5中的CH3，化合物7中的CH2
实施例6：O-酰基化
化合物25(O-乙酰化)的合成和结构说明：
化合物25：4，6，8-三乙酰氧基-10-法呢基-5，10-二氢-二苯并[b，e][1，4]二氮杂-11-酮，根据以下方法进行制备和确认：
制备：
在6滴吡啶(Aldrich)存在下，将化合物1(120.5mg)与乙酸酐(720μL，29eq，Aldrich)搅拌过夜。对上述反应混合物进行HPLC分离。通过在WatersTM RCM Nova-Pak HRTM C18，6μm，6OA 25×200mm柱(20mL/min H2O/CH3CN 80∶30-70∶75，0-8min；30∶70-0∶100，8-18min，100％CH3CN，18-20min)上进行多重注射进行纯化，从而得到化合物25(91.2mg)，保留时间为18.5min。4，8-二乙酰氧基(11.4mg)、4，6-二乙酰氧基(9.2mg)和6，8-二乙酰氧基(11.4mg)化合物还分别在保留时间为16.2、17.6和18.0时得到分离。
结构说明：
化合物25的主要同位素的计算分子量(588.28)和分子式(C34H40N2O7)通过质谱分析进行确认。化合物25的MS通过负离子化得到587.6的(M-H)-分子离子和通过正离子化得到611.5的(M+Na)+分子离子。化合物25的质子NMR光谱分析示于表9中。基于与化合物1的光谱进行对比，可以很容易确定信号归属。
表9
化合物25在CDCl3中的1H NMR(δH，ppm)数据 归属 25 基团
1 2 3 4-OAc 5 6-OAc 7 8-OAc 9 1’ 2’ 4’a 5’a 6’ 8’a 9’a 10’ 12’ 1” 2” 3” 7.75 7.10 7.16 2.41 6.15 2.40 6.96 2.27 6.84 4.58 5.42 2.06 2.09 5.10 1.98 2.06 5.10 1.68 1.72 1.61 1.60 CH CH CH CH3 NH CH3 CH CH3 CH CH2 CH CH2 CH2 CH CH2 CH2 CH CH3 CH3 CH3 CH3
N/A：不适用，在分子中不存在该基团
a.4’、5’、8’和9’的信号非常接近；基于化合物1确定归属
实施例7：法呢基侧链修饰
a)化合物14的合成和结构说明
化合物14，即10-(3，7，11-三甲基十二烷基)-4，6，8-三羟基-5-甲基-5，10-二氢-二苯并[b，e][1，4]二氮杂-11-酮，制备和确认如下：
制备：
在氧化铂(PtO2，10mg，催化剂)作为催化剂存在下，将化合物2(23.7mg)的甲醇(2.0mL)溶液在氢气下搅拌过夜。对所得反应混合物进行过滤并且在真空中对其进行浓缩，从而得到21.6mg化合物14。
结构说明：
化合物14的计算分子量(482.31)和分子式(C29H42N2O4)通过质谱分析进行确认：负离子化得到481.3的(M-H)-分子离子和正离子化得到483.3的(M+H)+分子离子。在NMR光谱中，法呢基烯烃质子被替换为0.76-1.86ppm附近的脂族烃基质子信号，是17个质子(3CH，7CH2)的总和。特征N-甲基(5-N-Me)很容易确定归属，如下表10中所示。
b)化合物15的合成和结构说明
化合物15，即10-(3，7，11-三甲基-2-十二烯基)-4，6，8-三羟基-5-甲基-5，10-二氢-二苯并[b，e][1，4]二氮杂-11-酮，制备和确认如下：
制备：
在氧化铂(PtO2，10mg，催化剂)作为催化剂存在下，将化合物2(308.5mg)的甲醇(220mL)溶液在氢气下搅拌过夜。对所得反应混合物进行过滤并且根据实施例4(c)中所述的方法通过HPLC对其进行纯化，从而得到纯化合物15(82.3mg，RT：17.0min)。
结构说明：
