GDF 捕获物和促红细胞生成素受体激活剂联合应用以增加 红细胞水平 发明背景 成熟的红细胞或红血球负责脊椎动物循环系统中的氧运输。 红细胞包含高浓度的血红 蛋白， 血红蛋白是一种蛋白， 其在相对高的氧分压 (pO2) 下在肺中与氧结合， 并将氧送递至 具有相对低 pO2 的身体区域。
成熟的红细胞在称为红细胞生成的过程中由多能造血干细胞产生。 出生后红细胞 生成主要在骨髓和脾的红髓中进行。 各种信号转导途径的协同作用控制细胞增殖、 分化、 存 活和死亡的平衡。 在正常条件下， 红细胞以维持体内恒定的红细胞量的速率生成， 且响应于 各种刺激 ( 包括上升或下降的氧张力或组织需求 ) 可增加或减少其生成。红细胞生成的过 程开始于谱系定向的前体细胞的形成， 并通过一系列的不同前体细胞类型进行。红细胞生 成的最终阶段出现为网织红细胞， 其释放进入血流， 并失去它们的线粒体和核糖体， 同时呈 现成熟红细胞的形态。在血液中网织红细胞的上升水平或者网织红细胞 ： 红细胞的上升比 例提示红细胞产生速率上升。
促红细胞生成素 (EPO) 被广泛认为是脊椎动物中出生后红细胞生成的最重要的 正调节剂。EPO 调节对减少的组织氧张力 ( 低氧 ) 和低红细胞水平或低血红蛋白水平的代 偿性红细胞生成反应。在人体内， 上升的 EPO 水平通过刺激骨髓和脾中红细胞祖先的生成 而促进红细胞形成。在小鼠中， EPO 主要增加脾中的红细胞生成。
EPO 的效果由属于细胞因子受体超家族的细胞表面受体介导。人 EPO 受体基因编 码 483 个氨基酸的跨膜蛋白质， 而活性 EPO 受体被认为作为多聚复合物存在， 即使在不存在 配体下 ( 参见美国专利号 6,319,499)。哺乳动物细胞中表达的克隆的全长 EPO 受体以与 天然受体在红细胞祖细胞上的亲和力类似的亲和力与 EPO 结合。EPO 与其受体的结合引起 构象变化， 导致受体激活和生物学效果， 包括不成熟成红细胞的增加的增殖、 不成熟成红细 胞的增加的分化和红细胞祖细胞中降低的凋亡 (Liboi 等人 , 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:11351-11355; Koury 等人 , 1990, Science 248:378-381)。
医生们在各种临床情况下采用各种形式的重组 EPO 来增加红细胞水平， 特别用于 贫血的治疗。贫血是一种宽泛限定的状况， 其特征在于血液中的血红蛋白或红细胞低于正 常水平。 在一些情况下中， 贫血是由红细胞的生成或存活中的原发性病症所引起的。 更通常 地， 贫血继发于其它系统的疾病 (Weatherall & Provan (2000) Lancet 355， 1169-1175)。 贫血可由红细胞生成速率下降或破坏速率上升导致， 或者由因出血引起的红细胞丢失导 致。贫血可由多种病症引起， 所述病症包括， 例如， 慢性肾功能衰竭、 化学疗法治疗、 骨髓异 常增生综合征、 类风湿关节炎以及骨髓移植。
以 EPO 治疗通常导致健康人在一周中血红蛋白上升约 1-3 g/dL。 当施用至贫血个 体时， 该治疗方案通常提供血红蛋白和红细胞水平的实质上升， 并使得生活质量改善和存 活延长。 EPO 并非一律有效， 许多个体甚至在高剂量下是难治的 (Horl 等人 (2000) Nephrol Dial Transplant 15， 43-50)。50% 以上的癌症患者对 EPO 的反应不足， 大约 10% 的末期肾 疾病患者具有低反应性 (Glaspy 等人 (1997) J Clin Oncol 15， 1218-1234 ； Demetri 等人
(1998) J Clin Oncol 16， 3412-3425)， 以及不到 10% 的骨髓异常增生综合征患者有利地反 应 (Estey (2003) Curr Opin Hematol 10， 60-67)。 一些因素， 包括炎症、 铁和维生素缺乏、 透析不充分、 铝毒性以及甲状旁腺功能亢进可预测较差的治疗反应。对 EPO 抵抗的分子机 制仍然不清楚。近来的证据提出， 较高剂量的 EPO 可与心血管发病率的增加风险、 肿瘤生长 和某些患者群中的死亡率有关 (Krapf 等人 , 2009, Clin J Am Soc Nephrol 4:470-480; Glaspy, 2009, Annu Rev Med 60:181-192)。因此已建议， 基于 EPO 的治疗化合物 ( 促红 细胞生成素 - 刺激剂， ESAs) 以足以避免对红细胞输注的需求的最低剂量施用 (Jelkmann 等 人 , 2008, Crit Rev Oncol. Hematol 67:39-61)。
因此， 本公开内容的一个目的是提供提高患者红细胞水平的替代性方法， 其将允 许应用降低剂量的促红细胞生成素受体激活剂。
发明概述 本公开内容部分地说明， GDF 捕获物 (GDF Traps) 可与 EPO 受体激活剂联合施用 ( 例 如， 在相同时间或不同时间施用， 但通常以实现重叠药物效果的方式 ) 以在需要的患者中 增加红细胞水平 ( 红细胞生成 ) 或治疗贫血。本公开内容部分地说明， GDF 捕获物可与 EPO 受体激活剂联合施用， 以协同增加患者中的红细胞形成。 因此， 该联合治疗的效果可以显著 高于 GDF 捕获物和 EPO 受体激活剂以其各自量单独施用时的效果总和。在某些实施方案 中， 该协同作用可为有利的， 因为其能够以较低剂量的 EPO 受体激活剂获得红细胞靶水平， 由此避免潜在的副作用或与较高水平的 EPO 受体激活相关的其它问题。 EPO 受体激活剂可通过直接接触和激活 EPO 受体刺激红细胞生成。在某些实施方 案中， EPO 受体激活剂是基于天然 EPO 的 165 个氨基酸序列的一类化合物中的一个， 并且通 常称为红细胞生成 - 刺激剂 (ESAs)， 其例子是依伯汀 α、 依伯汀 β、 依伯汀 δ 和依伯汀 ω。 在其它实施方案中， ESAs 包括合成 EPO 蛋白质 (SEPs) 和 EPO 衍生物， 其具有赋予期望的药 动学特性 ( 延长的循环半衰期 ) 的非肽修饰， 其例子是达贝泊汀 α(darbepoetin alfa) 和 甲氧基 - 聚乙二醇依伯汀 β。在某些实施方案中， EPO 受体激活剂可为不结合 EPO 多肽骨 架或通常不归类为 ESA 的 EPO 受体激动剂。这种 EPO 受体激动剂可包括但不限于 EPO 的肽 和非肽模拟物、 靶向 EPO 受体的激动抗体、 包含 EPO 模拟结构域的融合蛋白质、 和促红细胞 生成素受体延长期限制激动剂 (erythropoietin receptor extended-duration limited agonists， EREDLA)。
在某些实施方案中， EPO 受体激活剂可通过增强内源性 EPO 产生间接刺激红细胞 生成， 不接触 EPO 受体本身。例如， 低氧诱导的转录因子 (HIFs) 是 EPO 基因表达的内源性 刺激剂， 所述表达在常氧条件下通过细胞调节机制而抑制 ( 去稳定 )。 本公开内容通过应用 GDF 捕获物和具有 HIF 稳定特性的间接 EPO 受体激活剂如脯氨酰羟化酶抑制剂联合治疗部 分地提供患者中增加的红细胞生成。
相对于其它 ActRIIB 配体如 GDF11 和 / 或筒箭毒碱具有对激活素 ( 例如， 激活素 A 和 / 或激活素 B) 显著降低的亲和力的变体 ActRIIB 多肽被称为 GDF 捕获物。本文描述的 ActRIIB 变体是 GDF 捕获物， 除非另外指定。特别地， 本公开内容说明为在 SEQ ID NO:1 的 位置 79 具有酸性残基的可溶形式 ActRIIB 多肽的 GDF 捕获物在体内施用时增加血中红细 胞水平。因此， 在某些实施方案中， 本公开内容提供应用 GDF 捕获物增加患者中红细胞和血 红蛋白水平和治疗与需要的患者中低红细胞或血红蛋白水平有关的病症的方法。 如并入本
文作为参考的美国专利申请号 12/012,652 所述， GDF 捕获物可以用于增加肌肉量和降低脂 肪量。
在某些方面， 本公开内容提供为变体 ActRIIB 多肽的 GDF 捕获物， 包括具有氨基和 羧基端截短和序列变化的 ActRIIB 多肽。任选地， 本发明的 GDF 捕获物可设计为优先拮抗 ActRIIB 受体的一个或多个配体， 如 GDF8( 也称为筒箭毒碱 )、 GDF11、 Nodal 和 BMP7( 也称 为 OP-1)。GDF 捕获物的例子包括衍生自 ActRIIB 的一组变体， 其具有大大减少的对激活素 的亲和力。这些变体展示对红细胞的期望的效果， 同时降低对其它组织的效果。这种变体 的例子包括在相应于 SEQ ID NO.1 的位置 79 的位置具有酸性氨基酸 ( 例如， 天冬氨酸 D 或 谷氨酸 E) 的那些。在某些实施方案中， GDF 捕获物多肽包含下列氨基酸序列， 其包含 SEQ ID NO:7、 26、 28、 29、 32、 37 或 38 的氨基酸序列和与前述任一具有至少 80%、 85%、 90%、 95%、 97%、 98% 或 99% 同一性的多肽， 由 SEQ ID NO:7、 26、 28、 29、 32、 37 或 38 的氨基酸序列和与前 述任一具有至少 80%、 85%、 90%、 95%、 97%、 98% 或 99% 同一性的多肽组成， 或基本上由 SEQ ID NO:7、 26、 28、 29、 32、 37 或 38 的氨基酸序列和与前述任一具有至少 80%、 85%、 90%、 95%、 97%、 98% 或 99% 同一性的多肽组成。
