植酸酶组合对植酸水解的协同效应.pdf

本发明涉及组合至少两种植酸酶组合物和方法，其用于将植酸(肌醇六磷酸)水解为无机单磷酸、较低磷酸化水平的肌醇以及游离的肌醇。所述组合物和方法对动物饲养特别有益。

权利要求书
1.   用于水解植酸(肌醇1，2，3，4，5，6-六硫酸)的组合物，其组合了至少两种植酸酶，所述组合物的特征在于其包括：
a)第一植酸酶，其展示与SEQ ID No.1的植酸酶至少80％的同一性或与SEQ ID No.2的植酸酶至少80％的同一性；
b)第二植酸酶，其展示与SEQ ID No.3的植酸酶具有至少80％同一性。

2.   如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述第一植酸酶为3-植酸酶，其催化植酸的六个磷酸键水解。

3.   如前述任一权利要求所述的组合物，其特征在于所述第一植酸酶具有55℃和80℃之间的最适温度以及pH 3.5和pH 5之间的最适pH。

4.   如前述任一权利要求所述的组合物，其特征在于所述第一植酸酶是酵母Schwanniomyces castellii的植酸酶或酵母Debaryomycescastellii的植酸酶。

5.   如前述任一权利要求所述的组合物，其特征在于所述第一植酸酶是SEQ ID No.1的植酸酶或SEQ ID No.2的植酸酶。

6.   如前述任一权利要求所述的组合物，其特征在于所述第二植酸酶是3-植酸酶，其催化植酸的至少五个磷酸键水解。

7.   如前述任一权利要求所述的组合物，其特征在于所述第二植酸酶具有50℃和60℃之间的最适温度以及pH 2和pH 6之间的最适pH。

8.   如前述任一权利要求所述的组合物，其特征在于所述第二植酸酶为黑曲霉的植酸酶。

9.   如前述任一权利要求所述的组合物，其特征在于所述第二植酸酶为SEQ ID No.3的植酸酶。

10.   如前述任一权利要求所述的组合物，其特征在于其由动物用营养添加剂或动物饲料组成。

11.   权利要求1-9中任一权利要求所述的组合物用于制备动物用营养添加剂或动物饲料中的用途。

12.   权利要求1-10中任一权利要求所述的组合物用于提高植酸磷的可利用度和改善动物饲料的可消化性的用途。

13.   将植酸(肌醇1，2，3，4，5，6-六磷酸)水解为无机单磷酸、具有较低级磷酸化程度的肌醇磷酸盐以及游离肌醇的方法，其特征在于包括以下步骤：
a)提供第一植酸酶，其展示与SEQ ID No.1的植酸酶具有至少80％的同一性或与SEQ ID No.2的植酸酶具有至少80％的同一性；
b)提供第二植酸酶，其展示与SEQ ID No.3的植酸酶具有至少80％的同一性；
c)将所述植酸同时与所述第一植酸酶和所述第二植酸酶接触。

14.   如权利要求13所述的方法，其特征在于所述第一植酸酶为3-植酸酶，其催化植酸的六个磷酸键水解。

15.   如权利要求13或14所述的方法，其特征在于所述第一植酸酶具有55℃和80℃之间的最适温度以及pH 3.5和pH 5之间的最适pH。

16.   如权利要求13-15中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述第一植酸酶是酵母Schwanniomyces castellii的植酸酶或酵母Debaryomyces castellii的植酸酶。

17.   如权利要求13-16中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述第一植酸酶是SEQ ID No.1的植酸酶或SEQ ID No.2的植酸酶。

18.   如权利要求13-17中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述第二植酸酶是3-植酸酶，其催化植酸的至少五个磷酸键水解。

19.   如权利要求13-18中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述第二植酸酶具有50℃和60℃之间的最适温度以及pH 2和pH 6之间的最适pH。

20.   如权利要求13-19中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述第二植酸酶为黑曲霉植酸酶。

21.   如权利要求13-20中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述第二植酸酶为SEQ ID No.3的植酸酶。

22.   用于饲养动物的试剂盒或装配，其特征在于包括：
a)SEQ ID No.1的Schwanniomyces astellii植酸酶或SEQ ID No.2的Debaryomyces castellii植酸酶；
b)SEQ ID No.3的黑曲霉植酸酶。