化合物15的计算分子量(480.30)和分子式(C29H40N2O4)通过质谱分析进行确认：负离子化得到479.3的(M-H)-分子离子和正离子化得到481.6的(M+H)+分子离子。其NMR光谱分析基于化合物2和14的结构说明，所得结果存在于表10中。在NMR光谱上，6’-7’和10’-11’位的法呢基烯烃质子被替换为脂族质子信号，并且与5’、8’和9’位上的脂族质子一起在约1.07～1.51ppm处得到观察，它们是12个质子(2CH，5CH2)的总和。在NMR上，2’(CH)位上的法呢基烯烃质子的化学位移为5.41ppm。4’位上的亚甲基显示在2.03ppm。特征5-N-甲基也很容易确定归属为化学位移2.93ppm。
c)化合物23的合成和说明
化合物23：10-(3，7，11-三甲基十二烷基)-4，6，8-三羟基-5，10-二氢-二苯并[b，e][1，4]二氮杂-11-酮，根据以下方法进行制备和确认：
制备：
在氧化铂(PtO2，10mg，0.4eq)作为催化剂存在下，将化合物1(51.1mg的3.0mL甲醇溶液)溶液在氢气下搅拌过夜。对所得反应混合物进行过滤，并且通过直接制备HPLC，利用PhenomenexSynergiTM MAX RP 21.2×200mm柱(20mL/min，H2O/CH3CN梯度30∶70-30∶70，0-2min；30∶70-0∶100，2-20min)对其进行纯化。将保留时间为12.8min的馏分合并，从而得到45.2mg化合物23。
结构说明：
通过质谱分析对主要同位素的计算分子量(468.30)和分子式(C28H40N2O4)进行确认。化合物23的质谱通过负离子化得到467.4的(M-H)-分子离子和通过正离子化得到469.4的(M+H)+分子离子。化合物23的质子NMR光谱分析示于下表10中。基于化合物1的结构知识，可以很容易地确定信号的归属。正如所料，2’-11’位的脂族质子信号在约1～1.75ppm处具有非常接近的化学位移(17个质子的总和)，12’位和1”-3”位的甲基质子的化学位移也非常接近(0.8-0.95ppm，12个质子的总和)。基于3’和7’位的非对映异构体存在于混合物中并且以不同比例存在的事实，这些信号也是复杂的。因为NMR在氘化甲醇中进行，因此没有观察到不稳定的质子。
表10
化合物14，15和23在CD3OD中的1H NMR(δH，ppm)数据 归属 14 15 23 基团
1 2 3 5-N-Me 7 9 1’ 2’-11’a 12’和1”-3”a 7.18 7.12 7.01 2.96，2.95b 6.23 6.33，6.35b 4.42，3.86 ～0.76-1.86 ～0.87-1.00 7.21 7.14 7.02 2.93 6.21 6.34 4.56，4.87cd 7.15 6.76 6.84 N/A 6.24 6.26 4.16，3.99 ～1.00-1.75 ～0.8-0.95 CH CH CH CH3 CH CH CH2 c d
N/A：不适用，在分子中不存在该基团
a.信号非常接近。
b.异构体混合物。
c.化合物14和23：3CH，7CH2(17H)；化合物15：2’(CH)在5.41ppm，4’(CH2)在2.03ppm，5’-11’(12H)在1.07-1.51ppm。
d.化合物14和23：4CH3(12H)；化合物15：1”(CH3)在1.75ppm，2”、3”和12’(9H)在0.88-0.80ppm。
实施例8：芳族取代反应
a)通过溴化进行的化合物24的合成和结构说明
化合物24：10-(法呢基)-7-溴-4，6，8-三羟基-5，10-二氢-二苯并[b，e][1，4]二氮杂-11-酮，根据以下方法进行制备和确认：
制备：