在某些方面， 本公开内容提供药物制剂， 其包含与 ActRIIB 配体如 GDF8、 GDF11、 激 活素 ( 例如激活素 B)、 BMP7 或 nodal 结合的 GDF 捕获物， 和药学上可接受的载体。任选地， GDF 捕获物与 ActRIIB 配体以低于 10 微摩尔、 低于 1 微摩尔、 低于 100 纳摩尔、 低于 10 纳 摩尔或低于 1 纳摩尔的 Kd 结合。任选地， GDF 捕获物抑制 ActRIIB 信号传导， 如 ActRIIB 配体触发的细胞内信号转导事件。用于这种制剂的 GDF 捕获物可为本文公开的那些中的任 一， 包括例如， 具有选自 SEQ ID NOs:2、 3、 7、 11、 26、 28、 29、 32、 37、 38 或 40 的氨基酸序列的 GDF 捕获物， 或具有与选自 SEQ ID NOs:2、 3、 7、 11、 26、 28、 29、 32、 37、 38 或 40 的氨基酸序列 有至少 80%、 85%、 90%、 95%、 97% 或 99% 同一性的氨基酸序列的 GDF 捕获物， 或具有与选自 SEQ ID NOs:2、 3、 7、 11、 26、 28、 29、 32、 37、 38 或 40 的氨基酸序列有至少 80%、 85%、 90%、 95%、 97% 或 99% 同一性的氨基酸序列的 GDF 捕获物， 其中相应于 SEQ ID NO:1 中 L79 的位置是酸性氨 基酸。用于这种制剂的优选的 GDF 捕获物由 SEQ ID NO:26 的氨基酸序列组成或基本上由 SEQ ID NO:26 的氨基酸序列组成。GDF 捕获物可包含天然 ActRIIB 多肽的功能片段， 如包 含选自 SEQ ID NOs: 2、 3、 7、 11、 26、 28、 29、 32、 37、 38 或 40 的序列的至少 10、 20 或 30 个氨 基酸的那种， 或 SEQ ID NO: 2 的序列， 缺乏 C- 末端 1、 2、 3、 4、 5 或 10 至 15 个氨基酸和缺乏 N- 末端的 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸。优选的多肽将包含相对于 SEQ ID NO: 2 或 40 的 N- 末 端 2 至 5 个氨基酸和 C- 末端不超过 3 个氨基酸的截短。GDF 捕获物可包括相对于天然发生 的 ActRIIB 多肽在 ActRIIB 多肽的氨基酸序列中的一个或多个变化 ( 例如， 在配体结合结 构域中 )。氨基酸序列中的改变可以例如， 当在哺乳动物、 昆虫或其它真核细胞中产生时改 变多肽的糖基化， 或者相对于天然存在的 ActRIIB 多肽改变多肽的蛋白酶剪切。
GDF 捕获物可以是融合蛋白， 其具有作为一个结构域的 ActRIIB 多肽 ( 例如， 带有 一个或多个序列变异的 ActRIIB 的配体结合结构域 ) 和提供理想特性 ( 例如改善的药代动 力学、 更容易的纯化、 对特定组织的靶向等 ) 的一个或多个其它结构域。例如， 融合蛋白的 结构域可增强以下一项或多项 ： 体内稳定性、 体内半衰期、 摄取 / 施用、 组织定位或分布、 蛋 白复合物的形成、 融合蛋白的多聚化和 / 或纯化。 GDF 捕获物融合蛋白可包含免疫球蛋白 Fc 结构域 ( 野生型或突变体 ) 或血清白蛋白。 在一些实施方式中， GDF 捕获物融合体包含位于Fc 结构域和胞外 ActRIIB 结构域之间的相对非结构化的接头。该非结构化的接头可相应 于 ActRIIB 胞外域 C- 末端 (“尾” ) 处的大致 15 个氨基酸的非结构区， 或其可以是相对不 含二级结构的 3 至 5、 15、 20、 30、 50 或更多氨基酸的人工序列。接头可富含甘氨酸和脯氨酸 残基， 并可以例如含有苏氨酸 / 丝氨酸和甘氨酸的重复序列 ( 例如， TG4(SEQ ID NO:13) 或 SG4(SEQ ID NO:14) 单序列或重复序列 ) 或一连串 3 个甘氨酸。融合蛋白可包含纯化子序 列， 例如表位标记、 FLAG 标记、 聚组氨酸序列和 GST 融合体。在某些实施方案中， GDF 捕获物 融合体包含前导序列。前导序列可为天然 ActRIIB 前导序列或异源性前导序列。在某些实 施方案中， 前导序列是组织纤溶酶原激活剂 (TPA) 前导序列。在一个实施方案中， GDF 捕获 物融合蛋白包含如式 A-B-C 中列出的氨基酸序列。B 部分是 N- 和 C- 末端截短的 ActRIIB 多肽， 其由相应于 SEQ ID NO:2 或 40 的氨基酸 25-131 的氨基酸序列组成。A 和 C 部分可独 立为不存在、 一个或多于一个氨基酸， 并且 A 和 C 部分都是与 B 异源的。A 和 / 或 C 部分可 与 B 部分经接头序列连接。
任选地， GDF 捕获物包含具有选自如下的一种或多种修饰的氨基酸残基的变体 ActRIIB 多肽 ： 糖基化氨基酸、 聚乙二醇化氨基酸、 法尼基化氨基酸、 乙酰化氨基酸、 生物素 化氨基酸、 与脂质部分缀合的氨基酸以及与有机衍生剂缀合的氨基酸。药物制剂还可包含 一种或多种额外化合物， 例如用于治疗 ActRIIB- 相关病症的化合物。优选地， 药物制剂基 本不含致热原。一般而言， 优选在哺乳动物细胞系中表达 GDF 捕获物， 这合适地介导 GDF 捕 获物的天然糖基化， 从而减少患者中的不利免疫应答的可能性。人和 CHO 细胞系已被成功 使用， 且预期其它常见的哺乳动物表达载体将是有用的。 在某些方面， 本公开内容提供包装药物， 其包含本文描述的药物制剂和用于增加 人中红细胞水平的标签。
在某些方面， 本公开内容提供 GDF 捕获物， 其为包含改变的配体 - 结合 ( 例如， GDF8- 结合 ) 结构域的可溶性 ActRIIB 多肽。具有改变的配体 - 结合结构域的 GDF 捕获物 可包括例如， 在人 ActRIIB 氨基酸残基如 E37、 E39、 R40、 K55、 R56、 Y60、 A64、 K74、 W78、 L79、 D80、 F82 和 F101 的一个或多个突变 ( 编号相对于 SEQ ID NO:1)。任选地， 改变的配体 - 结 合结构域相对于 ActRIIB 受体的野生型配体 - 结合结构域可以具有对配体如 GDF8/GDF11 增加的选择性。为了举例说明， 本文说明这些突变增加改变的配体 - 结合结构域相比于激 活素对 GDF11( 并且因此， 推测地， GDF8) 的选择性 ： K74Y、 K74F、 K74I、 L79D、 L79E 和 D80I。 下列突变具有相反效果， 增加激活素结合相比于 GDF11 的比例 ： D54A、 K55A、 L79A 和 F82A。 总体 (GDF11 和激活素 ) 结合活性可以通过包含 “尾部” 区域或推测地非结构化的接头区 域， 以及也通过应用 K74A 突变而增加。引起配体结合亲和力的总体降低的其它突变包括 ： R40A、 E37A、 R56A、 W78A、 D80K、 D80R、 D80A、 D80G、 D80F、 D80M 和 D80N。突变可组合以实现期 望的效果。例如， 影响 GDF11: 激活素结合比的许多突变对配体结合具有总体负面效果， 并 且因此， 它们可与一般增加配体结合的突变组合以产生具有配体选择性的改进的结合蛋白 质。在示范性实施方案中， GDF 捕获物是包含 L79D 或 L79E 突变的 ActRIIB 多肽， 任选地联 合额外的氨基酸取代、 添加或缺失。
任选地， 包含改变的配体 - 结合结构域的 GDF 捕获物具有的用于激活素结合的 Kd 与用于 GDF8 结合的 Kd 的比相对于野生型配体 - 结合结构域的比为至少 2、 5、 10 或甚至 100 倍高。任选地， 包含改变的配体 - 结合结构域的 GDF 捕获物具有的用于抑制激活素的 IC50
与用于抑制 GDF8/GDF11 的 IC50 的比相对于野生型 ActRIIB 配体 - 结合结构域为至少 2、 5、 10 或甚至 100 倍高。任选地， 包含改变的配体 - 结合结构域的 GDF 捕获物以与用于抑制激 活素的 IC50 相比至少 2、 5、 10 或甚至 100 倍低的 IC50 抑制 GDF8/GDF11。这些 GDF 捕获物可 以是包括免疫球蛋白 Fc 结构域 ( 野生型或突变体 ) 的融合蛋白。在某些情况下， 主题可溶 性 GDF 捕获物是 GDF8 和 / 或 GDF11 的拮抗剂 ( 抑制剂 )。
其它 GDF 捕获物如下考虑。包含衍生自 SEQ ID NO: 1 或 39 的 ActRIIB 序列的部 分和第二多肽部分的 GDF 捕获物融合蛋白， 其中衍生自 ActRIIB 的部分相应于起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 21-29 中的任一 ( 任选地起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的 22-25) 和 终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 109-134 中的任一的序列， 并且其中在基于细胞的分 析中 GDF 捕获物融合蛋白抑制通过激活素、 筒箭毒碱和 / 或 GDF11 的信号传导。上述 GDF 捕获物融合蛋白， 其中衍生自 ActRIIB 的部分相应于起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 20-29 中的任一 ( 任选地起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的 22-25) 和终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 109-133 中的任一的序列。 上述 GDF 捕获物融合蛋白， 其中衍生自 ActRIIB 的部 分相应于起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 20-24 中的任一 ( 任选地起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的 22-25) 和终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 109-133 中的任一的序列。上述 GDF 捕获物融合蛋白， 其中衍生自 ActRIIB 的部分相应于起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基 酸 21-24 中的任一和终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 109-134 中的任一的序列。上述 GDF 捕获物融合蛋白， 其中衍生自 ActRIIB 的部分相应于起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基 酸 20-24 中的任一和终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 118-133 中的任一的序列。