说明书植酸酶组合对植酸水解的协同效应
本发明涉及植酸酶组合对植酸水解的协同效应。
植酸盐(肌醇六磷酸盐)或植酸盐类(phytates)(肌醇六二氢磷酸盐)是磷在谷类、豆类植物以及产油植物中的主要储备形式。因此，它们组成了以植物为基础的动物饲料中主要的磷来源，单胃动物(家禽和猪)膳食中的主要成分。然而，这些动物对饲料中这种磷的生物利用度是有限的。这是因为它们不具有下述消化酶，所述消化酶以充分的量降解植酸盐使得植酸盐水解并因此提供它们所需的无机磷的量。此外，植酸是一种抗营养因子，其与蛋白质和离子(Fe3+，Ca2+，Zn2+，Mg2+)形成复合物并因此降低这些元素的生物利用度。
因此家禽和猪的饲料摄取必须添加无机磷酸盐，而植酸盐的磷被排泄并促成了单胃动物密集饲养区地表水中的富营养化作用。
植酸酶类(肌醇六磷酸3-和6-磷酸水解酶EC 3.1.3.8和3.1.3.26)是组氨酸磷酸酶家族中的一部分。植酸酶类为六磷酸水解酶，其水解植酸或植酸盐的磷脂键。因此，它们催化肌醇六磷酸(植酸，InsP6)水解为无机单磷酸盐和水解为具有低级磷酸化的肌醇磷酸盐(InsP5到InsP1)，和在某些情况下水解为游离的肌醇。
存在两类植酸酶，其差异仅在于水解的第一个磷酸的位置。3-植酸酶(EC 3.1.3.8)水解3-位的磷酸，而6-植酸酶(EC 3.1.3.26)水解6-位的磷酸。
用作动物营养学添加剂的这些酶，使得可能首先增加植酸磷的利用度，其次改善饲料的可消化性。此外，植酸磷的释放可观地降低了由于添加磷所产生的成本以及由过度排泄的磷所造成的污染。
植酸酶由大量不同的生物产生：植物、动物和尤其是微生物。这些植酸酶具有非常不同的生物化学特性，特别是，它们作为pH函数的活性以及它们的温度稳定性。此外，这些酶在以下方面表现不同：(a)水解所有磷酸盐的效力，(b)它们的立体专一性以及(c)它们与磷酸肌醇的亲和力。
在产植酸酶的微生物中，特别值得一提的是：曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、毛霉(Mucor)和根霉(Rhizopus)属的真菌，细菌：假单胞菌(Pseudomonas sp.)、克雷白杆菌(Klebsiella sp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)、(Enterobacter sp.)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和酵母：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、球拟酵母(Torulopsis Candida)、汉氏德巴利氏酵母(Debaryomyces castellii)、Debaryomyces occidentalis(同义词Schwanniomyces castellii)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)。
已经研究了众多微生物植酸酶并将其用于多种工农业应用中。这些酶在饲料中和在动物的消化过程中的效力依赖于它们维持其潜能的能力，而与在饲料制备步骤以及在消化道中所遇到的多种条件无关。饲料的制备需要抗热的酶，而pH值范围，例如在通过家禽的不同的嗉囊、胃、十二指肠、空肠和回肠室时在5.02，2.75，6.28，6.63和5.98之间。
迄今所述的大多数植酸酶仅部分水解植酸，并且一些仅有非常缓慢的动力学。因此，众多植酸酶仅水解植酸的5个磷酸键，即83％的潜在磷。
迄今，在酵母中，仅酵母Schwanniomyces occidentalis的植酸酶被描述为能够水解植酸盐的所有磷酸键(EP 0 699 762及Segueilha L.，Lambrechts C，Boze H.，Moulin G.，Galzy P.，(1992)Purification andproperties of a phytase from Schwanniomyces castellii，J.Ferm.Bioeng.，74，7-11)。
然而在实验条件下，并未获得植酸盐或植酸的完全水解。
为了获得植酸的更有效的水解，已经计划将多种植酸酶组合。
WO 98/30681描述了具有不同的立体专一性的植酸酶的组合，特别是3-植酸酶的组合和6-植酸酶的组合。该文件特别描述了Peniophora lycii 6-植酸酶和黑曲霉(Aspergillus niger)3-植酸酶(植酸酶NovoTM)的组合。
US 6,183,740也描述了具不同专一性的植酸酶的组合，以及与其它酸性磷酸酶的组合。
但是，并未观察到植酸到磷酸和到肌醇的完全水解。
本发明欲解决的问题包括改善植酸水解速率和效力，从而在不同的工农业应用中获得植酸的完全水解。
本发明的组合物和方法解决了该问题，其中至少两种特异的植酸酶被组合。有利地，本发明的组合物由于所观察到的协同效应使得植酸的所有磷酸基团完全水解。有利地，本发明的组合物在适合植酸酶工农业应用、特别是适合动物营养学领域应用的宽pH范围中是有活性的。本发明的另一优点是所用的植酸酶是热稳定的。
序列描述
SEQ ID No.1：Schwanniomyces castellii植酸酶。
SEQ ID No.2：Debaryomyces castellii植酸酶。
SEQ ID No.3：黑曲霉植酸酶。
SEQ ID No.4：绳状青霉(Penicillium funiculosum)植酸酶。
SEQ ID No.5：Peniophora lycii植酸酶。
SEQ ID No.6：编码小麦植酸酶的序列。
SEQ ID No.7：小麦(Triticum aestivum)植酸酶。
发明描述
本发明的主题是一种用于水解植酸(肌醇1，2，3，4，5，6-六磷酸)的组合物，其组合了至少两种植酸酶，包括：
-第一植酸酶，其展示与SEQ ID No.1的植酸酶有至少80％的同一性或与SEQ ID No.2的植酸酶有至少80％的同一性；
-第二植酸酶，其展示与SEQ ID No.3的植酸酶有至少80％的同一性。
优选地，所述第一植酸酶为3-植酸酶，其催化植酸的六个磷酸键水解。
优选地，所述第一植酸酶具有55℃和80℃之间的最适温度以及pH 3.5和pH 5之间的最适pH。
在优选的实施方案中，所述第一植酸酶是酵母Schwanniomycescastellii的植酸酶或酵母Debaryomyces castellii的植酸酶。
在另一优选的实施方案中，所述第一植酸酶是SEQ ID No.1的植酸酶或SEQ ID No.2的植酸酶。
优选地，所述第二植酸酶是3-植酸酶，其催化植酸的至少五个磷酸键水解。
优选地，所述第二植酸酶具有50℃和60℃之间的最适温度以及pH 2和pH 6之间的最适pH。
在优选的实施方案中，所述第二植酸酶为黑曲霉植酸酶。
在另一优选的实施方案中，所述第二植酸酶为SEQ ID No.3的植酸酶。
优选地，本发明的组合物由动物用营养添加剂或动物饲料组成。
本发明的主题还是本发明的组合物在制备动物用营养添加剂或动物饲料中的用途。
本发明的主题还是本发明的组合物在提高植酸磷的可利用度和改善动物饲料的可消化性中的用途。
本发明还涉及将植酸(肌醇1，2，3，4，5，6-六磷酸)水解为无机单磷酸、水解为具有较低磷酸化水平的肌醇以及水解为游离肌醇的方法，其包括以下步骤：
-提供第一植酸酶，其展示与SEQ ID No.1的植酸酶有至少80％的同一性或与SEQ ID No.2的植酸酶有至少80％的同一性；
-提供第二植酸酶，其展示与SEQ ID No.3的植酸酶有至少80％的同一性；
-将所述植酸同时与所述第一植酸酶和所述第二植酸酶接触。
优选地，所述第一植酸酶为3-植酸酶，其催化植酸的六个磷酸键水解。
优选地，所述第一植酸酶具有55℃和80℃之间的最适温度以及pH 3.5和pH 5之间的最适pH。
在优选的实施方案中，所述第一植酸酶是酵母Schwanniomycescastellii的植酸酶或酵母Debaryomyces castellii的植酸酶。
在特别有利的实施方案中，所述第一植酸酶是SEQ ID No.1的植酸酶或SEQ ID No.2的植酸酶。
优选地，所述第二植酸酶是3-植酸酶，其催化植酸的至少五个磷酸键水解。
优选地，所述第二植酸酶具有50℃和60℃之间的最适温度以及pH 2和pH 6之间的最适pH。
在有利的实施方案中，所述第二植酸酶为黑曲霉植酸酶。
在特别有利的实施方案中，所述第二植酸酶为SEQ ID No.3的植酸酶。
本发明的主题还为用于饲养动物的试剂盒或装配，包括：
-SEQ ID No.1的Schwanniomyces astellii植酸酶或SEQ ID No.2的Debaryomyces castellii植酸酶；
-SEQ ID No.3的黑曲霉植酸酶。
本发明的组合物将第一植酸酶(其展示与SEQ ID No.1的植酸酶有至少80％的同一性或与SEQ ID No.2的植酸酶有至少80％的同一性)和第二植酸酶(其展示与SEQ ID No.3的植酸酶有至少80％的同一性)组合。
令人惊奇地是，植酸酶的这种特异的组合使得可能获得对植酸水解的协同效应。因此，本发明的组合物能够在宽的pH范围内催化植酸的快速和完全的水解。