将化合物1(116.0mg)和N-溴琥珀酰亚胺(NBS，45.5mg)溶于四氢呋喃(THF，3.0mL)中，并且在室温下将其搅拌4天。对所得反应混合物进行过滤并且对其进行Waters HPLC纯化(NovaPackTMHR C-18 25×200mm柱：20mL/min，H2O/CH3CN梯度80∶20-30∶70，0-8min；30∶70-0∶100，8-18min)，从而化合物24(13.6min)，带有一些杂质。通过HPLC(SymmetryTM C-18 25×100mm柱：20mL/min，H2O/CH3CN梯度70∶30-30∶70，0-15min)对上述所得半纯化样品进行进一步纯化，从而得到纯化合物24(9.5mg，RT 13.0min)。
结构说明：
化合物24的主要同位素的计算分子量(540.16和542.16)和分子式(C28H33BrN2O4)通过质谱分析进行确认：负离子化得到539.2和541.1的(M-H)-分子离子，和正离子化得到541.3和543.2的(M+H)+分子离子。在各个质谱中两种分子的存在证实了分子中溴基团的存在。在质子核磁共振谱中不存在芳香(7位)信号，进一步证实了该结构，如下表11所示。
表11
化合物24在CD3OD中的1H NMR(δH，ppm)数据 归属 化合物24 基团
1 2 3 9 1’ 2’ 4’ 5’ 6’ 8’ 9’ 10’ 12’ 1” 2” 3” 7.18 6.79 6.87 6.49 4.56 5.34 2.06 2.09 5.10 1.96 2.04 5.08 1.66 1.74 1.60 1.57 CH CH CH CH CH2 CH CH2 CH2 CH CH2 CH2 CH CH3 CH3 CH3 CH3
b)化合物26的合成
将化合物2和N-溴琥珀酰亚胺溶于四氢呋喃中并且在室温下将其搅拌4天(条件如(a)所述)。对所得反应混合物进行过滤并且对其进行HPLC纯化，从而得到纯化合物26。
c)化合物27的合成
将化合物14和N-溴琥珀酰亚胺溶于四氢呋喃中并且在室温下将其搅拌4天(条件如(a)所述)。对所得反应混合物进行过滤并且对其进行HPLC纯化，从而得到纯化合物27。
实施例9.本发明化合物的体外测验图
(a)式I化合物对四种细胞系的体外抗癌活性：
例证性化合物的体外细胞毒素活性以及各种化合物的溶血活性示于表12中。在四种细胞系中对化合物进行测试：HT-29(结肠癌)、SF268(CNS)、MDA-MB-231(乳腺癌)和PC-3(前列腺癌)。用于各系列测试中的方法如下所述。
表12
体外细胞毒素活性 化合物 No： HT-29 (GI50μM) SF-268 (GI50μM) PC-3 (GI50μM) MDA-MB-231 (GI50μM) 平均c (GI50μM)
1a/b 2b 3b 4b 5b 7b 13b 14b 15b 18b 21b 22b 23a 24b 25a 11.2/9.33 0.65 2.04 2.57 2.50 2.44 0.69 0.29 0.69 1.43 1.89 1.83 4.26 2.02 9.33 1.96/1.55 0.12 0.76 0.89 0.56 0.53 0.16 0.07 0.23 0.33 1.73 0.91 0.72 2.04 1.95 1.95/3.76 0.45 1.15 1.25 1.14 1.33 0.82 0.23 0.65 1.80 1.08 1.39 0.90 1.19 1.20 1.79/3.18 0.24 2.16 2.27 1.39 1.92 0.51 0.24 0.37 1.02 2.19 2.40 0.59 2.02 2.79 4.23/4.45 0.36 1.53 1.74 1.40 1.55 0.54 0.21 0.49 1.14 1.72 1.63 1.62 1.82 3.82
a.通过以下方法(a)获得的结果
b.通过以下方法(b)获得的结果
c.平均GI50值，单位为μM。