上述 GDF 捕获物融合蛋白， 其中衍生自 ActRIIB 的部分相应于起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基 酸 21-24 中的任一和终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 118-134 中的任一的序列。上述 GDF 捕获物融合蛋白， 其中衍生自 ActRIIB 的部分相应于起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基 酸 20-24 中的任一和终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 128-133 中的任一的序列。上述 GDF 捕获物融合蛋白， 其中衍生自 ActRIIB 的部分相应于起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基 酸 20-24 中的任一和终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 128-133 中的任一的序列。上述 GDF 捕获物融合蛋白， 其中衍生自 ActRIIB 的部分相应于起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基 酸 21-29 中的任一和终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 118-134 中的任一的序列。上述 GDF 捕获物融合蛋白， 其中衍生自 ActRIIB 的部分相应于起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基 酸 20-29 中的任一和终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 118-133 中的任一的序列。上述 GDF 捕获物融合蛋白， 其中衍生自 ActRIIB 的部分相应于起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨 基酸 21-29 中的任一和终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 128-134 中的任一的序列。上 述 GDF 捕获物融合蛋白， 其中衍生自 ActRIIB 的部分相应于起始于 SEQ ID NO: 1 的氨基酸 20-29 中的任一和终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 128-133 中的任一的序列。令人惊 讶地， 起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的 22-25 的构建体具有大于具有人 ActRIIB 全部胞外域 的蛋白质的活性水平。在一个优选的实施方案中， GDF 捕获物融合蛋白包含起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸位置 25 和终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸位置 131 的氨基酸序 列、 基本上由该氨基酸序列组成或由该氨基酸序列组成。在另一个优选实施方案中， GDF 捕 获物多肽由 SEQ ID NO: 7、 26、 28、 29、 32、 37 或 38 的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸 序列组成。上述 GDF 捕获物融合蛋白中的任一可作为同二聚体产生。上述 GDF 捕获物融合蛋白中的任一可具有包含来自 IgG 重链的恒定区如 Fc 结构域的异源性部分。上述 GDF 捕 获物融合蛋白中的任一可包含在相应于 SEQ ID NO: 1 的位置 79 的位置的酸性氨基酸， 任 选地联合相对于 SEQ ID NO: 1 的一个或多个额外的氨基酸取代、 缺失或插入。
其它 GDF 捕获物蛋白质如下考虑。包含与 SEQ ID NO:1 或 39 的氨基酸 29-109 的 序列具有至少 80% 同一性的氨基酸序列的 GDF 捕获物蛋白质， 其中相应于 SEQ ID NO:1 的 64 的位置是 R 或 K， 并且其中 GDF 捕获物蛋白质在基于细胞的分析中抑制通过激活素、 筒箭 毒碱和 / 或 GDF11 的信号传导。上述 GDF 捕获物蛋白质， 其中相对于 SEQ ID NO:1 或 39 的 序列的至少一个变化位于配体结合口袋之外。上述 GDF 捕获物蛋白质， 其中相对于 SEQ ID NO:1 或 39 的序列的至少一个变化是位于配体结合口袋内的保守的变化。上述 GDF 捕获物 蛋白质， 其中相对于 SEQ ID NO:1 或 39 的序列的至少一个变化是在选自下列的一个或多个 位置的变化 ： K74、 R40、 Q53、 K55、 F82 和 L79。上述 GDF 捕获物蛋白质， 其中蛋白质在不同 于 ActRIIB 的内源性 N-X-S/T 序列的位置、 以及在配体结合口袋之外的位置包含至少一个 N-X-S/T 序列。
其它 GDF 捕获物如下考虑。包含与 SEQ ID NO:1 或 39 的氨基酸 29-109 的序列具 有至少 80% 同一性的氨基酸序列的 GDF 捕获物蛋白质， 并且其中该蛋白质在不同于 ActRIIB 的内源性 N-X-S/T 序列的位置、 以及在配体结合口袋之外的位置包含至少一个 N-X-S/T 序 列。上述 GDF 捕获物， 其中 GDF 捕获物蛋白质在相应于 SEQ ID NO:1 或 39 的位置 24 的位 置包含 N， 并且在相应于 SEQ ID NO:1 或 39 的位置 26 的位置包含 S 或 T， 并且其中 GDF 捕 获物在基于细胞的分析中抑制通过激活素、 筒箭毒碱和 / 或 GDF11 的信号传导。上述 GDF 捕获物， 其中 GDF 捕获物蛋白质在相应于 SEQ ID NO:1 或 39 的位置 64 的位置包含 R 或 K。 上述 GDF 捕获物， 其中 ActRIIB 蛋白质在相应于 SEQ ID NO:1 或 39 的位置 79 的位置包含 D 或 E， 并且其中 GDF 捕获物在基于细胞的分析中抑制通过激活素、 筒箭毒碱和 / 或 GDF11 的 信号传导。上述 GDF 捕获物， 其中相对于 SEQ ID NO:1 或 39 的序列的至少一个变化是位于 配体结合口袋内的保守的变化。上述 GDF 捕获物， 其中相对于 SEQ ID NO:1 或 39 的序列的 至少一个变化是在选自下列的一个或多个位置的变化 ： K74、 R40、 Q53、 K55、 F82 和 L79。上 述 GDF 捕获物， 其中蛋白质是进一步包含异源性部分的融合蛋白。上述 GDF 捕获物融合蛋 白的任一可作为同二聚体产生。上述 GDF 捕获物融合蛋白的任一可具有包含来自 IgG 重链 的恒定区如 Fc 结构域的异源性部分。
在某些方面， 本公开内容提供编码 GDF 捕获物多肽的核酸。分离的多核苷酸可包 含例如上文所述的可溶性 GDF 捕获物多肽的编码序列。例如， 分离的核酸可包含编码 GDF 捕获物的序列， 所述 GDF 捕获物包含具有一个或多个序列变异的序列的 ActRIIB 多肽的胞 外域 ( 例如， 配体 - 结合结构域 )， 以及编码 ActRIIB 多肽的部分或全部跨膜结构域和 / 或 胞质域的序列， 除了定位在跨膜结构域或胞质域中或定位在胞外域与跨膜结构域或胞质域 之间的终止密码子。例如， 编码 GDF 捕获物的分离的多核苷酸可包含全长 ActRIIB 多核苷 酸序列， 例如， 具有一个或多个变异的 SEQ ID NO:4 或部分截短形式， 所述分离的多核苷酸 进一步包含在 3'- 末端之前至少六百个核苷酸处或其它位置的转录终止密码子， 从而使多 核苷酸的翻译产生任选地融合至全长 ActRIIB 的截短部分的胞外域。本文公开的核酸可以 可操作地连接至启动子进行表达， 且本公开内容提供用此类重组多核苷酸转化的细胞。所 述细胞优选为哺乳动物细胞， 例如 CHO 细胞。在某些方面， 本公开内容提供用于制备 GDF 捕获物多肽的方法。这一方法可包括 在合适的细胞， 例如中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞中表达本文公开的任意核酸 ( 例如， SEQ ID NO: 5、 25、 27、 30 或 31)。此类方法可包括 ： a) 在适于表达 GDF 捕获物多肽的条件下培养细 胞， 其中用 GDF 捕获物表达构建体转化所述细胞 ； 和 b) 回收如此表达的 GDF 捕获物多肽。 GDF 捕获物多肽可作为粗制的、 部分纯化的或高度纯化的级分应用用于从细胞培养物获得 蛋白质的任何公知技术回收。
在某些方面， 本文公开的 GDF 捕获物多肽可用于在受试者中促进红细胞产生或提 高红细胞水平的方法中。在某些实施方式中， 本公开内容提供了在有需要的患者中治疗与 低红细胞计数或低血红蛋白水平相关的病症 ( 例如， 贫血 ) 或促进红细胞生成的方法。方 法可包括给有需要的受试者施用有效量的 GDF 捕获物多肽。在某些方面， 所述公开内容提 供了 GDF 捕获物多肽在制备用于治疗本文描述的病症或状况的药物中的用途。
在某些方面， 本公开内容提供用于向患者施用 GDF 捕获物多肽的方法。部分地， 本 公开内容说明 GDF 捕获物多肽可以用于增加红细胞和血红蛋白水平。GDF 捕获物多肽也可 用于治疗或预防其它治疗应用， 如促进肌肉生长。在某些情况下， 当施用 GDF 捕获物多肽用 于促进肌肉生长时， 可期望在施用 GDF 捕获物多肽期间监测对红细胞的作用、 或确定或调 节 GDF 捕获物多肽的给药， 以便降低对红细胞的不期望的效果。例如， 红细胞水平、 血红蛋 白水平或血细胞比容水平的增加可引起血压的增加。
附图简述 本专利或申请文件包含至少一副彩色描绘的附图。 带彩图的这一专利或专利申请公开 的副本将由专利局在请求和支付必要费用后提供。