术语“植酸酶”旨在表示肌醇六磷酸磷酸水解酶(EC 3.1.3.8和3.1.3.26)。这些酶催化肌醇1，2，3，4，5，6-六磷酸(植酸，InsP6)水解为无机单磷酸，和水解为较低级磷酸化的肌醇磷酸(InsP5至InsP1)，和对于某些植酸酶来说水解为游离的肌醇。
本发明的组合物包括第一植酸酶，其展示与SEQ ID No.1的植酸酶有至少的80％同一性，或与SEQ ID No.2的植酸酶有至少80％的同一性。
SEQ ID No.1的植酸酶是酵母Schwanniomyces castellii的植酸酶，而SEQ ID No.2的植酸酶为酵母Debaryomyces castellii的植酸酶。
这些植酸酶具有非常相似的催化特征，因此在本发明的植酸酶组合中可互换。
优选地，所述第一植酸酶有至少80％、90％、95％、98％，以及优选地至少99％的氨基酸显示与SEQ ID No.1的植酸酶相同，或者有至少80％、90％、95％、98％，以及优选地至少99％的氨基酸显示与SEQID No.2的植酸酶相同。
优选地，所述第一植酸酶与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的植酸酶具有相同的特性，特别是相同的催化特性。优选地，所述第一植酸酶分离自Schwanniomyces castellii或Debaryomyces castellii的其它菌株，或分离自其它酵母。或者，所述第一植酸酶可通过例如定点突变技术获得。
表述“相同的氨基酸”旨在表示在两个氨基酸序列间没有变化的氨基酸。所述第一植酸酶可以表现关于SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的植酸酶的至少一个氨基酸的缺失、添加、或取代。
SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的植酸酶具有共有的催化特性。根据本发明，本发明的组合物和方法中所用的第一植酸酶与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的植酸酶显示一定程度同一性，并保留这些共有的催化活性。
优选地，所述第一植酸酶具有3-植酸酶活性。优选地，所述第一植酸酶催化植酸的六个磷酸键水解。
所述3-植酸酶(EC 3.1.3.8)首先水解3-位磷酸。
能够水解植酸所有磷酸键(1-，2-，3-，4-，5-和6-位)的植酸酶催化肌醇1，2，3，4，5，6-六磷酸(植酸，InsP6)水解为无机单磷酸和游离的肌醇。许多植酸酶仅水解植酸的5个磷酸键，即83％的潜在磷。这些酶将植酸水解为肌醇单磷酸，但不能水解为游离的肌醇。
表述“植酸酶活性”旨在表示植酸酶的酶活性。该活性以每微克蛋白质的国际单位(I.U.)表示。酶活性的1I.U是在给定的pH和给定的温度下，每单位时间转化1微摩尔的底物的催化能力。
优选地，所述第一植酸酶具有55℃和80℃之间的最适温度以及pH 3.5和pH 5之间的最适pH。
在优选的实施方案中，所述第一植酸酶是酵母Schwanniomycescastellii的植酸酶或酵母Debaryomyces castellii的植酸酶。
在另一特别优选的实施方案中，所述第一植酸酶是SEQ ID No.1的植酸酶或SEQ ID No.2的植酸酶。
本发明的组合物至少包括第二植酸酶，其展示与SEQ ID No.3的植酸酶有至少80％的同一性。
所述SEQ ID No.3的植酸酶为丝状真菌黑曲霉的植酸酶。
优选地，所述第二植酸酶至少80％、90％、95％、98％，以及优选地至少99％氨基酸显示与SEQ ID No.3的植酸酶相同。
优选地，所述第二植酸酶保留SEQ ID No.3的植酸酶的特性，尤其是催化特性。优选地，该植酸酶分离自黑曲霉的其他菌株或来自其他丝状真菌。或者，例如，该植酸酶可通过定点突变获得。
表述“相同的氨基酸”旨在表示两个序列间没有变化的氨基酸。所述第二植酸酶可以展示关于SEQ ID No.3的植酸酶的至少一个氨基酸的缺失、添加或取代。
根据本发明，本发明的组合物和方法中所用的第二植酸酶因此显示与SEQ ID No.3的植酸酶一定程度的同一性，并保留后者的催化活性。
优选地，所述第二植酸酶为3-植酸酶，其催化植酸的至少五个磷酸键的水解。
优选地，所述第二植酸酶具有50℃和60℃之间的最适温度以及pH 2和pH 6之间的最适pH。甚至更优选地，所述第二植酸酶具有pH2.5和pH 3.5之间的第一适宜pH和pH 4.5和pH 5.5之间的第二适宜pH。
在优选的实施方案中，所述第二植酸酶为黑曲霉植酸酶。
在有利的实施方案中，所述第二植酸酶为SEQ ID No.3的植酸酶。
植酸酶酶活性特别作为pH的函数而变化。因此，植酸酶具有下述pH范围(或区域)，在此范围内其催化活性较高或最佳。术语“范围”为给定的pH区域或区间。当这些酶在不同的pH范围具有活性时，两种植酸酶在互补的pH范围中具有酶活性。优选地，这些范围重叠或部分叠加。通常，所述植酸酶在酸性pH具有较高的酶活性。因此，具有互补pH范围的两种植酸酶具有例如，对于第一植酸酶在pH 2和pH 4之间的最大酶活性，对于第二植酸酶在pH 4和pH 6之间的最大酶活性。在本发明的组合物和方法中，所述第一和第二植酸酶优选地具有互补的pH范围或互补的最适pH。本方面的组合物和方法因此使得植酸在宽的pH范围内水解。
测量和鉴定多肽之间同一性程度的方法是本领域技术人员公知的。可利用例如Vector NTi 9.1.0，比对程序AlignX(Clustal W算法)(Invitrogen INFORMAX，http://www.invitrogen.com)。优选地，使用默认参数。
本发明组合物和方法的植酸酶可从其天然环境中分离或纯化。可借助于多种方法来制备所述的植酸酶。这些方法特别从天然来源(例如天然表达这些植酸酶的细胞)纯化，通过适合的宿主细胞生产重组植酸酶并随后将其纯化，通过化学合成来生产，或最后是这些不同方法的组合。这些不同的生产方法是本领域技术人员公知的。因此，用于本发明的组合物和方法中的植酸酶可从Schwanniomyces castellii、Debaryomyces castellii或从黑曲霉中分离。在另一实施方案中，本发明的植酸酶分离自重组的宿主生物。
优选地，本发明的组合物由动物用营养添加剂或动物饲料组成。
本发明的一个主题还是本发明的组合物在制备动物用营养添加剂或动物饲料中的用途。
本发明因此还涉及提供植酸酶活性的饲料添加剂。这种类型酶活性的提供使得可能改善饲料的可消化性和增进其营养价值。
术语“营养添加剂”旨在表示通常以小量有意添加到饲料中，从而改善其营养特性或其可消化性的物质。动物用营养添加剂可包含例如维生素、矿物盐、氨基酸和酶。
本发明还涉及动物饲料。这些饲料通常为掺入了本发明添加剂的粗粉(meals)或颗粒形式。术语“饲料”旨在表示能够用于饲养动物的任何物质。对于动物的加强饲养而言，该动物饲料通常包含营养基础和营养添加剂。术语“营养基础”旨在表示构成动物大部分食物摄取的部分，例如，其由谷类、蛋白质和动物脂肪和/或植物源的混合物组成。
动物的营养基础适合这些动物的膳食，并且是本领域所属技术人员公知的。通常，这些营养基础包括，例如，玉米、小麦、豌豆和大豆。这些营养基础适合它们所计划的不同动物种类的需要。这些营养基础可已经含有营养添加剂，例如维生素、矿物盐和氨基酸。
在优选的实施方案中，本发明涉及单胃动物的饲料，特别是家禽和猪的饲料。所述家禽特别包括产卵鸡、肉鸡、火鸡和鸭子。猪特别包括生长猪(growing pig)和成熟猪(finishing pig)以及小猪。
本发明的一个主题还是本发明的组合物在改进植酸磷的利用度和改善动物饲料的可消化性中的用途。
本发明的组合物和方法将下述第一植酸酶与下述第二植酸酶组合，所述第一植酸酶能够水解植酸的所有磷酸键，选自选自Schwanniomyces castellii植酸酶和Debaryomyces castellii植酸酶；所述第二植酸酶能够水解植酸的至少5个磷酸键，并在与所述第一植酸酶的pH范围互补的pH范围中具有酶活性。
附图
图1：在不同pH下，6种植酸酶单独或配对组合时，植酸水解的动力学比较。结果表示为理论磷释放的％。
图2：反应120分钟后，不同植酸酶对植酸水解的百分比。(A)单独使用植酸酶，(B)组合的植酸酶。点线对应5个磷酸键的水解。
图3：在不同pH下，6种植酸酶的起始植酸水解率(μmol.ml-1.min-1)的比较。(A)单独使用植酸酶，(B)组合的植酸酶。在反应的头10分钟内计算该水解率。
材料与方法
1.植酸酶来源
■黑曲霉Natuphos(AN)：批次R2503或批次057NPHO2
Wim van Hartingsveldt，Cora M.J.van Zeijl，G.Marian Harteveld，Robin J.Gouka，Marjon E.G.Suykerbuyk，Ruud G.M.Luiten，Peter A.van Paridon，Gerard C.M.Selten，Annemarie E.Veenstra，Robert F.M.van Gorcom and Cees A.M.J.van den Hondel；Cloning，characterization and overexpression of the phytase-encoding gene(phyA)of Aspergillus niger.Gene，127，(1)87-94(1993)