表12中所述的所有化合物都比化合物1具有更好的抗癌活性。这些化合物包括化合物2～5、7、13、14、15、18和21～25。化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22是化合物1的N-直链烷基衍生物(被式I包括)和它们的氢化和氢化甲氧基化法呢基衍生物。还发现氢化法呢基衍生物化合物23、溴化芳基衍生物化合物24和三乙酰化化合物25一般比化合物1更有活性。
方法(a)：
对于化合物1、23和25，在体外对其细胞毒素活性进行确定，从而确定各种化合物获得50％细胞增殖抑制作用所需的浓度(GI50)。GI50值强调了零时细胞计数的校正值并且利用七个吸光度测定值[零时，(Tz)，控制生长，(C)和在五种浓度水平(Ti)的药物存在下的测试生长]，GI50计算为[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100＝-50，它是在药物培养期间，导致网状DNA含量相对于对照细胞降低50％的药物浓度。
将化合物溶解于10mM DMSO中。在测定之前，即时在赋形剂中将浓度稀释至30、10、3、1和0.3μM。取决于细胞系的生长特性，将4000-10000个细胞置于两个96孔板中(0天)并且将其培养16小时。第二天，将碘化丙啶加入到两个板中的一个板中并且对其进行荧光测量(Tz)。将测试化合物以及赋形剂对照加入到第二板中，并且将细胞进一步培养96小时。在各个浓度下对各种化合物进行测试，进行三次。在加入碘化丙啶之后，通过荧光(对照为C)测量信号对等同的细胞数目进行确定。GI50结果利用上式进行计算并且示于表12中。方法(b)：
利用碘化丙啶(PI)和通过利用以下方法对化合物1、2～5、7、13、14、15、18、21、22和24的体外细胞毒素活性(GI50)进行确定，为导致产生50％生长抑制作用的药物浓度。
在适当的接种密度(HT29：3,000；SF268：3,000；PC-3：3,000；和MDA-MB-231：7,500个细胞)下和根据各种细胞系的技术数据表(行A-G，75μL介质/孔)，对两个96孔板重复播种各种细胞系。H行仅仅填充介质(150μL，阴性对照介质)。在适当的温度和CO2浓度下将两个板培养24小时。
在适当的介质中将测试化合物制备成15X母液和相应的450、45、0.45、0.045和0.0045μM(试验当日制备)。在适当的试验介质中将各试样稀释7.5倍，从而得到一组六个2X浓度溶液(60、6、0.6、0.06、0.006和0.0006μM)。将75μL各种浓度的试样加入到第二个板的各个相应的孔(行A～F)中。行G中充满75μL介质/0.6％DMSO(阴性对照细胞)。在适当的温度和CO2浓度下将第二个板培养96小时。
第一个板：在不除去培养介质下，将PI(30μL，50μg/mL)加入到第一个板的各个孔中。在3500rpm下将该板离心10分钟(Sorvall Legend-RT，摆动叶片)。进行荧光强度(Thermo，Varioskan，λex：530nm；λem：620nm)测量，从而得到第一测量值，死亡细胞(T0时的DC；冷冻之前)。进行两回合冷冻(-80℃)/融化(37℃)。对荧光强度进行确定，从而得到第二测量值，全部细胞(T0时的TC；冷冻/融化之后)。
如对第一个板所述对第二个板进行处理，但是进行三回合冷冻/融化而不是两次。第一测量值给出处理的死亡细胞值(TDC)，和第二测量值给出处理的全部细胞值(TTC)。对于各个处理孔和对照(CTC和CDC)收集上述两种数值。
通过减去背景值(仅仅介质)对各个数值(DC、TC、TDC、TTC、CTC和CDC)进行校正，从而得到用于各种浓度T/C(％)(处理/对照)计算的值
(FUDC(T＝0)，FUTC(T＝0)，FUTDC，FUTTC，FUCTC和FUCDC)
各种浓度的T/C(％)利用下式进行计算：
T / C ( % ) = ( FU TTC - FU TDC ) - ( FU TC ( T = 0 ) - FU DC ( T = 0 ) ) × 100 ( FU CTC - FU CDC ) - ( FU TC ( T = 0 ) - FU DC ( T = 0 ) ) ]]>