图 1 示出人 ActRIIA (SEQ ID NO: 15) 和人 ActRIIB (SEQ ID NO: 2) 的胞外域 的比对， 其具有用框表明的本文推论的残基， 所述残基基于多个 ActRIIB 和 ActRIIA 晶体结 构的复合分析直接接触配体 ( 配体结合口袋 ) 。
图 2 示出各种脊椎动物 ActRIIB 蛋白质和人 ActRIIA(SEQ ID NOs: 16-23) 的多 重序列比对。
图 3 示出 GDF 捕获物 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 的全部氨基酸序列 (SEQ ID NO: 11)， 包括 TPA 前导序列 ( 双下划线 )、 ActRIIB 胞外域 (SEQ ID NO: 1 中的残基 20-134 ； 下 划线的 ) 和 hFc 结构域。在天然序列位置 79 取代的天冬氨酸是双下划线和突出显示的， 如 通过对成熟融合蛋白中 N- 末端残基测序显示的甘氨酸。
图 4 示出编码 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 的核苷酸序列。 SEQ ID NO: 25 相应于 有义链， 并且 SEQ ID NO: 33 相应于反义链。TPA 前导序列 ( 核苷酸 1-66) 是双下划线的， 并且 ActRIIB 胞外域 ( 核苷酸 76-420) 是下划线的。
图 5 示出截短的 GDF 捕获物 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc(SEQ ID NO: 26) 的全部 氨基酸序列， 包括 TPA 前导序列 ( 双下划线 )、 截短的 ActRIIB 胞外域 (SEQ ID NO: 1 中的 残基 25-131 ； 下划线 ) 和 hFc 结构域。在天然序列位置 79 取代的天冬氨酸是双下划线和 突出显示的， 如通过对成熟融合蛋白中 N- 末端残基测序显示的谷氨酸。
图 6 示出编码 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 的核苷酸序列。 SEQ ID NO: 27 相应于 有义链， 并且 SEQ ID NO: 34 相应于反义链。TPA 前导序列 ( 核苷酸 1-66) 是双下划线的， 并且截短的 ActRIIB 胞外域 ( 核苷酸 76-396) 是下划线的。也示出 ActRIIB 胞外域的氨基酸序列 (SEQ ID NO: 1 中的残基 25-131)。
图 7 示出无前导序列的截短的 GDF 捕获物 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 的氨基酸 序列 (SEQ ID NO: 28)。截短的 ActRIIB 胞外域 (SEQ ID NO: 1 中的残基 25-131) 是下划 线的。在天然序列位置 79 取代的天冬氨酸是双下划线和突出显示的， 如通过对成熟融合蛋 白中 N- 末端残基测序显示的谷氨酸。
图 8 示 出 无 前 导 序 列、 hFc 结 构 域 和 接 头 的 截 短 的 GDF 捕 获 物 ActRIIB(L79D 25-131) 的氨基酸序列 (SEQ ID NO: 29)。 在天然序列位置 79 取代的天冬氨酸是双下划线 和突出显示的， 如通过对成熟融合蛋白中 N- 末端残基测序显示的谷氨酸。
图 9 示出编码 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 的可选核苷酸序列。 SEQ ID NO: 30 相 应于有义链， 并且 SEQ ID NO: 35 相应于反义链。TPA 前导序列 ( 核苷酸 1-66) 是双下划线 的， 截短的 ActRIIB 胞外域 ( 核苷酸 76-396) 是下划线的， 并且胞外域野生型核苷酸序列中 的取代是双下划线和突出显示的 ( 与 SEQ ID NO: 27 比较， 图 6)。也示出 ActRIIB 胞外域 的氨基酸序列 (SEQ ID NO: 1 中的残基 25-131)。
图 10 示出图 9 中示出的可选核苷酸序列 (SEQ ID NO: 30) 的核苷酸 76-396(SEQ ID NO: 31)。图 9 中表明的相同核苷酸取代也在此下划线和突出显示。SEQ ID NO: 31 仅 编码截短的 ActRIIB 胞外域 ( 对应于 SEQ ID NO: 1 中的残基 25-131)， 带有 L79D 取代， 例 如 ActRIIB(L79D 25-131)。 图 11 示出 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 对化学治疗 - 诱导的贫血的小鼠模型中血 红蛋白浓度的作用。数据为均值 ±SEM。**， P<0.01， 相对于紫杉醇， 在相同时间点。该 GDF 捕获物抵销紫杉醇治疗诱导的贫血。
图 12 示出 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 对慢性肾脏疾病单侧肾切除 (NEPHX) 小鼠 模型中红细胞 (RBC) 水平的作用。数据为均值 ±SEM。***， P<0.001， 相对于基线。该 GDF 捕获物逆转对照小鼠中观察的肾切除术诱导的贫血。
图 13 示出 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 对慢性肾脏疾病单侧肾切除 (NEPHX) 小鼠 模型中红细胞 (RBC)、 血红蛋白 (HGB) 和血细胞比容 (HCT) 水平的作用。数据是 4 周期间 从基线的平均变化 (±SEM)。*， P<0.05 ； **， P<0.01 ； ***， P<0.001， 相对于 NEPHX 对照。该 GDF 捕获物防止肾切除术相关的这些红细胞参数的降低， 增加各自至与肾脏完整 ( 假手术 ) 小鼠中类似的量级。
图 14 示出 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 对急性失血诱导的贫血的大鼠模型中红细 胞 (RBC) 水平的作用。血液移取在第 -1 天发生， 给药在第 0 和 3 天。数据为均值 ±SEM。 **， P<0.01 ； ***， P<0.001， 相对于载体在相同时间点。该 GDF 捕获物改进从失血诱导的贫 血恢复的速度和程度。
图 15 示 出 用 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc( 灰 色 ) 或 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc( 黑色 ) 治疗对食蟹猴中红细胞浓度从基线的绝对变化的作用。 VEH= 载体。 数 据为均值 +SEM。n=4-8 每组。
图 16 示 出 用 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc( 灰 色 ) 或 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc( 黑色 ) 治疗对食蟹猴中血细胞比容从基线的绝对变化的作用。 VEH= 载体。 数 据为均值 +SEM。n=4-8 每组。
图 17 示 出 用 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc( 灰 色 ) 或 ActRIIB(L79D
25-131)-hFc( 黑色 ) 治疗对食蟹猴中血红蛋白浓度从基线的绝对变化的作用。VEH= 载体。 数据为均值 +SEM。n=4-8 每组。
图 18 示 出 用 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc( 灰 色 ) 或 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc( 黑色 ) 治疗对食蟹猴中循环网织红细胞浓度从基线的绝对变化的作用。 VEH= 载体。数据为均值 +SEM。n=4-8 每组。
图 19 示出用促红细胞生成素 (EPO) 和 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 联合治疗 72 小时对小鼠中血细胞比容的作用。 数据为均值 ±SEM(n=4 每组 )， 并且彼此显著不同的均值 (p<0.05， 不配对 t 检验 ) 由不同字母指定。与载体相比， 联合治疗增加血细胞比容 23%， 这 是大于 EPO 和 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 的单独效果的总和的协同增加。
图 20 示出用 EPO 和 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 联合治疗 72 小时对小鼠中血红 蛋白浓度的作用。数据为均值 ±SEM(n=4 每组 )， 并且彼此显著不同的均值 (p<0.05) 由不 同字母指定。与载体相比， 联合治疗增加血红蛋白浓度 23%， 其也是协同效果。
图 21 示出用 EPO 和 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 联合治疗 72 小时对小鼠中红细 胞浓度的作用。数据为均值 ±SEM(n=4 每组 )， 并且彼此显著不同的均值 (p<0.05) 由不同 字母指定。与载体相比， 联合治疗增加血红蛋白浓度 20%， 其也是协同效果。 图 22 示出用 EPO 和 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 联合治疗 72 小时对小鼠脾中红 细胞生成前体细胞的数目的作用。数据为均值 ±SEM(n=4 每组 )， 并且彼此显著不同的均 值 (p<0.01) 由不同字母指定。尽管单独的 EPO 以晚期前体成熟的代价显著增加嗜碱成红 细胞 (BasoE) 数目， 联合治疗增加 BasoE 数目至较少但仍然显著的程度， 同时支持晚期前体 不降低的成熟。