■Peniophora lycii(PL)：批次172NHS02
Lassens，S.F.，Breinholt，J.，Ostergaard，P.R.，Brugger，R.，Bischoff，A.，Wyss，M.and Fuglsang，C.C.；Expression，gene cloning，andcharacterization of five novel phytases from four basidiomycete fungi：Peniophora lycii，Agrocybe pediades，a Ceriporia sp.，and Trametespubescens.Appl.Environ.Microbiol.67(10)，4701-4707(2001)
■绳状青霉菌(PF)：Godo A1346批次1301
WO 03054199
■小麦(B)：Sigma参考标号P1259。
WO 0183763
■Schwanniomyces castellii(SC)：在博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)批次10059 CN 25中生产
EP 0931837
■Debaryomyces castellii株CBS 2923(DC)。
2.酶促方法
通过以下无机磷酸相对于时间的释放测量植酸酶的活性。
在8mM植酸钠(Sigma)存在下测量该活性，该植酸钠溶解在200mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5，37℃(5体积))中。通过添加酶促提取物(1体积)来启动该反应。通过用20％的三氯醋酸酸化介质(1体积的反应介质+1体积的酸)来终止该反应。在不同的孵育时间后测定释放的磷酸的量。
一个酶促单位(U)定义为在1分钟释放1μM无机磷酸的酶量。
3.在不同pH水解植酸盐的条件
水解是在40℃、10ml的pH 4至6.5的250mM乙酸缓冲液，或pH 3的200mM甘氨酸缓冲液(含0.340mM的植酸钠、0.04或0.08U/ml的植酸酶)中进行的。样品在不同时间采集120分钟。通过添加三氯醋酸来终止反应。
不稀释直接分析该磷酸。
4.磷酸的分析
通过比色法来观察释放的磷酸的量。即时准备的该显色溶液含硫酸铁(380mM，1体积)和七钼酸铵(12mM，4体积)。在室温显色(1体积的反应介质+1体积的显色溶液)30分钟后在700nm分析吸光度，使用UV/可视分光光度计(Beckman DU 530)。
利用磷酸二氢钾事先建立标准曲线。
结果
1.检测的植酸酶
根据不同标准，检测的植酸酶彼此不同：(1)生物化学特征(最适pH，立体专一性：3，4或6植酸酶)，(2)水解的磷酸键数目。
所有这些植酸酶具有接近5的最适水解pH；然而AN和PL植酸酶具有另外的最适pH 2.5。三种将磷酸盐完全水解(SC，DC，小麦)。首先水解的位置为3-位(AN，PL，DC)或6-位(PL)，或4-位(小麦)(表1)。
表1：植酸酶生化特性的比较
 来源  Km  (μM)  最适pH  最适温度  (℃)  水解的磷酸  键数目  立体专一性  (磷酸键水解的顺序) 黑曲霉(1)  40/27  2.5-5.5  55/58  5  3/4/5/6/1 Peniophora lycii(1)  33  2.5-5.5  58  5  6/3(pH5.5)  3/6(pH3和5.5) 绳状青霉菌(2)  550  4-5  50  5或6  3/4
小麦(3) 22  5-7  55  6  4/3/5/6/1/2Schwanniomyces castellii(4) 38  4.4  77  6  ？Debaryomycescastellii 236  4-4.5  60  6  3/4/5/6/1-2
(1)Ullah，A.H.J，and Sethumadhavan，K.，(2003)PhyA gene productof Aspergillus ficuum and Peniophora lycii produces dissimilar phytases.Biochemical and Biophysical Research Communications 303：463-468
(2)2003年6月13日提交的WO 03054199，Bohlmann，R.，Moussu，F.，Nore，O.，Pierrard，J.，Saunier，D.，Testeniere，0.，New polynucleotideencoding fungal phytase，useful as feed additive to improve phosphateassimilation，also new strain of Penicillium.
(3)Nakano，T.，Joh，T.，Narita，K.，Hayakawa，T.(2000)Thepathway of dephosphorylation of myo-Inositol Hexakisphosphate byphytases from Wheat Bran of Tricicum aestivum L.cv Nourin#61.Biosci.Biotechnol.Biochem.，64：995-1003
(4)Segueilha，L.，Lambrechts，C，Boze，H.，Moulin，G.and Galzy，P.(1992)Purification and Properties of the phytase from Schwanniomycescastellii.J.Ferment.Bioeng.74(1)：7-11.
2.在不同pH下6种植酸酶水解植酸效力的比较
在0.340mM植酸盐的存在下完成该研究。引入的酶量对应0.08U/ml的植酸酶，在pH 5.5的标准条件下测量。检测的pH值为3，4，5.5，6，6.5。反应进行120分钟。根据时间采集样品，通过酸化终止反应，并通过比色法来分析磷酸。
不同植酸酶的比较以水解效力的函数进行，即释放的磷酸盐百分比相对于理论的百分比。结果如图1A所示。
根据文献，4种植酸酶(PF，SC，DC，B)能够将植酸完全水解为肌醇和磷酸；2种植酸酶(AN和PL)仅水解5个键，即83％的潜在磷。
在pH 3和pH 4的检测条件下，4种植酸酶(SC，PF，DC和PL)水解至少80％的植酸。小麦植酸酶在pH 3和pH 4活性不高。对于pH 5.5以上的pH值而言，没有植酸酶能够水解多于70％的植酸。PF和DC植酸酶在pH 6.5活性不高。AN植酸酶对pH的变化敏感性最小；然而其仅仅释放60至70％的磷，即低于期望值10％至20％。(图2A)。
起始的磷酸释放率比较显示植酸酶之间的大量异源性(图3A)。在酸性pH下最有效的植酸酶是Schwanniomyces castellii植酸酶，而5.5以上的pH值下黑曲霉植酸酶最为有效。不考虑所检测的条件，小麦植酸酶是效力最低的植酸酶。
3.存在组合的植酸酶时，pH对磷酸释放率的影响
为了改善植酸水解的效力，检测了两种植酸酶的几种组合。每一植酸酶以0.04U/ml引入，即在反应试管中的总值为0.08U/ml。系统性地检测了水解6个磷酸键的DC植酸酶与其他的水解5或6个磷酸键的植酸酶的组合。也使用其他组合进行了比较，首先是能够释放6和5个磷酸的植酸酶(SC/AN)，其次是，具有非常相似的生化特性的两种植酸酶PL/AN(图1B)。
全面的分析使得可能显示两种植酸酶的组合能够大部分地促进植酸水解的效力。尽管，在相同的条件下，没有植酸酶能够完全水解植酸，对于2种混合物(DC/AN和SC/AN)，无论pH是多少，100％至85％的磷酸键被水解。对于DC/PL组合，在酸性pH下，也观察到约20％的得率。PL/AN、DC/PF和DC/SC组合几乎没有提供改进(图2B)。
起始水解率的比较显示，与单独的植酸酶和其他的植酸酶组合比较，SC/AN组合和DC/AN组合存在强的协同效应。当使用组合时，水解率的pH-相关差异是最小的。其他组合较不有效，仅在某些pH可观察到协同效应，例如对DC/PL而言在pH 3和pH 4(图3)。
这种协同效应显示在很大程度上是归因于植酸酶水解全部磷酸的能力。此外，最佳的组合涉及对活性具有互补最适pH(2.5-4.5)的植酸酶。但是，应注意，在水解效力方面最不有效的植酸酶几乎没有协同效应，例如小麦的植酸酶和绳状青霉菌的植酸酶。
4.植酸酶的浓度和比例对植酸水解效力的影响
我们比较了植酸酶的用量(剂量效应)和植酸酶混合物的比例对植酸水解的影响。采用三种组合DC/AN、DC/PL和AN/PL，并检测了2种植酸酶浓度(0.04和0.08U/ml)(表2和3)。
表2：不同组合的植酸水解百分比的比较，在两个终浓度0.04和0.08U/ml下检测。前三列给出了0.08U/ml浓度的单独的三种植酸酶的值。