该GI50值强调了零时存活细胞的细胞数目的校正。在图中对T/C值进行交叉，从而确定GI50值，T/C为50％的浓度值。
(b)化合物2对36种细胞系的抗癌活性测验图(IC50)：
培养条件和化合物2对36种癌细胞系的活性评价如实施例9(a)的方法(a)中所述实施，但是将结果表示为抑制50％细胞生长的药物浓度(IC50，利用式：[Ti/C]×100＝-50进行计算)。示于表13中的低微摩尔至纳摩尔水平的IC50值表明了化合物2对多种肿瘤类型的药理学相关细胞毒素活性，所述肿瘤包括黑素瘤、胰癌、肺癌、结肠癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、CNS癌、头和颈癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和乳腺癌。
表13
化合物2的体外特性测验图(IC50) # 类型 细胞系 来源 在裸鼠中的组织学 IC50(μM)
1 2 膀胱 膀胱 T24 1218L ATCC 异种移植 转移细胞ca Urothelial adeno ca 0.127 0.166
3 4 结肠 结肠 HCT116 HT29 NCI NCI Adeno ca，pd Adeno ca，pd 0.156 0.223
5 6 CNS CNS 498NL SF268 异种移植 NCI 恶性胶质瘤 Nd 0.176 0.010
7 胃 251L 异种移植 Adeno ca，pd 0.105
8 头和颈 536L 异种移植 下咽ca 0.181
9 10 11 12 13 14 肺 肺 肺 肺 肺 肺 1121L 289L 526L 629L 529L H460 异种移植 异种移植 异种移植 异种移植 异种移植 NCI 大细胞ca Adeno ca Adeno ca Adeno ca 大细胞ca 大细胞ca 0.125 1.553 0.104 0.164 0.127 0.366
15 16 乳房 乳房 401NL MCF7 异种移植 NCI Pap adeno ca，wd 乳房ca 0.194 0.276
17 18 19 20 21 黑素瘤 黑素瘤 黑素瘤 黑素瘤 黑素瘤 276L 394NL 462NL 514L 520L 异种移植 异种移植 异种移植 异种移植 异种移植 Mm，无黑色素 mm，无黑色素，pd Mm，无黑色素 Mm，黑素沉着 Mm，黑素沉着 1.948 0.020 0.978 0.110 0.085
22 23 24 卵巢 卵巢 卵巢 1619L 899L OVCAR3 异种移植 异种移植 NCI Adeno ca，md Pap serous ca，md Adeno ca，md 0.579 0.238 0.139
25 26 胰腺 胰腺 1657L PANC1 异种移植 ATCC Adeno ca，md nd 1.777 0.125
27 28 29 30 前列腺 前列腺 前列腺 前列腺 22RV1 DU145 LNCAP PC3M ATCC NCI DSMZ NCI Adeno ca，md Adeno ca，md Adeno ca，md Adeno ca，pd 0.142 0.158 0.485 0.114
31 Pleuramesot 1752L 异种移植 pleuromesothelioma 1.503
32 33 34 35 肾 肾 肾 肾 1781L 393NL 486L 944L 异种移植 异种移植 异种移植 异种移植 肾ca 肾上腺样瘤，wd 肾上腺样瘤，pd 肾上腺样瘤 0.172 0.527 1.144 0.230
36 子宫 1138L 异种移植 癌肉瘤，wd 0.139
所有细胞系的平均值：0.407
ca＝癌；pd＝异化不良；pap＝乳突状；md＝中等异化；wd＝充分异化；mm＝恶性黑色素瘤；nd＝未确定