发明详述 1. 综述 EPO 是牵涉在红细胞祖细胞生长和成熟为红细胞的糖蛋白激素。EPO 在胎儿生命期间 由肝脏产生， 并且在成人中由肾脏产生。通常在成人中作为肾脏衰竭后果发生的 EPO 的降 低产生引起贫血。EPO 已基于蛋白质从用 EPO 基因转染的宿主细胞的表达和分泌通过遗传 工程技术产生。 这种重组 EPO 的施用在贫血的治疗中是有效的。 例如， Eschbach 等人 (1987, N Engl J Med 316:73) 描述了应用 EPO 纠正慢性肾脏衰竭引起的贫血。
EPO 的效果通过其结合、 和激活属于细胞因子受体超家族并指定为 EPO 受体的细 胞表面受体而介导。人和鼠科动物 EPO 受体已得到克隆和表达 (D’ Andrea 等人 , 1989, Cell 57:277; Jones 等人 , 1990, Blood 76:31; Winkelman 等人 , 1990, Blood 76:24; WO 90/08822/ 美国专利号 5,278,065)。人 EPO 受体基因编码 483 个氨基酸的跨膜蛋白质， 其包含大约 224 个氨基酸的胞外域并展示与鼠科动物 EPO 受体大约 82% 的氨基酸序列同 一性 ( 参见美国专利号 6,319,499)。哺乳动物细胞中表达的克隆的全长 EPO 受体 (66-72 kDa) 以类似于天然受体在红细胞祖细胞上的亲和力的亲和力 (KD=100-300 nM) 结合 EPO。 因此， 认为这一形式包含主要 EPO 结合决定簇并且称为 EPO 受体。通过与其它密切相关的 细胞因子受体类比， 认为 EPO 受体在激动剂结合后二聚化。然而， 可为多聚复合体的 EPO 受 体的详细结构及其具体激活机制不完全明了 ( 美国专利号 6,319,499)。
EPO 受体激活引起几个生物学效果。 这些包括不成熟成红细胞的增加的增殖、 不成 熟成红细胞的增加的分化、 和红细胞祖细胞的降低的凋亡 (Liboi 等人 , 1993, Proc Natl
Acad Sci USA 90:11351-11355; Koury 等人 , 1990, Science 248:378-381)。介导增殖 和分化的 EPO 受体信号转导途径似乎不同 (Noguchi 等人 , 1988, Mol Cell Biol 8:2604; Patel 等人 , 1992, J Biol Chem 1992, 267:21300; Liboi 等人 , ibid)。一些结果暗 示附属蛋白质可能对于分化信号的介导是需要的 (Chiba 等人 , 1993, Nature 362:646; Chiba 等人 , 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:11593) ； 但是， 关于附属蛋白质在分化 中的作用存在争论， 因为组成型活化形式的受体可以刺激增殖和分化二者 (Pharr 等人 , 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:938)。
EPO 受体激活剂包括小分子红细胞生成 - 刺激剂 (ESAs) 以及基于 EPO 的化合物。 前者的例子是与聚乙二醇共价连接的基于二聚肽的激动剂 ( 专有名称 Hematide)， 其已示 出在健康志愿者和具有慢性肾脏疾病和内源性抗 -EPO 抗体的患者中的红细胞生成 - 刺激 特性 (Stead 等人 , 2006, Blood 108:1830-1834; Macdougall 等人 , 2009, N Engl J Med 361:1848-1855)。其它例子包括基于非肽的 ESAs(Qureshi 等人 , 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:12156-12161)。
EPO 受体激活剂也包括不接触 EPO 受体本身、 通过增强内源性 EPO 产生间接刺激红 细胞生成的化合物。 例如， 低氧诱导的转录因子 (HIFs) 是 EPO 基因表达的内源性刺激物， 其 在常氧条件下被细胞调节机制抑制 ( 去稳定 )。因此， HIF 脯氨酰羟化酶抑制剂正研究用于 体内 EPO- 诱导活性。EPO 受体的其它间接激活剂包括 GATA-2 转录因子抑制剂 (Nakano 等 人 , 2004, Blood 104:4300-4307)， 其增强地抑制 EPO 基因表达， 和造血细胞磷酸酶 (HCP 或 SHP-1) 抑制剂， 其作为 EPO 受体信号转导的负调节剂起作用 (Klingmuller 等人 , 1995, Cell 80:729-738)。
转化生长因子 -β(TGF-β) 超家族包含多种生长因子， 它们具有共同的序列元件 和结构基序。已知这些蛋白在脊椎动物和无脊椎动物中对多种细胞类型施加生物作用。该 超家族的成员在胚胎发育过程中在模式形成和组织特化方面行使重要功能， 并且能够影响 多种分化过程， 包括脂肪生成、 肌发生、 软骨发生、 心脏生成、 血细胞生成、 神经发生和上皮 细胞分化。该家族分成两大分支 ： BMP/GDF 和 TGF-β/ 激活素 /BMP10 分支， 其成员具有多 样的、 通常互补的作用。通过操纵 TGF-β 家族成员的活性， 通常可以导致生物中的显著生 理学改变。例如， 皮埃蒙特和比利时蓝牛品种携带 GDF8( 也称作筒箭毒碱 ) 基因中的功能 丧失突变， 其导致肌肉量的显著增加。Grobet 等人 , Nat Genet. 1997, 17(1):71-4。此 外， 在人类中， GDF8 的无活性等位基因与增加的肌肉量相关， 并且， 据报道， 与优越的强度相 关。Schuelke 等人 , N Engl J Med 2004, 350:2682-8。
TGF-β 信号由在配体刺激后磷酸化并激活下游 Smad 蛋白质的 I 型和 II 型丝氨 酸 / 苏氨酸激酶受体的异聚复合体介导 (Massagué, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178)。这些 I 型和 II 型受体是跨膜蛋白质， 由带有富含半胱氨酸区域的配体 - 结合 胞外域、 跨膜结构域、 和带有预测丝氨酸 / 苏氨酸特异性的胞质域组成。I 型受体是信号传 导必须的。II 型受体是结合配体和 I 型受体表达所需的。I 型和 II 型激活素受体在配体 结合后形成稳定的复合体， 导致 I 型受体被 II 型受体磷酸化。
两个相关 II 型受体 (ActRII)ActRIIA 和 ActRIIB 已鉴定为用于激活素的 II 型 受 体 (Mathews 和 Vale, 1991, Cell 65:973-982; Attisano 等 人 , 1992, Cell 68: 97-108)。除激活素外， ActRIIA 和 ActRIIB 可以与几个其它 TGF-β 家族蛋白质生物化学地相互作用， 包括 BMP7、 Nodal、 GDF8 和 GDF11(Yamashita 等人 , 1995, J. Cell Biol. 130:217-226;Lee 和 McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311; Yeo 和 Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh 等人 , 2002, Genes Dev. 16:2749-54)。 ALK4 是对于激活素、 特别是对于激活素 A 的主要 I 型受体， 并且 ALK-7 也可充当对于激活 素、 特别是对于激活素 B 的受体。在某些实施方案中， 本发明涉及用主题 GDF 捕获物多肽 拮抗 ActRIIB 受体的配体 ( 也称为 ActRIIB 配体 )。ActRIIB 受体的示范性配体包括一些 TGF-β 家族成员， 如激活素、 Nodal、 GDF8、 GDF11 和 BMP7。
激活素是二聚多肽生长因子， 其属于 TGF-β 超家族。存在三种主要的激活素形 式 (A， B 和 AB)， 其为两种密切相关的 β 亚基的同 / 异二聚体 ( 分别为 βAβA， βBβB 和 βAβB)。人基因组还编码激活素 C 和激活素 E， 它们主要在肝中表达， 同样已知包括 βc 或 βe 的异二聚体形式。在 TGF-β 超家族中， 激活素是独特的和多功能的因子， 它能刺激 卵巢和胎盘细胞中的激素生成， 支持神经元细胞存活， 根据细胞类型正面或负面影响细胞 周期进程， 并至少在两栖动物胚胎中诱导中胚层的分化 (DePaolo 等人， 1991， Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512 ； Dyson 等人， 1997， Curr Biol. 7:81-84 ； Woodruff， 1998， Biochem Pharmacol. 55:953-963)。此外， 已发现从刺激后的人单核细胞白血病细胞中分离的红细 胞分化因子 (EDF) 与激活素 A 相同 (Murata 等人， 1988， PNAS， 85:2434)。已表明激活素 A 促进骨髓中的红细胞生成。 在一些组织中， 激活素信号传导被它的相关异二聚体， 即抑制素 所拮抗。例如， 在从脑垂体释放促卵泡激素 (FSH) 的过程中， 激活素促进 FSH 分泌和合成， 而抑制素阻止 FSH 的分泌和合成。其它可调节激活素生物活性和 / 或结合激活素的蛋白包 括促滤泡素抑制素 (FS)、 促滤泡素抑制素相关蛋白 (FSRP) 和 α2- 巨球蛋白。
Nodal 蛋白质在早期胚胎发生中在中胚层和内胚层诱导和形成以及随后的轴结构 如心脏和胃的组织化中具有功能。已说明发育中脊椎动物胚胎中的脊背组织主要促成脊 索和脊索前板的轴结构， 同时其募集周围细胞以形成非轴胚胎结构。Nodal 看来通过 I 型 和 II 型受体二者和称为 Smad 蛋白质的细胞内效应器发信号。近来的研究支持 ActRIIA 和 ActRIIB 起 Nodal 的 II 型受体作用的观点 (Sakuma 等人 , Genes Cell. 2002, 7:401-12)。 建议的是， Nodal 配体与它们的辅因子 ( 例如 cripto) 相互作用以激活激活素 I 型和 II 型受体， 其磷酸化 Smad2。Nodal 蛋白质牵涉在对早期脊椎动物胚胎重要的许多事件中， 包括中胚层形成、 前部模式化 (anterior patterning) 和左右轴规格 (left-right axis specification)。实验证据已说明 Nodal 信号传导激活 pAR3-Lux， 其为之前示出对激活素 和 TGF-β 特异性应答的萤光素酶报道分子。但是， Nodal 不能诱导 pTlx2-Lux， 其为对骨形 态发生蛋白特异性反应的报道分子。近来的结果提供直接生物化学证据， 即 Nodal 信号传 导通过激活素 -TGF-β 途径 Smads、 Smad2 和 Smad3 介导。其它证据已示出胞外 cripto 蛋 白质是 Nodal 信号传导所需的， 使其不同于激活素或 TGF-β 信号传导。