括号中的值代表用0.04U/ml获得的值与0.08U/ml获得的值的比值。
在研究中，酶的混合物(总浓度0.08U/ml)获得的水解百分比高于单独使用酶(0.08U/ml)时获得的百分比，并在pH从3至6的变化范围中，对于AN/DC和PL/DC混合物而言接近于100％。AN/PL混合物不显著增加每一植酸酶单独使用时观察的水解百分比。所提供的总量的2倍降低(0.04U/ml)，并不能够诱导释放的磷酸的2倍减少。在某些情况(在pH 4和pH 5.5的AN/DC和PL/DC，以及在pH 4至pH6的AN/PL)下，水解的百分比相当于在0.08U/ml观察到的百分比(表3)。
表3：不同组合的植酸起始水解率(μmol/ml/min)的比较，在两种终浓度0.04和0.08U/ml下检测。
前三列给出了三种植酸酶单独在浓度0.08U/ml时的值。


括号中的值代表用0.04U/ml获得的水解率与0.08U/ml获得的水解率的比值。
因此，植酸酶的组合使得可能在反应介质中将植酸酶的量降低一半，同时在宽pH范围内维持相同的水解效力。这是对磷酸释放的清楚的剂量效应。
另一方面，0.04U/ml的植酸酶存在时，植酸水解的起始率至少比0.08U/ml存在时的起始率低一半(表3)。这些结果支持了下述假说：植酸酶间的协同作用可基本上允许完全水解存在的磷酸。
在反应介质中的每一植酸酶的比例并不表现出对水解效力具有大量影响(表4)。在所有的情况下观察到磷酸的释放量提高，对含50％每一种植酸酶的组合而言有轻微的改进，主要在5.5以上的pH时。
表4：作为混合物中每一种植酸酶比例的函数的植酸水解百分比的比较。在所有情况下，总量保持在0.08U/ml。