实施例10：化合物1和2的体内效果
化合物1和2在胶质瘤模型中的体内效果：
该研究的目的是测试化合物1和2是否可以预防或者延迟带有C6恶性胶质瘤细胞的鼠中的肿瘤生长，从而确定有效剂量方案。
动物：在处理之前，将60只六周大的体重为18～25g的雌性鼠(Musmusculus裸鼠)观察7天。根据动物试验道德准则(Charte du comited’ethique du CNRS，juillet 2003)和对于试验瘤形成中动物福利的English准则(WORKMAN，P.，TWENTYMAN，P.，BALKWILL，F.等人(1998)，United Kingdom Coordinating Committee on CancerResearch(UKCCCR)Guidelines for the welfare of animals inexperimental neoplasia(Second Edition，July 1997；British Journal ofCancer，77：1-10)进行动物试验。将任何死亡或者看起来有病的鼠即时除去和替换为健康的鼠。将有病的鼠从笼中除去，实施安乐死。在温度(23±2℃)、湿度(45±5％)、光照周期(12小时光/12小时黑暗)和换气的控制条件下，将动物保持在室中。将动物罩在装配有食物和水源的聚碳酸酯笼中(5只/笼)。由无菌木屑组成的动物垫层每隔一天替换一次。食品不限量提供，位于笼上的金属盖中。热压处理的自来水不限量提供。水瓶装配有橡皮塞和滑块管。每周将水瓶净化、灭菌和替换一次。通过刻在两只耳朵上的不同数字区分动物。每个笼标记一个具体代码。
肿瘤细胞系：根据Premont等人(Premont J，Benda P，Jard S.，[3H]norepinephrine binding by rat glial cells in culture.Lack ofcorrelation between binding and adenylate cyclase activation.BiochimBiophys Acta.1975 Feb 13；381(2)：368-76.)所述，在系列替代培养和动物传代之后，由通过N-硝基甲基脲(NMU)诱发的大鼠神经胶质肿瘤对C6细胞系进行克隆。)在湿润的大气环境下(5％CO2，95％空气)，在37℃下使细胞生长为粘合单层。培养介质是补充有2mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清的DMEM。为了试验使用，通过用胰蛋白酶-versen处理10分钟，将肿瘤细胞从培养瓶中除去。在血球计中对细胞进行计数并且通过0.25％锥虫蓝排斥对它们的生存能力进行评价。
测试制品的制备：对于测试制品，进行以下方法以进行重构(在注射之前即时进行)。赋形剂由苄醇(1.5％)、乙醇(8.5％)、丙二醇(27％)、PEG 400(27％)、二甲基乙酰胺(6％)和水(30％)的混合物组成。为了获得均相液体，首先对赋形剂溶液进行涡旋。将0.6mL经受涡旋的赋形剂溶液加入到含有测试制品(化合物1)的各个管形瓶中。通过涡旋1分钟和翻转以及用力振摇，对管形瓶进行充分混合。在注射入各只动物之前，再次对管形瓶进行混合。
动物肿瘤细胞接种：试验在0天(D0)时开始。在D0时，使鼠接受在0.1mL DMEM完全培养基中的C6肿瘤细胞(5×105个细胞)的表面肌肉注射，注射入右后腿的上方中。
治疗方案和结果：
第一系列试验：