生 长 和 分 化 因 子 -8(GDF8) 也 称 为 筒 箭 毒 碱。GDF8 是 骨 骼 肌 量 的 负 调 节 物。 GDF8 在发育中和成人骨骼肌中高度表达。转基因小鼠中的 GDF8 无效突变的特征在于骨 骼肌的显著肥大和增生 (McPherron 等人 , Nature, 1997, 387:83-90)。骨骼肌量的类 似 增 加 在 牛 中 GDF8 的 天 然 发 生 的 突 变 (Ashmore 等 人 , 1974, Growth, 38:501-507; Swatland 和 Kieffer, J. Anim. Sci., 1994, 38:752-757; McPherron 和 Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:12457-12461; 和 Kambadur 等 人 , Genome Res.,1997, 7:910-915) 中是明显的， 并且在人中是引人注目的 (Schuelke 等人 , N Engl J Med 2004;350:2682-8)。研究也已示出与人中 HIV- 感染相关的肌肉萎缩伴随 GDF8 蛋白质表 达增加 (Gonzalez-Cadavid 等人 , PNAS, 1998, 95:14938-43)。此外， GDF8 可以调节肌 肉 - 特异性酶 ( 例如， 肌酸激酶 ) 的产生和调节成肌细胞细胞增殖 (WO00/43781)。GDF8 前 肽可以非共价结合于成熟 GDF8 结构域二聚体， 灭活其生物学活性 (Miyazono 等人 (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield 等 人 (1988) J. Biol. Chem., 263; 7646-7654; 和 Brown 等人 (1990) Growth Factors, 3: 35-43)。 结合 GDF8 或结构上相关 蛋白质和抑制它们的生物学活性的其它蛋白质包括滤泡抑素， 以及潜在地滤泡抑素相关蛋 白质 (Gamer 等人 (1999) Dev. Biol., 208: 222-232)。
生 长 和 分 化 因 子 -11(GDF11) 也 称 为 BMP11， 为 分 泌 蛋 白 质 (McPherron 等 人 , 1999, Nat. Genet. 22: 260-264)。GDF11 在小鼠发育期间在尾芽、 肢芽、 上颌骨和下颌 弓和背根神经节中表达 (Nakashima 等人 , 1999, Mech. Dev. 80: 185-189)。GDF11 在 模式化 (patterning) 中胚层和神经组织中起独特作用 (Gamer 等人 , 1999, Dev Biol., 208:222-32)。示出 GDF11 是发育中鸡肢体中的软骨形成和肌生成的负调节物 (Gamer 等 人 , 2001, Dev Biol. 229:407-20)。GDF11 在肌肉中的表达也表明其在以类似于 GDF8 的 方式调节肌肉生长中的作用。此外， GDF11 在脑中的表达表明 GDF11 可也拥有涉及神经组 织功能的活性。 有趣的是， 发现 GDF11 抑制嗅上皮中的神经发生 (Wu 等人 , 2003, Neuron. 37:197-207)。因此， GDF11 在疾病如肌肉疾病和神经变性疾病 ( 例如肌萎缩侧索硬化 ) 的 治疗中可具有体外和体内用途。
骨形态发生蛋白 (BMP7) 也称为成骨蛋白质 -1(OP-1)， 公知其诱导软骨和骨形成。 此外， BMP7 调节广泛的生理过程。例如， BMP7 可为负责上皮骨发生现象的骨诱导因子。 也发现 BMP7 在钙调节和骨稳态中起作用。类似于激活素， BMP7 结合 II 型受体 ActRIIA 和 ActRIIB。但是， BMP7 和激活素募集不同的 I 型受体到异聚受体复合体中。观察到的 主要 BMP7 I 型受体是 ALK2， 而激活素唯一地结合于 ALK4(ActRIIB)。BMP7 和激活素引 发不同的生物反应并激活不同的 Smad 途径 (Macias-Silva 等人 , 1998, J Biol Chem. 273:25628-36)。
如本文说明的， 为变体 ActRIIB 多肽 (ActRIIB) 的 GDF 捕获物多肽与野生型可溶 性 ActRIIB 多肽相比更有效增加体内红细胞水平并且在各种贫血模型中具有有益效果。另 外地， 示出 GDF 捕获物多肽联合 EPO 受体激活剂的应用引起红细胞形成的大量增加。应当 指出， 血细胞生成是复杂的过程， 由多种因素调节， 包括促红细胞生成素、 G-CSF 和铁稳态。 术语 “增加的红细胞水平” 和 “促进红细胞形成” 指临床上可观察的量度， 如血细胞比容、 红 细胞计数和血红蛋白测量， 并且意图关于通过其发生这种变化的机制是中立的。
除了刺激红细胞水平外， GDF 捕获物多肽对于多种治疗意图有用， 包括例如， 促进 肌肉生长 ( 参见 PCT 公开号 WO 2006/012627 和 WO 2008/097541， 其整体并入本文作为参 考 )。在某些情况下， 当施用 GDF 捕获物多肽用于增加肌肉目的时， 可期望降低或最小化对 红细胞的效果。通过监测用 GDF 捕获物多肽治疗中的患者或用 GDF 捕获物多肽治疗的候选 者中的各种血液学参数， 适当的给药 ( 包括施用量和频率 ) 可基于个别患者的需求、 基线血 液学参数和治疗目的确定。而且， 治疗进展和随时间对一个或多个血液学参数的效果可用 于管理给予 GDF 捕获物多肽的患者， 这通过促进患者护理、 确定适当的维持剂量 ( 量和频率 ) 等进行。
在本发明的上下文中以及在使用每个术语的特定的上下文中， 在本说明书中所用 的术语通常具有其在本领域中的普通含义。在下文以及说明书的其它部分讨论了某些术 语， 以在描述本发明的组合物和方法以及如何制造和使用它们的方面为从业者提供额外的 指导。术语的任何使用范围或含义将从使用该术语的特定上下文显而易见。
“约” 和 “大约” 一般应表示考虑到测量法的性质和精确性， 测得的量的可接受误差 程度。典型地， 示例性误差程度为在给定的数值或数值范围的 20% 以内， 优选在 10% 以内， 更优选在 5% 以内。
或者， 特别是在生物系统中， 术语 “约” 和 “大约” 可表示在一定数量级内， 优选在 给定值的 5 倍以内， 更优选在 2 倍以内的值。除非另有说明， 本文给出的数量为近似值， 表 示在未明确指出时， 可推出术语 “约” 或 “大约” 。
本发明的方法可包括对序列彼此比较的步骤， 包括将野生型序列与一种或多种突 变体 ( 序列变体 ) 进行比较。此类比较通常包括聚合物序列的比对， 例如， 采用本领域熟知 的序列比对程序和 / 或算法 ( 例如， 稍加举例， BLAST、 FASTA 和 MEGALIGN) 进行。本领域技 术人员可容易地理解 ： 在此类比对中， 当突变包含残基插入或缺失时， 该序列比对将在不包 含该插入或缺失的残基的聚合物序列中引入 “空位” ( 通常由破折号或 “A” 表示 )。 以其所有的语法形式和拼写变化表示的 “同源性” 均指具有 “共同进化起源” 的两 种蛋白 ( 包括来自相同生物物种的超家族的蛋白， 以及来自不同生物物种的同源性蛋白 ) 之间的关系。此类蛋白 ( 及其编码核酸 ) 具有序列同源性， 这反映在它们的序列相似性， 不 管是在同一性百分比方面还是在特定残基或基序以及保守位置的存在方面。
以其所有的语法形式表示的术语 “序列相似性” 指可共有或可不共有共同进化起 源的核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应性程度。
然而， 在通常的使用以及在本申请中， 当术语 “同源性” 被副词例如 “高度” 修饰时， 可表示序列相似性， 并可涉及或可不涉及共同进化起源。
2. GDF 捕获物多肽 在某些方面， 本发明涉及 GDF 捕获物多肽， 例如可溶性变体 ActRIIB 多肽， 包括例如， ActRIIB 多肽的片段、 功能变体和修饰形式。在某些实施方案中， GDF 捕获物多肽具有至少 一种与相应野生型 ActRIIB 多肽相似或相同的生物活性。例如， 本发明的 GDF 捕获物多肽 可结合和抑制 ActRIIB 配体 ( 例如， 激活素 A、 激活素 AB、 激活素 B、 Nodal、 GDF8、 GDF11 或 BMP7) 的功能。任选地， GDF 捕获物多肽增加红细胞水平。GDF 捕获物多肽的实例包括具有 一个或多个序列变化的人 ActRIIB 前体多肽 (SEQ ID NO: 1 或 39)， 和具有一个或多个序列 变化的可溶性人 ActRIIB 多肽 ( 例如， SEQ ID NOs: 2、 3、 7、 11、 26、 28、 29、 32、 37、 38、 40 和 41)。GDF 捕获物指相对于其它 ActRIIB 配体， 包括例如 GDF11 和 / 或筒箭毒碱对激活素具 有降低的亲和力的 ActRIIB 多肽。
本文所用的术语 “ActRIIB” 指来自任意物种的 IIb 型激活素受体 (ActRIIB) 蛋白 以及通过诱变或其它修饰从所述 ActRIIB 蛋白衍生的变体的家族。本文提及 ActRIIB 应理 解为提及目前鉴定的形式中的任意一种。 ActRIIB 家族的成员通常为跨膜蛋白， 由具有富含 半胱氨酸的区域的配体结合胞外域、 跨膜结构域以及具有预测的丝氨酸 / 苏氨酸激酶活性 的胞质域组成。人 ActRIIA 可溶性胞外域 ( 提供用于比较 ) 和 ActRIIB 可溶性胞外域的氨
基酸序列在图 1 中图解。