在我们的实验条件下，没有一种植酸酶将植酸完全水解为肌醇和磷酸，尽管根据文献它们中的4种能够释放全部的磷酸。4种植酸酶，SC、PF、DC和PL在pH 3和4下水解80％的磷酸键。两种混合物DC/AN和SC/AN在所检测的所有pH下水解80％至100％的磷酸键。
3-植酸酶(AN，DC，PF)，4-植酸酶(B)或6-植酸酶(PL)类型的植酸酶组合并不提供任何显著的改善。
植酸酶间的互补和协同作用显示依赖于对每一植酸酶特异的2个标准：(1)它们作为pH函数的活性特征，(2)它们水解或不水解全部磷酸的能力。
这种组合在动物营养学中的应用可能将所用的植酸酶的用量降低至少20％，并由此降低成本。饲料中植酸来源的磷酸含量也会被提高，改进食物价值，由此使得可能降低有机磷酸的摄取。因此，由不可利用的磷酸废物所造成的污染会被减少。
序列表
<110>安迪苏法国联合股份有限公司
<120>植酸酶的组合
<130>HL/SG/EP-50016
<150>FR05.07335
<151>2005-08-07
<160>7
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>461
<212>PRT
<213>Schwanniomyces castellii(Debaryomyces occidentallis)
<400>1
Met Val Ser Ile Ser Lys Leu Ile Asn Asn Gly Leu Leu Leu Ala Gly
1               5                   10                  15
Gln Ser Val Tyr Gln Asp Leu Ala Thr Pro Gln Gln Ser Ser Val Glu
            20                  25                  30
Gln Tyr Asn Ile Ile Arg Phe Leu Gly Gly Ser Gly Pro Tyr Ile Gln
        35                  40                  45
Arg Ser Gly Tyr Gly Ile Ser Thr Asp Ile Pro Asp Gln Cys Thr Ile
    50                  55                  60
Lys Gln Val Gln Leu Met Ser Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Ser Gly Lys Lys Leu Lys Thr Ile Tyr Gly Lys Leu Lys Ser Tyr
                85                  90                  95
Asn Gly Thr Phe Thr Gly Ser Leu Ala Phe Leu Asn Asp Tyr Glu Tyr
            100                 105                 110
Phe Val Pro Asp Asp Ser Leu Tyr Glu Lys Glu Thr Ser Ala Leu Asn
        115                 120                 125
Ser Gln Gly Leu Phe Ala Gly Thr Thr Asp Ala Leu Arg His Gly Ala
    130                 135                 140
Ala Phe Arg Ala Lys Tyr Gly Ser Leu Tyr Lys Gln Asn Ser Thr Leu
145                 150                 155                 160
Pro Val Phe Thr Ser Asn Ser Asn Arg Val Tyr Gln Thr Ser Glu Tyr
                165                 170                 175
Phe Ala Arg Gly Phe Leu Gly Asp Glu Phe Ser Asp Ala Thr Val His
            180                 185                 190
Phe Ala Ile Ile Asp Glu Asp Pro Lys Met Gly Val Asn Ser Leu Thr
        195                 200                 205
Pro Arg Ala Ala Cys Asp Asn Tyr Asn Glu Asp Val Asn Asp Gly Ile
    210                 215                 220
Val Asn Gln Tyr Ser Thr Asp Tyr Leu Asp Glu Ala Leu Lys Arg Phe
225                 230                 235                 240
Gln Ser Ser Asn Pro Gly Leu Asn Leu Thr Ser Glu Asp Val Tyr Gln
                245                 250                 255
Leu Phe Ala Tyr Cys Ala Tyr Glu Thr Asn Val Lys Gly Ala Ser Pro
            260                 265                 270
Phe Cys Asp Leu Phe Thr Asn Glu Glu Tyr Ile Gln Tyr Ser Tyr Ser
        275                 280                 285
Val Asp Leu Ser Asn Tyr Tyr Ser His Gly Ala Gly His Asn Leu Thr
    290                 295                 300
Lys Thr Ile Gly Ser Thr Leu Leu Asn Ala Ser Leu Thr Leu Leu Lys
305                 310                 315                 320
Asp Gly Thr Asn Asp Asn Lys Ile Trp Leu Ser Phe Ser His Asp Thr
                325                 330                 335
Asp Leu Glu Ile Phe His Ser Ala Leu Gly Ile Val Glu Pro Ala Glu
            340                 345                 350
Asp Leu Pro Val Asp Tyr Ile Pro Phe Pro Ser Pro Tyr Ile His Ser
        355                 360                 365
Gln Ile Val Pro Gln Gly Ala Arg Ile Tyr Thr Glu Lys Tyr Ser Cys
    370                 375                 380
Gly Asn Glu Thr Tyr Val Arg Tyr Ile Leu Asn Asp Ala Val Val Pro
385                 390                 395                 400
Ile Pro Lys Cys Ser Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Glu Leu Ser Lys
                405                 410                 415
Phe Glu Glu Tyr Ile Asn Lys Arg Leu Arg Asp Val Asp Phe Val Glu
            420                 425                 430
Gln Cys Asp Leu Lys Asp Ala Pro Thr Glu Val Thr Phe Tyr Trp Asp
        435                 440                 445
Tyr Thr Ser Val Asn Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Asn Gly
    450                 455                 460
<210>2
<211>461
<212>PRT
<213>Debaryomyces castellii
<400>2
Met Val Ser Val Ser Lys Leu Ile Asn Asn Gly Leu Leu Leu Val Gly
1               5                   10                  15
Gln Gly Ala Tyr Gln Asp Leu Ala Ser Pro Gln Gln Ala Ser Val Glu
            20                  25                  30
Gln Tyr Asn Ile Ile Arg Phe Leu Gly Gly Ala Ala Pro Tyr Ile Gln
        35                  40                  45
Asn Lys Gly Phe Gly Ile Ser Thr Asp Ile Pro Asp Gln Cys Thr Leu
    50                  55                  60
Glu Gln Val Gln Leu Phe Ser Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Thr
65                  70                  75                  80
Gly Ser Gly Lys Lys Tyr Lys Ala Val Tyr Glu Lys Leu Met Ser Tyr
                85                  90                  95
Asn Gly Thr Phe Lys Gly Glu Leu Ala Phe Leu Asn Asp Asp Tyr Glu
            100                 105                 110
Tyr Phe Val Pro Asp Ser Val Tyr Leu Glu Lys Glu Thr Ser Pro Lys
        115                 120                 125
Asn Ser Asp Ser Ile Tyr Ala Gly Thr Thr Asp Ala Met Lys His Gly
    130                 135                 140
Ile Ala Phe Arg Thr Lys Tyr Gly Glu Leu Phe Asp Thr Asn Asp Thr
145                 150                 155                 160
Leu Pro Val Phe Thr Ser Asn Ser Gly Arg Val Tyr Gln Thr Ser Gln
                165                 170                 175
Tyr Phe Ala Arg Gly Phe Met Gly Asp Asp Phe Ser Asn Asp Thr Val
            180                 185                 190
Lys Thr Asn Ile Ile Ser Glu Asp Ala Asp Met Gly Ala Asn Ser Leu
        195                 200                 205
Thr Pro Arg Asp Gly Cys Phe Asn Tyr Asn Glu Asn Ala Asn Thr Ala
    210                 215                 220
Ile Val Asp Glu Tyr Thr Thr Glu Tyr Leu Thr Lys Ala Leu Asn Arg
225                 230                 235                 240
Phe Lys Ala Ser Asn Pro Gly Leu Asn Ile Thr Glu Asp Asp Val Ser
                245                 250                 255
Asn Leu Phe Gly Tyr Cys Ala Tyr Glu Leu Asn Val Lys Gly Ala Ser
            260                 265                 270
Pro Met Cys Asp Ile Phe Thr Asn Glu Glu Phe Ile Gln Tyr Ser Tyr
        275                 280                 285
Ser Val Asp Leu Asp Asp Tyr Tyr Ser Asn Ser Ala Gly Asn Asn Met
    290                 295                 300
Thr Arg Val Ile Gly Ser Thr Leu Leu Asn Ala Ser Leu Glu Leu Leu
305                 310                 315                 320
Asn His Asp Lys Asn Glu Asn Lys Ile Trp Leu Ser Phe Thr His Asp
                325                 330                 335
Thr Asp Ile Glu Ile Phe His Ser Ala Ile Gly Ile Leu Ile Pro Asp
            340                 345                 350
Glu Asp Leu Pro Val Asp Tyr Thr Pro Phe Pro Ser Pro Tyr Ser His
        355                 360                 365
Val Gly Ile Thr Pro Gln Gly Ala Arg Thr Ile Ile Glu Lys Tyr Ala
    370                 375                 380
Cys Gly Asn Glu Ser Tyr Val Arg Tyr Val Ile Asn Asp Ala Val Ile
385                 390                 395                 400
Pro Ile Lys Lys Cys Ser Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Asn Leu Asn
                405                 410                 415
Asp Tyr Asn Asp Tyr Val Ala Glu Arg Val Ala Gly Thr Asn Tyr Val
            420                 425                 430
Glu Gln Cys Gly Asn Asn Asn Ala Ser Ala Val Thr Phe Tyr Trp Asp
        435                 440                 445
Tyr Glu Thr Thr Asn Tyr Thr Ala Ser Leu Ile Asn Ser
    450                 455                 460
<210>3
<211>467
<212>PRT
<213>黑曲霉
<400>3
Met Gly Val Ser Ala Val Leu Leu Pro Leu Tyr Leu Leu Ser Gly Val
1               5                   10                  15
Thr Ser Gly Leu Ala Val Pro Ala Ser Arg Asn Gln Ser Ser Cys Asp
            20                  25                  30
Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser Leu Ala Asn Glu Ser Val Ile Ser
    50                  55                  60
Pro Glu Val Pro Ala Gly Cys Arg Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser
65                  70                  75                  80
Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser
                85                  90                  95
Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln Asn Ala Thr Thr Phe Asp Gly Lys
            100                 105                 110
Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu
        115                 120                 125
Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr
    130                 135                 140
Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Arg Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala Ser Gly Lys Lys Phe Ile Glu Gly
                165                 170                 175
Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys Asp Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser
            180                 185                 190
Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Ser Asn Asn
        195                 200                 205
Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala
    210                 215                 220
Asp Thr Val Glu Ala Asn Phe Thr Ala Thr Phe Val Pro Ser Ile Arg
225                 230                 235                 240
Gln Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser Gly Val Thr Leu Thr Asp Thr Glu
                245                 250                 255
Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys Ser Phe Asp Thr Ile Ser Thr Ser
            260                 265                 270
Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp
        275                 280                 285
Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly
    290                 295                 300
His Gly Ala Gly Ash Pro Leu Gly Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr His Ser Pro Val His Asp Asp Thr
                325                 330                 335
Ser Ser Asn His Thr Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn
            340                 345                 350
Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile
        355                 360                 365
Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr
    370                 375                 380
Thr Val Glu Asn Ile Thr Gln Thr Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr
385                 390                 395                 400
Val Pro Phe Ala Ser Arg Leu Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala
                405                 410                 415
Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro
            420                 425                 430
Leu His Gly Cys Pro Val Asp Ala Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser
        435                 440                 445
Phe Val Arg Gly Leu Ser Phe Ala Arg Ser Gly Gly Asp Trp Ala Glu
    450                 455                 460
Cys Phe Ala
465
<210>4
<211>540
<212>PRT
<213>绳状青霉菌
<400>4
Met Leu Lys Leu Tyr Val Ala Ala Cys Leu Val Val Ala Gly Val Ser
1               5                   10                  15
Ile Pro Thr Asp Pro Thr Val Thr Gln Val Pro Asp Tyr Phe Gln Thr
            20                  25                  30
Ser Tyr Gly Pro Tyr Ala Gly Ala Thr Lys Ala Gly Gly Ala Pro Phe
        35                  40                  45
Leu Ala Gln Thr Asn Pro Ile Tyr Ser Gln Pro Thr Tyr Val Ala Asn
    50                  55                  60
Thr Pro Leu Val Thr Thr Leu Pro Ile Ser Gly Glu Pro His Asp Gly
65                  70                  75                  80
Asn Ile Phe Gly Trp Met Gly Thr Leu Ser Pro Tyr Gln Pro Ser Pro
                 85                  90                  95
Asp Gly Phe Gly Val Asp Glu Tyr Pro Leu Pro Pro Gly Ala Asn Ile
            100                 105                 110
Thr Gln Ile His Met Val His Arg His Gly Ser Arg Tyr Pro Thr Ser
        115                 120                 125
Asn Ser Ala Ile Ser Asp Trp Ala Lys Lys Ile Met Gln Tyr Arg Ser
    130                 135                 140
Asn Gly Thr Val Phe Ser Gly Glu Leu Glu Phe Leu Asn Ala Trp Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Gln Leu Gly Gln Ala Glu Leu Thr Ala Arg Gly Arg Gln Glu Leu
                165                 170                 175
Phe Asp Ser Gly Ile Leu His Trp Phe Asn Tyr Gly Lys Leu Tyr Asp
            180                 185                 190
Pro Ala Ser Lys Ile Ile Ala Arg Thr Thr Thr Met Val Arg Met Leu
        195                 200                 205
Gln Ser Ala Glu Asn Phe Leu Asn Gly Phe Phe Gly Pro Asn Trp Thr
    210                 215                 220
Asn Asn Ala Thr Leu Glu Val Ile Ile Glu Ser Thr Gly Phe Asn Asn
225                 230                 235                 240
Ser Leu Ala Gly Asn Asp Met Cys Arg Asn Ala Lys Asn Thr Ser Gly
                245                 250                 255
Gly Asp Ala Val Asn Glu Trp Thr Ala Leu Tyr Leu Gln Lys Ala Thr
            260                 265                 270
Asn Arg Phe Arg Ser Glu Ile Ser Gly Ser Leu Asn Trp Thr Val Asp
        275                 280                 285
Asp Thr Tyr Asn Ala Gln Ser Met Cys Pro Tyr Glu Thr Val Ala Leu
    290                 295                 300
Gly Tyr Ser Pro Phe Cys Thr Leu Phe Ser Trp Glu Glu Trp Gln Gly
305                 310                 315                 320
Phe Gln Tyr Val Asn Asp Leu Asn Leu Tyr Gly Asn Tyr Gly Met Gly
                325                 330                 335
Ser Pro Val Gly Arg Ala Ile Gly Leu Gly Phe Val Glu Glu Leu Ile
            340                 345                 350
Ala Arg Leu Gln Gly Gln Ile Pro Asn Pro Pro Glu Asp Ser Ile Gly
        355                 360                 365
Phe Asn Gln Ser Leu Asp Asp Ser Ala Ala Thr Phe Pro Leu Asn Gln
    370                 375                 380
Thr Ile Tyr Phe Asp Phe Ser His Asp Asn Glu Met Phe Ser Met Leu
385                 390                 395                 400
Thr Ala Leu Gly Leu Thr Gln Phe Gly Asp Tyr Leu Ser Pro Thr Lys
                405                 410                 415
Pro Ser Ala Asp Arg Ser Leu Ile Gly Ser His Ile Val Pro Phe Ser
            420                 425                 430
Ala Thr Phe Val Phe Glu Ile Ile Lys Ala Pro Gly Leu Val Arg Glu
        435                 440                 445
Asn Arg Ser Lys Tyr Cys Gly Glu Ser Val Tyr Glu Asn Thr Ser Glu
    450                 455                 460
Glu Thr Thr Tyr Ile His Leu Val Ile Asn Gln Arg Thr Val Pro Leu
465                 470                 475                 480
Gly Gln Ser Ile Ser Ala Cys Gly Gln Arg Asp Asp Gly Trp Cys Glu
                485                 490                 495
Ile Ser Ala Phe Ile Gln Ala Gln Lys Glu Asn Ile Val Lys Ala Asn
            500                 505                 510
Tyr Glu Glu Ser Cys Phe Gly Asn Trp Ser Ile Pro Ala Tyr Gly Glu
        515                 520                 525
Ile Arg Asp Gly Ala Ile Pro Lys Asn Ala Thr Ser
    530                 535                 540
<210>5
<211>439
<212>PRT
<213>Peniophora lycii
<400>5
Met Val Ser Ser Ala Phe Ala Pro Ser Ile Leu Leu Ser Leu Met Ser
1               5                   10                  15
Ser Leu Ala Leu Ser Thr Gln Phe Ser Phe Val Ala Ala Gln Leu Pro
            20                  25                  30
Ile Pro Ala Gln Asn Thr Ser Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Pro Phe Phe
        35                  40                  45
Pro Val Glu Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Glu Gly Cys Thr Val Thr Gln
    50                  55                  60
Val Asn Leu Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Trp Pro Thr Ser Gly Ala
65                  70                  75                  80
Arg Ser Arg Gln Val Ala Ala Val Ala Lys Ile Gln Met Ala Arg Pro
                85                  90                  95
Phe Thr Asp Pro Lys Tyr Glu Phe Leu Asn Asp Phe Val Tyr Lys Phe
            100                 105                 110
Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Phe Gly Ala Asn Gln Ser His Gln Thr
        115                 120                 125
Gly Thr Asp Met Tyr Thr Arg Tyr Ser Thr Leu Phe Glu Gly Gly Asp
    130                 135                 140
Val Pro Phe Val Arg Ala Ala Gly Asp Gln Arg Val Val Asp Ser Ser
145                 150                 155                 160
Thr Asn Trp Thr Ala Gly Phe Gly Asp Ala Ser Gly Glu Thr Val Leu
                165                 170                 175
Pro Thr Leu Gln Val Val Leu Gln Glu Glu Gly Asn Cys  Thr Leu Cys
            180                 185                 190
Asn Asn Met Cys Pro Asn Glu Val Asp Gly Asp Glu Ser Thr Thr Trp
        195                 200                 205
Leu Gly Val Phe Ala Pro Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala Ala
    210                 215                 220
Pro Ser Ala Asn Leu Ser Asp Ser Asp Ala Leu Thr Leu Met Asp Met
225                 230                 235                 240
Cys Pro Phe Asp Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ala Ser Pro Phe Cys Asp
                245                 250                 255
Leu Phe Thr Ala Glu Glu Tyr Val Ser Tyr Glu Tyr Tyr Tyr Asp Leu
            260                 265                 270
Asp Lys Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Gly Asn Ala Leu Gly Pro Val Gln
        275                 280                 285
Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Gly Gln Ala
    290                 295                 300
Val Arg Asp Glu Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Asp Pro Ala
305                 310                 315                 320
Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn
                325                 330                 335
Thr Met Val Pro Ile Phe Ala Ala Leu Gly Leu Phe Asn Ala Thr Ala
            340                 345                 350
Leu Asp Pro Leu Lys Pro Asp Glu Asn Arg Leu Trp Val Asp Ser Lys
        355                 360                 365
Leu Val Pro Phe Ser Gly His Met Thr Val Glu Lys Leu Ala Cys Ser
    370                 375                 380
Gly Lys Glu Ala Val Arg Val Leu Val Asn Asp Ala Val Gln Pro Leu
385                 390                 395                 400
Glu Phe Cys Gly Gly Val Asp Gly Val Cys Glu Leu Ser Ala Phe Val
                405                 410                 415
Glu Ser Gln Thr Tyr Ala Arg Glu Asn Gly Gln Gly Asp Phe Ala Lys
            420                 425                 430
Cys Gly Phe Val Pro Ser Glu
        435
<210>6
<211>1623
<212>DNA
<213>小麦
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1623)
<400>6
atg tgg atg tgg agg ggg tcg ctg ccg ctg ctt ctg ctc gcc gcg gcg     48
Met Trp Met Trp Arg Gly Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
gtg gcg gcg gcg gct gag ccg gcg tcg acg ctg gag gga ccg tcg cgg     96
Val Ala Ala Ala Ala Glu Pro Ala Ser Thr Leu Glu Gly Pro Ser Arg
            20                  25                  30
ccg gtg acg gtg ccg ctg cgg gaa gac agg ggc cac gcg gtg gac ctg    144
Pro Val Thr Val Pro Leu Arg Glu Asp Arg Gly His Ala Val Asp Leu
        35                  40                  45
ccg gac acg gac ccc cgg gtg cag cgc cgg gtc aca ggc tgg gct ccc    192
Pro Asp Thr Asp Pro Arg Val Gln Arg Arg Val Thr Gly Trp Ala Pro
    50                  55                  60
gag cag atc gcc gtc gcg ctc tcc gcc gct ccc acc tcc gcc tgg gtc    240