在第一系列试验中，在接种C6细胞24小时后开始处理。在处理当天，通过i.p途径向各只鼠缓慢注射100μL测试或者对照制品。对于所有组，治疗进行至用盐水治疗的鼠(组1)的肿瘤体积达到大约3cm3(大约16天)时为止。组1的鼠每天用盐水等渗溶液进行处理，处理16天。组2的鼠每天用赋形剂溶液液进行处理，处理16天。组3的鼠每天用10mg/kg化合物1进行处理，处理16天。组4的鼠用30mg/kg化合物1每两天处理一次，接受8次处理。组5的鼠用30mg/kg化合物1每三天处理一次，接受6次处理。一旦肿瘤变得明显(＞100mm3；接种后11天)后即开始利用卡尺对肿瘤体积进行测量，每隔一天测量一次，直至处理结束为止。如表14和图1中所示，正如单向方差分析(Anova)测试随后进行处理组同盐水组相比的非参数Dunnett’s多次对比测试所表明，所有化合物1处理组(6只鼠/组)的肿瘤体积的平均值都得到了显著降低。表14P值栏中的星号表示统计学上的显著值，而“ns”表示不显著。
表14
化合物1对C6恶性胶质瘤的体内抗癌效果 处理 处理方案 肿瘤体积(mm3) (平均值±SEM) ％抑制作用 P值
盐水 赋形剂溶液 化合物1(10mg/kg) 化合物1(30mg/kg) 化合物1(30mg/kg) Q1×16 Q1×16 Q1×16 Q2×8 Q3×6 3,004.1±249.64 2.162.0±350.0 1,220.4±283.46 1,236.9±233.99 1,184.1±221.45 - 28.0％ 59.4％ 58.8％ 60.6％ - ＞0.05ns ＜0.01* ＜0.01* ＜0.01*
第二系列试验：
在第二系列试验中，在接种C6细胞10天时肿瘤变得明显时(大约100～200mm3)开始处理。在5个连续作业日内每天都重复进行处理。在处理当天，通过i.p途径向各只鼠缓慢注射100μL化合物1。组1的鼠每天用盐水等渗溶液进行处理。组2的鼠每天用赋形剂溶液液进行处理。组3的鼠每天用20mg/kg化合物1进行处理。组4的鼠每天用30mg/kg化合物1进行处理。对鼠进行处理，直至用盐水处理的对照鼠(组1)的肿瘤体积达到大约4cm3时为止。每隔一天用卡尺测量肿瘤体积一次，直至处理结束为止。如表15和图2中所示，正如单向方差分析(Anova)测试随后进行处理组同盐水组相比的非参数Dunnett’s多次对比测试所表明，所有化合物1处理组(6只鼠/组)的肿瘤体积的平均值都得到了显著降低。表15P值栏中的星号表示统计学上的显著值，而“ns”表示不显著。
肿瘤部分的组织学分析表明，用化合物1处理的鼠和对照组中的鼠的肿瘤之间存在显著的形态变化。用化合物1(20-30mg/kg)处理的鼠的肿瘤中，细胞密度得到了降低和剩余肿瘤细胞的细胞核看起来较大和呈现固缩，然而用赋形剂处理的鼠的肿瘤没有观察到这种变化(图3)。
表15
化合物1对C6恶性胶质瘤的体内抗癌效果 处理 处理方案 肿瘤体积(mm3) (平均值±SEM) ％抑制作用 P值
盐水 赋形剂溶液 化合物1(20mg/kg) 化合物1(30mg/kg) Q1×5 Q1×5 Q1×5 Q1×5 4,363.1±614.31 3,205.0±632.37 1,721.5±374.79 1,131.6±525.21 - 26.5％ 60.5％ 74.1％ - ＞0.05ns ＜0.01* ＜0.01*
化合物2的体内抗癌效果：
化合物2对雌性瑞士裸鼠中鼠恶性胶质瘤(C6)异种移植的抗癌效果通过如上所述进行。所得结果和给药方案概括在图4中。在给药方案为75mg/kg(qd5/2/qd5)下，静脉内给药之后，显示出了显著的效果。
实施例11：药物动力学测验图
将化合物1和2单独溶于乙醇(5％)、聚山梨酸酯80(15％)、PEG400(5％)和葡萄糖(5％)中，最终浓度为6mg/ml(对于所有胃肠外给药途径)。对于口服给药，在CremophorEL/乙醇(50％∶50％)中对化合物1进行溶液化，最终浓度为6mg/ml。在剂量给药之前，对动物(雌性CrI：CD1鼠；6周大，22-24g)进行称重，对它们进行随机选择并且分配成不同的处理组。通过静脉内(iv)、皮下(sc)、腹膜内(ip)或者口服(po)途径将化合物1给药至指定的动物。通过静脉内(iv)或者腹膜内(ip)途径将化合物2给药至指定的动物。化合物1和2的剂量给药体积为5mL/kg体重。