术语 “ActRIIB 多肽” 包括包含 ActRIIB 家族成员的任何天然存在的多肽及其保留 了有用活性的任意变体 ( 包括突变体、 片段、 融合体以及肽模拟 (peptido 模拟物 ) 形式 ) 的多肽。参见， 例如 WO/2006/012627。例如， ActRIIB 多肽包括由任意已知 ActRIIB 的序列 所衍生的、 具有与 ActRIIB 多肽的序列有至少约 80% 同一性、 任选至少 85%、 90%、 95%、 97%、 99% 或更高同一性的序列的多肽。例如， ActRIIB 多肽可结合 ActRIIB 蛋白和 / 或激活素 并抑制其功能。可针对在体内促进红细胞形成的活性选择为 GDF 捕获物的 ActRIIB 多肽。 ActRIIB 多肽的实例包括人 ActRIIB 前体多肽 (SEQ ID NO: 1 和 39) 和可溶性人 ActRIIB 多肽 ( 例如， SEQ ID NO: 2、 3、 7、 11、 26、 28、 29、 32、 37、 38、 40 和 41)。对于本文描述的所有 ActRIIB- 相关多肽的氨基酸编号基于 SEQ ID NO:1 的编号， 除非另外具体指明。
人 ActRIIB 前体蛋白序列如下 ：信号肽以单下划线表示 ； 胞外域以粗体表示， 而潜在的 N- 联糖基化位点在框中。
在位置 64 带有丙氨酸的形式也在文献中报告， 如下 ：人 ActRIIB 可溶性 ( 细胞外 )、 加工的多肽序列如下 ：具有 A64 的可选形式如下 ：在一些条件下， 蛋白质可在 N- 末端带有 “SGR…” 序列产生。胞外域的 C- 末端 “尾” 以 下划线表示。去除 “尾” 的序列 (Δ15 序列 ) 如下所示 ：带有 A64 的可选形式如下 ：在一些条件下， 蛋白质可在 N- 末端带有 “SGR…” 序列产生。编码人 ActRIIB 前体蛋白 质的核酸序列如下 ： (Genbank 条目 NM_001106 的核苷酸 5-1543)( 示出的序列提供位置 64 的丙氨酸， 并且可经修饰以替代地提供精氨酸 )编码人 ActRIIB 可溶性 ( 细胞外 ) 多肽的核酸序列如下 ( 示出的序列提供位置 64 的 丙氨酸， 并且可经修饰以替代地提供精氨酸 ):在特定实施方案中， 本发明涉及为变体形式的可溶性 ActRIIB 多肽的 GDF 捕获物多肽。 本文所述的术语 “可溶性 ActRIIB 多肽” 通常指包含 ActRIIB 蛋白的胞外域的多肽。本文所用的术语 “可溶性 ActRIIB 多肽” 包括任何天然存在的 ActRIIB 蛋白的胞外域及保持有 用活性的其任何变体 ( 包括突变体、 片段以及肽模拟形式 )。例如， ActRIIB 蛋白的胞外域 与配体结合， 并通常是可溶性的。可溶性的 ActRIIB 多肽的实例包括 ActRIIB 可溶性多肽 ( 例如， SEQ ID NOs: 22、 3、 7、 11、 26、 28、 29、 32、 37、 38、 40 和 41)。可溶性的 ActRIIB 多肽 的其它实例除 ActRIIB 蛋白质的胞外域外还包含信号序列， 参见实施例 1。 信号序列可以是 ActRIIB 的天然信号序列， 或来自其它蛋白质的信号序列， 如组织纤溶酶原激活剂 (TPA)。 信号序列或蜜蜂蜂毒素 (HBM) 信号序列。
本公开内容识别 ActRIIB 的功能活性部分和变体。申请人已确定， 在相应于 SEQ ID NO: 1 的氨基酸 64 的位置具有丙氨酸 (A64) 的具有 Hilden 等人公开的序列的 Fc 融合 蛋白 (Blood. 1994 Apr 15;83(8):2163-70) 具有相对低的对激活素和 GDF-11 的亲和力。 与之相比， 在位置 64 带有精氨酸 (R64) 的相同 Fc 融合蛋白在低纳摩尔至高皮摩尔范围对 激活素和 GDF-11 具有亲和力。因此， 在本公开中， 带有 R64 的序列用作对于人 ActRIIB 的 野生型参考序列。
Attisano 等人 (Cell. 1992 Jan 10;68(1):97-108) 显示， 在 ActRIIB 的胞外域的 C- 末端脯氨酸结的缺失降低受体对激活素的亲和力。含有 SEQ ID NO: 1 的氨基酸 20-119 的 ActRIIB-Fc 融合蛋白 “ActRIIB(20-119)-Fc” 对 GDF-11 和激活素具有降低的结合， 所 述降低是相对于 ActRIIB(20-134)-Fc， 其包括脯氨酸结区域和完全近膜结构域。但是， ActRIIB(20-129)-Fc 蛋白质相对于野生型保持类似但有些降低的活性， 即使脯氨酸结区域 破坏。因此， 在氨基酸 134、 133、 132、 131、 130 和 129 停止的 ActRIIB 胞外域均期望是活性 的， 但在 134 或 133 停止的构建体可最具活性。类似地， 在残基 129-134 的任一的突变不期 望改变配体结合亲和力至大的界限。 对其支持的是， P129 和 P130 的突变基本上不降低配体 结合。因此， 为 ActRIIB-Fc 融合蛋白的 GDF 捕获物多肽可在早至氨基酸 109 终止 ( 最后的 半胱氨酸 )， 但是终止于 109 和 119 或在 109 和 119 之间的形式期望具有降低的配体结合。 氨基酸 119 是保守性差的并因此容易改变或截短的。终止于 128 或更后的形式保持配体结 合活性。终止于 119 和 127 或 119 和 127 之间的形式将具有中等结合能力。这些形式中的 任一可取决于临床或实验情况而期望应用。
在 ActRIIB 的 N- 末端， 期望起始于氨基酸 29 或之前的蛋白质将保持配体结合活 性。氨基酸 29 代表初始半胱氨酸。在位置 24 的丙氨酸至天冬酰胺突变引入 N- 联糖基化 序列， 基本上不影响配体结合。这证实相应于氨基酸 20-29 的在信号切割肽和半胱氨酸交 联区域之间的区域中的突变被充分耐受。特别地， 起始于位置 20、 21、 22、 23 和 24 的构建体 将保持活性， 并且起始于位置 25、 26、 27、 28 和 29 的构建体也期望保持活性。实施例中示出 的数据说明， 令人惊讶地， 起始于 22、 23、 24 或 25 的构建体将具有最大活性。
总之， ActRIIB 的活性部分包含 SEQ ID NO: 1 的氨基酸 29-109， 并且 GDF 捕获物 构建体可例如包含起始于相应于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 20-29 的残基和终止于相应 于 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 109-134 的位置的 ActRIIB 部分。其它实例包括构建体， 其起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的 20-29 或 21-29 的位置和终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的 119-134、 119-133、 129-134 或 129-133 的位置。 其它实例包括构建体， 其起始于 SEQ ID NO: 1 或 39 的 20-24( 或 21-24 或 22-25) 的位置和终止于 SEQ ID NO: 1 或 39 的 109-134( 或 109-133)、 119-134( 或 119-133) 或 129-134( 或 129-133) 的位置。也考虑这些范围内的变体， 尤其是与 SEQ ID NO: 1 或 39 的相应部分具有至少 80%、 85%、 90%、 95% 或 99% 同一性的那 些。在某些实施方案中， GDF 捕获物多肽包含与 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸残基 25-131 具有至少 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99% 或 100% 同一性的氨基酸序列的多肽， 基本上 由该多肽组成， 或由该多肽组成。在某些实施方案中， GDF 捕获物多肽包含与 SEQ ID NOs: 7、 26、 28、 29、 32、 37 或 38 具有至少 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99% 或 100% 同一性的氨 基酸序列的多肽， 基本上由该多肽组成， 或由该多肽组成。在优选的实施方案中， GDF 捕获 物多肽由 SEQ ID NOs: 7、 26、 28、 29、 32、 37 或 38 的氨基酸序列组成， 或基本上由其组成。
本公开内容包括复合 ActRIIB 结构的分析结果， 其在图 1 中示出， 表明配体结合口 袋由残基 Y31、 N33、 N35、 L38 至 T41、 E47、 E50、 Q53 至 K55、 L57、 H58、 Y60、 S62、 K74、 W78 至 N83、 Y85、 R87、 A92 和 E94 至 F101 限定。在这些位置， 期望保守的突变会被耐受 (tolerated)， 尽 管 K74A 突变被充分耐受， 如 R40A、 K55A、 F82A 和位置 L79 的突变。R40 在爪蟾属中是 K， 指 示这一位置处的碱性氨基酸会被耐受。Q53 在牛 ActRIIB 中是 R 和在爪蟾属 ActRIIB 中是 K， 并且因此包括 R、 K、 Q、 N 和 H 的氨基酸会在这一位置被耐受。因此， 用于 GDF 捕获物蛋白 的通式是包含 SEQ ID No. 1 或 39 的氨基酸 29-109 的那种， 但任选在范围是 20-24 或 22-25 的位置开始， 并在范围是 129-134 的位置终止， 并且在配体结合口袋中包含不超过 1、 2、 5、 10 或 15 个保守氨基酸改变， 和在配体结合口袋中的位置 40、 53、 55、 74、 79 和 / 或 82 包含 0、 1 或更多个非保守改变。这样的蛋白可以与 SEQ ID NO: 1 或 39 的氨基酸 29-109 的序列 保持大于 80%、 90%、 95% 或 99% 的序列同一性。结合口袋外的位点 ( 在该处可变性可特别充 分耐受 ) 包括胞外域的氨基和羧基末端 ( 如上述 )， 和位置 42-46 和 65-73。在位置 65 的 天冬酰胺至丙氨酸变化 (N65A) 实际上改进在 A64 背景中的配体结合， 并且因此期望对 A64 背景中的配体结合不具有有害效果。这一变化有可能消除 A64 背景中 N65 处的糖基化， 因 此表明这一区域中的显著变化可能被耐受。虽然 R64A 变化耐受差， R64K 被充分耐受， 并且 因此其它碱性残基如 H 可在位置 64 被耐受。