Glu Gln Ile Ala Val Ala Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Ala Trp Val
65                  70                  75                  80
tcc tgg atc aca ggg gat ttc cag atg ggc ggc gcc gtc aag ccg ctg    288
Ser Trp Ile Thr Gly Asp Phe Gln Met Gly Gly Ala Val Lys Pro Leu
                85                  90                  95
gac ccc ggc acg gtc ggc agc gtc gtg cgc tac ggc ctc gcc gcc gat    336
Asp Pro Gly Thr Val Gly Ser Val Val Arg Tyr Gly Leu Ala Ala Asp
            100                 105                 110
tct ttg gtc cgc gag gcc acc ggc gac gcg ctc gtg tac agc cag ctc    384
Ser Leu Val Arg Glu Ala Thr Gly Asp Ala Leu Val Tyr Ser Gln Leu
        115                 120                 125
tac ccc ttc gag ggc ctc cag aac tac acc tcc ggc atc atc cac cac    432
Tyr Pro Phe Glu Gly Leu Gln Asn Tyr Thr Ser Gly Ile Ile His His
    130                 135                 140
gtc cgc ctc caa ggg ctt gag cct ggg acg aag tac tac tac cag tgc    480
Val Arg Leu Gln Gly Leu Glu Pro Gly Thr Lys Tyr Tyr Tyr Gln Cys
145                 150                 155                 160
ggc gac ccg gcc atc ccg ggg gcg atg agc gcc gtc cac gcg ttc cgg    528
Gly Asp Pro Ala Ile Pro Gly Ala Met Ser Ala Val His Ala Phe Arg
                165                 170                 175
acg atg ccg gcg gtc ggg ccg cgg agc tac ccg ggg agg atc gcc gtg    576
Thr Met Pro Ala Val Gly Pro Arg Ser Tyr Pro Gly Arg Ile Ala Val
            180                 185                 190
gtg ggg gac ctc ggg ctc acg tac aac acc acc tcg acc gtg gac cac     624
Val Gly Asp Leu Gly Leu Thr Tyr Asn Thr Thr Ser Thr Val Asp His
        195                 200                 205
atg gcg agc aac cgg ccg gac ctg gtc ctc ctc gtc ggc gac gtg  tgc    672
Met Ala Ser Asn Arg Pro Asp Leu Val Leu Leu Val Gly Asp Val Cys
    210                 215                 220
tac gcc aac atg tac ctc acc aac ggc acc gga gcg gac tgc tac tcg     720
Tyr Ala Asn Met Tyr Leu Thr Asn Gly Thr Gly Ala Asp Cys Tyr Ser
225                 230                 235                 240
tgc gcg ttc ggc aag tcg acg ccc atc cac gag acg tac cag ccg cgc     768
Cys Ala Phe Gly Lys Ser Thr Pro Ile His Glu Thr Tyr Gln Pro Arg
                245                 250                 255
tgg gac tac tgg gga agg tac atg gag gcg gtg acg tcg ggg acg ccg     816
Trp Asp Tyr Trp Gly Arg Tyr Met Glu Ala Val Thr Ser Gly Thr Pro
            260                 265                 270
atg atg gtg gtg gaa ggg aac cat gag ata gag gag cag atc ggg aac     864
Met Met Val Val Glu Gly Asn His Glu Ile Glu Glu Gln Ile Gly Asn
        275                 280                 285
aag acg ttc gcg gcc tac cgc tcc cgg ttc gcg ttc ccg tcg acg gag     912
Lys Thr Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ala Phe Pro Ser Thr Glu
    290                 29                 5300
agc ggg tcc ttc tcc ccc ttc tac tac tcg ttc gac gcc ggc ggg atc     960
Ser Gly Ser Phe Ser Pro Phe Tyr Tyr Ser Phe Asp Ala Gly Gly Ile
305                 310                 315                 320
cat ttc ctc atg ctc ggc gcc tac gcc gac tac ggc agg tca ggg gag     1008
His Phe Leu Met Leu Gly Ala Tyr Ala Asp Tyr Gly Arg Ser Gly Glu
                325                 330                 335
cag tac aga tgg ctg gag aag gac ctg gcg aag gtg gac agg tcg gtg    1056
Gln Tyr Arg Trp Leu Glu Lys Asp Leu Ala Lys Val Asp Arg Ser Val
            340                 345                 350
acg ccg tgg ctg gtc gcc ggc tgg cac gcg cca tgg tac acc acc tac    1104
Thr Pro Trp Leu Val Ala Gly Trp His Ala Pro Trp Tyr Thr Thr Tyr
        355                 360                 365
aag gct cac tac agg gag gtg gag tgc atg aga gtg gcc atg gag gag    1152
Lys Ala His Tyr Arg Glu Val Glu Cys Met Arg Val Ala Met Glu Glu
    370                 375                 380
ctg ctc tac tcc cac ggc ctc gac atc gcc ttc acc ggc cat gtg cac    1200
Leu Leu Tyr Ser His Gly Leu Asp Ile Ala Phe Thr Gly His Val His
385                 390                 395                 400
gcg tat gag cgc tcc aac cgg gtg ttc aac tac acg ctg gac ccg tgc    1248
Ala Tyr Glu Arg Ser Asn Arg Val Phe Asn Tyr Thr Leu Asp Pro Cys
                405                 410                 415
ggc gcc gtg cac atc tcg gtg ggc gac ggc ggg aac cgc gag aag atg    1296
Gly Ala Val His Ile Ser Val Gly Asp Gly Gly Asn Arg Glu Lys Met
            420                 425                 430
gcc acc acc cac gcc gac gag cca ggg cac tgc ccg gac ccg cgg ccc    1344
Ala Thr Thr His Ala Asp Glu Pro Gly His Cys Pro Asp Pro Arg Pro
         435                 440                 445
aag ccc aac gcc ttc atc ggc ggc ttc tgc gcc ttt aac ttc acg tcc    1392
Lys Pro Asn Ala Phe Ile Gly Gly Phe Cys Ala Phe Asn Phe Thr Ser
    450                 455                 460
ggc ccg gcc gcc ggc agg ttc tgc tgg gac cgg cag ccg gac tac agc    1440
Gly Pro Ala Ala Gly Arg Phe Cys Trp Asp Arg Gln Pro Asp Tyr Ser
465                 470                 475                 480
gcc tac cgg gag agc agc ttc ggc cac ggc atc ctc gag gtg aag aac    1488
Ala Tyr Arg Glu Ser Ser Phe Gly His Gly Ile Leu Glu Val Lys Asn
                485                 490                 495
gag acg cac gct ctg tgg aga tgg cac agg aac cag gac atg tac ggg    1536
Glu Thr His Ala Leu Trp Arg Trp His Arg Asn Gln Asp Met Tyr Gly
            500                 505                 510
agc gcc gga gat gag att tac att gtc cgg gag ccg cac agg tgc ttg    1584
Ser Ala Gly Asp Glu Ile Tyr Ile Val Arg Glu Pro His Arg Cys Leu
        515                 520                 525
cac aaa cac aac tgg acc agg ccc gca cac ggt ccg taa                1623
His Lys His Asn Trp Thr Arg Pro Ala His Gly Pro
    530                 535                 540
<210>7
<211>540
<212>PRT
<213>小麦
<400>7
Met Trp Met Trp Arg Gly Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Ala Ala Glu Pro Ala Ser Thr Leu Glu Gly Pro Ser Arg
            20                  25                  30
Pro Val Thr Val Pro Leu Arg Glu Asp Arg Gly His Ala Val Asp Leu
        35                  40                  45
Pro Asp Thr Asp Pro Arg Val Gln Arg Arg Val Thr Gly Trp Ala Pro
    50                  55                  60
Glu Gln Ile Ala Val Ala Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Ala Trp Val
65                  70                  75                  80
Ser Trp Ile Thr Gly Asp Phe Gln Met Gly Gly Ala Val Lys Pro Leu
                85                  90                  95
Asp Pro Gly Thr Val Gly Ser Val Val Arg Tyr Gly Leu Ala Ala Asp
            100                 105                 110
Ser Leu Val Arg Glu Ala Thr Gly Asp Ala Leu Val Tyr Ser Gln Leu
        115                 120                 125
Tyr Pro Phe Glu Gly Leu Gln Asn Tyr Thr Ser Gly Ile Ile His His
    130                 135                 140
Val Arg Leu Gln Gly Leu Glu Pro Gly Thr Lys Tyr Tyr Tyr Gln Cys
145                 150                 155                 160
Gly Asp Pro Ala Ile Pro Gly Ala Met Ser Ala Val His Ala Phe Arg
                165                 170                 175
Thr Met Pro Ala Val Gly Pro Arg Ser Tyr Pro Gly Arg Ile Ala Val
            180                 185                 190
Val Gly Asp Leu Gly Leu Thr Tyr Asn Thr Thr Ser Thr Val Asp His
        195                 200                 205
Met Ala Ser Asn Arg Pro Asp Leu Val Leu Leu Val Gly Asp Val Cys
    210                 215                 220
Tyr Ala Asn Met Tyr Leu Thr Asn Gly Thr Gly Ala Asp Cys Tyr Ser
225                 230                 235                 240
Cys Ala Phe Gly Lys Ser Thr Pro Ile His Glu Thr Tyr Gln Pro Arg
                245                 250                 255
Trp Asp Tyr Trp Gly Arg Tyr Met Glu Ala Val Thr Ser Gly Thr Pro
            260                 265                 270
Met Met Val Val Glu Gly Asn His Glu Ile Glu Glu Gln Ile Gly Asn
        275                 280                 285
Lys Thr Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ala Phe Pro Ser Thr Glu
    290                 295                 300
Ser Gly Ser Phe Ser Pro Phe Tyr Tyr Ser Phe Asp Ala Gly Gly Ile
305                 310                 315                 320
His Phe Leu Met Leu Gly Ala Tyr Ala Asp Tyr Gly Arg Ser Gly Glu
                325                 330                 335
Gln Tyr Arg Trp Leu Glu Lys Asp Leu Ala Lys Val Asp Arg Ser Val
            340                 345                 350
Thr Pro Trp Leu Val Ala Gly Trp His Ala Pro Trp Tyr Thr Thr Tyr
        355                 360                 365
Lys Ala His Tyr Arg Glu Val Glu Cys Met Arg Val Ala Met Glu Glu
    370                 375                 380
Leu Leu Tyr Ser His Gly Leu Asp Ile Ala Phe Thr Gly His Val His
385                 390                 395                 400
Ala Tyr Glu Arg Ser Asn Arg Val Phe Asn Tyr Thr Leu Asp Pro Cys
                405                 410                 415
Gly Ala Val His Ile Ser Val Gly Asp Gly Gly Asn Arg Glu Lys Met
            420                 425                 430
Ala Thr Thr His Ala Asp Glu Pro Gly His Cys Pro Asp Pro Arg Pro
        435                 440                 445
Lys Pro Asn Ala Phe Ile Gly Gly Phe Cys Ala Phe Asn Phe Thr Ser
    450                 455                 460
Gly Pro Ala Ala Gly Arg Phe Cys Trp Asp Arg Gln Pro Asp Tyr Ser
465                 470                 475                 480
Ala Tyr Arg Glu Ser Ser Phe Gly His Gly Ile Leu Glu Val Lys Asn
                485                 490                 495
Glu Thr His Ala Leu Trp Arg Trp His Arg Asn Gln Asp Met Tyr Gly
            500                 505                 510
Ser Ala Gly Asp Glu Ile Tyr Ile Val Arg Glu Pro His Arg Cys Leu
        515                 520                 525
His Lys His Asn Trp Thr Arg Pro Ala His Gly Pro
    530                 535                 540