在采血之前，用5％异氟烷对动物进行麻醉。通过每次采血时点(2min、5min、15min、30min、1h、2h、4h和8h)心脏刺穿四只动物，将血液收集入含有抗凝血剂K2EDTA的microtainer管中。在采集之后，对样品进行离心并且对由各个样品获得的血浆进行回收和冷冻贮存(在大约-80℃下)，等待进行分析。在5min和30min时点，从各只动物采集以下器官：脑、肺、骨骼肌、脂肪组织、肾、脾脏、胸腺和肝。对组织进行冷冻(在大约-80℃下)，等待分析。通过LC/MS/MS对各样品进行分析。标准曲线从25延伸至2000ng/mL，定量限(LOQ)＜25ng/mL和检测极限(LOD)为10ng/mL。
将降低至定量限(LOQ)以下的化合物1和2的血浆值设定为零。在药物动力学研究的各个时点对平均浓度值和标准偏差(SD)进行计算(n＝4只动物/时点)。对以下药物动力学参数进行计算：从零时至最后可测量浓度时点的血浆浓度与时间的曲线面积(AUC0-t)，延伸到无穷大时血浆浓度与时间的曲线的面积(AUCinf)，观察的血浆浓度的最大值(Cmax)，最大血浆浓度的时间(tmax)、表观一阶末端消除速度常数(kel)，表观一阶末端消除半衰期计算为0.693/kel(t1/2)。利用剂量/AUCinf，对静脉内给药后化合物1的系统清除率(CL)进行计算。利用KineticaTM 4.1.1(InnaPhase Corporation，Philadelphia，PA)对药物动力学参数进行计算。
结果：
在静脉内(iv)、腹膜内(ip)、皮下(sc)和口服(po)给药30mg/kg化合物1后，化合物1的平均血浆浓度存在于图5中。在iv和ip给药30mg/kg化合物2后，与化合物1经相同给药途径相比较的化合物2的平均血浆浓度存在于图6中。当iv给药时，化合物2的AUC为92.08μM.h和观察到的Cmax为105μg/mL，化合物1的AUC为40.4μM.h和观察到的Cmax为130μg/mL。当ip给药时，化合物2的AUC为58.75μM.h和观察到的Cmax为5.8μg/mL，化合物1的AUC为9.5μM.h和观察到的Cmax为2.25μg/mL。
在I.V.给药30mg/kg剂量化合物1后，化合物1的平均(±SD)血浆浓度以双指数方式迅速下降，产生非常短的半衰期(t1/2α和β分别为4.6min和2.56h)。在腹膜内和皮下给药之后化合物1和在腹膜内和静脉内给药之后化合物2的药物动力学表现出了缓慢释放的PK分布。利用这些给药途径，化合物的血浆浓度得到了缓释并且在8小时时间内都保持在治疗适当水平上。在IP和IV给药之后，化合物2表现的半衰期(t1/2)大于40小时。化合物1的口服给药产生中等但是缓释的药物水平。这些数据表明化合物1的口服生物利用度为5-8％的水平。
在静脉内(iv)、腹膜内(ip)或者皮下(sc)给药30mg/kg化合物130分钟后，化合物1的平均组织浓度存在于图7中。选择30分钟的时点，是因为此时三种给药途径的血浆浓度类似。在iv和ip剂量给药之后，化合物1得到了良好分布。惊人地发现，虽然ip和sc给药产生相似的PK分布，但是在sc剂量给药之后的组织水平显著更低。这可以由同iv和ip给药相比，sc给药之后不存在峰值水平得到解释。
利用相同的制剂，在CD-1 nu/nu鼠中对化合物进行急性毒性研究，得到MTD≥50mg/kg(ip，NOAEL：30mg/kg)和≥100mg/kg(iv，NOAEL：75mg/kg)，在注射后数天时体重损失为约7％。当iv给药时，化合物1的MTD为150mg/kg。化合物46的急性毒性研究的MTD为30mg/kg(ip)。
所有在此引用的专利、专利申请和出版物的全部内容都在此引入作为参考。虽然本发明已经参考其优选实施方案进行了特别说明和描述，但是本领域熟练技术人员应当理解，可以对其中的形式和细节进行多种变型，这并不背离附属权利要求所包括的本发明范围。