ActRIIB 在几乎所有脊椎动物中是充分保守的， 具有完全保守的大的胞外域伸展。 结合 ActRIIB 的许多配体也是高度保守的。 相应地， 来自各种脊椎动物生物体的 ActRIIB 序 列的比较提供可改变的残基的洞察。因此， 用作 GDF 捕获物的活性人 ActRIIB 变体多肽可 包括在与另一脊椎动物 ActRIIB 的序列相应的位置的一个或多个氨基酸， 或可包括类似于 人或其它脊椎动物序列中的残基。下列实例说明确定活性 ActRIIB 变体的这一方法。L46 在爪蟾属 ActRIIB 中是缬氨酸， 并且因此这一位置可改变和任选地可改变为另一疏水残基 如 V、 I 或 F， 或非极性残基如 A。E52 在爪蟾属中是 K， 指示这一位点可耐受多种变化， 包括 极性残基如 E、 D、 K、 R、 H、 S、 T、 P、 G、 Y 和可能地 A。T93 在爪蟾属中是 K， 指示宽泛的结构变 异在这一位置被耐受， 极性残基是有利的， 如 S、 K、 R、 E、 D、 H、 G、 P、 G 和 Y。F108 在爪蟾属中 是 Y， 并且因此 Y 或其它疏水性基团如 I、 V 或 L 应当耐受。E111 在爪蟾属中是 K， 指示带电 残基会在这一位置耐受， 包括 D、 R、 K 和 H， 以及 Q 和 N。R112 在爪蟾属中是 K， 指示碱性残基 在这一位置耐受， 包括 R 和 H。位置 119 的 A 是相对保守性差的， 并且在啮齿动物中表现为 P 和在爪蟾属中表现为 V， 因此基本上任何氨基酸应当在这一位置耐受。
本公开内容说明另外 N- 联糖基化位点 (N-X-S/T) 的添加相对于 ActRIIB(R64)-Fc 形式增加 ActRIIB-Fc 融合蛋白的血清半衰期。通过在位置 24 引入天冬酰胺 (A24N 构建 体 )， 产生赋予较长半衰期的 NXT 序列。其它 NX(T/S) 序列在 42-44(NQS) 和 65-67(NSS) 发现， 尽管后者可不以位置 64 的 R 有效糖基化。 N-X-S/T 序列可通常在图 1 中限定的配体结合 口袋外的位置引入。 用于引入非内源性 N-X-S/T 序列的特别合适的位点包括氨基酸 20-29、 20-24、 22-25、 109-134、 120-134 或 129-134。N-X-S/T 序列可也引入 ActRIIB 序列和 Fc 或 其它融合体组分间的接头。 这种位点可以最小努力引入， 通过在相对于预先存在的 S 或 T 的 正确位置引入 N， 或通过在相应于预先存在的 N 的位置引入 S 或 T。因此， 会产生 N- 联糖基 化位点的期望的变化是 ： A24N、 R64N、 S67N( 可能与 N65A 变化组合 )、 E106N、 R112N、 G120N、 E123N、 P129N、 A132N、 R112S 和 R112T。预测糖基化的任何 S 可改变为 T， 而不产生免疫原性 位点， 这是因为糖基化提供的保护。 同样， 预测糖基化的任何 T 可改变为 S。 因此， 变化 S67T 和 S44T 被考虑。同样， 在 A24N 变体中， S26T 变化可应用。相应地， GDF 捕获物可为具有一 个或多个额外的非内源性 N- 联糖基化共有序列的 ActRIIB 变体。
ActRIIB 的位置 L79 可改变以赋予改变的激活素 – 筒箭毒碱 (GDF-11) 结合特性。 L79A 或 L79P 降低 GDF-11 结合至比激活素结合大的程度。L79E 或 L79D 保持 GDF-11 结合。 显著地， L79E 和 L79D 变体具有大大降低的激活素结合。体内实验表明这些非激活素受体 保持增加红细胞的显著能力， 但对其它组织显示降低效果。这些数据说明用于获得对激活 素具有降低效果的多肽的期望性和可行性。在示范性实施方案中， 本文描述的方法利用为 变体 ActRIIB 多肽的 GDF 捕获物多肽， 其在相应于 SEQ ID NO: 1 或 39 的位置 79 的位置包 含酸性氨基酸 ( 例如 D 或 E)， 任选地联合一个或多个额外的氨基酸取代、 添加或缺失。
描述的变异可以各种方式联合。另外地， 本文描述的诱变程序的结果表明在 ActRIIB 中存在通常有益于保守的氨基酸序列。这些包括位置 64( 碱性氨基酸 )、 位置 80( 酸性或疏水性氨基酸 )、 位置 78( 疏水性， 并且尤其是色氨酸 )、 位置 37( 酸性， 并且尤其 是天冬氨酸或谷氨酸 )、 位置 56( 碱性氨基酸 )、 位置 60( 疏水性氨基酸， 尤其是苯丙氨酸或 酪氨酸 )。因此， 在本文公开的每一变体中， 本公开内容提供可为保守的氨基酸的框架。可 期望保守的其它位置如下 ： 位置 52( 酸性氨基酸 )、 位置 55( 碱性氨基酸 )、 位置 81( 酸性 )、 98( 极性或带电的， 尤其是 E、 D、 R 或 K)。
在某些实施方案中， ActRIIB 多肽的分离片段可通过筛选从编码 ActRIIB 多肽的 核酸 ( 例如， SEQ ID NOs: 4 和 5) 的相应片段重组产生的多肽获得。此外， 可采用本领域 已知技术 ( 如常规的 Merrifield 固相 f-Moc 或 t-Boc 化学 ) 来化学合成片段。可 ( 通过 重组或化学合成 ) 产生片段并进行测试， 以鉴定能够充当例如 ActRIIB 蛋白或 ActRIIB 配 体的拮抗剂 ( 抑制剂 ) 或激动剂 ( 激活剂 ) 的那些肽基片段。
在某些实施方案中， GDF 捕获物多肽是具有与选自 SEQ ID NO: 2、 3、 7、 11、 26、 28、 29、 32、 37、 38、 40 或 41 的氨基酸序列具有至少 75% 同一性的氨基酸序列的变体 ActRIIB 多 肽。 在某些情况下， 该 GDF 捕获物具有与选自 SEQ ID NO: 2、 3、 7、 11、 26、 28、 29、 32、 37、 38、 40 或 41 的氨基酸序列有至少 80%、 85%、 90%、 95%、 97%、 98%、 99% 或 100% 同一性的氨基酸序列。 在某些实施方案中， GDF 捕获物包含与选自 SEQ ID NO: 2、 3、 7、 11、 26、 28、 29、 32、 37、 38、 40 或 41 的氨基酸序列有至少 80%、 85%、 90%、 95%、 97%、 98%、 99% 或 100% 同一性的氨基酸序列， 基本上由该氨基酸序列组成， 或由该氨基酸序列组成， 其中相应于 SEQ ID NO: 1 的 L79 的 位置是酸性氨基酸 ( 例如 D 或 E 氨基酸残基 )。
在某些实施方案中， 本发明考虑通过修饰 GDF 捕获物多肽的结构来制备功能变 体， 目的是增强疗效或稳定性 ( 例如， 离体保质期以及对体内蛋白水解降解的抗性 )。 GDF 捕获物多肽还可通过氨基酸取代、 去除或添加来产生。 例如， 可以合理预期单独以异亮氨酸或 缬氨酸取代亮氨酸、 以谷氨酸取代天冬氨酸、 以丝氨酸取代苏氨酸或以结构相关氨基酸进 行的类似氨基酸取代 ( 例如， 保守突变 ) 将不对所得分子的生物活性产生较大的影响。保 守取代是发生在侧链相关的氨基酸家族内的那些取代。在 GDF 捕获物多肽的氨基酸序列中 的改变是否产生功能性变体可通过评估 GDF 捕获物多肽相对于未修饰的 GDF 捕获物多肽或 野生型 ActRIIB 多肽在细胞中产生应答或与未修饰的 GDF 捕获物多肽或野生型 ActRIIB 多 肽比较结合一个或多个配体如激活素、 GDF-11 或筒箭毒碱的能力容易地测定。
在某些特定实施方案中， 本发明考虑在 ActRIIB 多肽的胞外域 ( 也称为配体 - 结 合结构域 ) 中做出突变， 以使 ActRIIB 多肽具有改变的配体 - 结合活性 ( 例如， 结合亲和力 或结合特异性 )。 在某些情况下， 这种 GDF 捕获物多肽具有对特定配体的改变的 ( 提高的或 降低的 ) 结合亲和力。在其它情况下， GDF 捕获物多肽对 ActRIIB 配体具有改变的结合特 异性。
例如， 本公开内容提供相对于激活素优先结合 GDF8/GDF11 的 GDF 捕获物多肽。本 公开内容进一步确立这种多肽减低脱靶效果的期望性， 尽管这种选择变体对于治疗严重疾 病可为较不期望的， 在该严重疾病中， 非常大的红细胞水平增长对于治疗效果是可需要的 并且其中一些水平的脱靶效果是可接受的。例如， ActRIIB 蛋白质的氨基酸残基如 E39、 K55、 Y60、 K74、 W78、 D80 和 F101 在配体 - 结合口袋中并介导与其配体如激活素和 GDF8 结合。 因此， 本发明提供包含 ActRIIB 受体的改变的配体 - 结合结构域 ( 例如， GDF8- 结合结构域 ) 的 GDF 捕获物， 其包含在这些氨基酸残基处的一个或多个突变。任选地， 相对于 ActRIIB 受 体的野生型配体 - 结合结构域， 改变的配体 - 结合结构域对配体如 GDF8 可以具有增加的选 择性。为了举例说明， 这些突变增加改变的配体 - 结合结构域相对于激活素对 GDF8 的选择 性。任选地， 改变的配体 - 结合结构域具有的用于激活素结合的 Kd 与用于 GDF8 结合的 Kd 的比相对于野生型配体 - 结合结构域的比为至少 2、 5、 10 或甚至 100 倍高。任选地， 改变的 配体 - 结合结构域具有的用于抑制激活素的 IC50 与用于抑制 GDF8 的 IC50 的比相对于野生 型配体 - 结合结构域为至少 2、 5、 10 或甚至 100 倍高。任选地， 改变的配体 - 结合结构域以 与用于抑制激活素的 IC50 相比至少 2、 5、 10 或甚至 100 倍低的 IC50 抑制 GDF8。
作为一个具体实例， ActRIIB 的配体 - 结合结构域的带正电氨基酸残基 Asp(D80) 可以突变为不同氨基酸残基， 以产生优先结合 GDF8 而不是激活素的 GDF 捕获物多肽。优选 地， D80 残基变化为选自下列的氨基酸残基 ： 不带电氨基酸残基， 负电氨基酸残基和疏水性 氨基酸残基。作为一个进一步具体实例， 疏水性残基 L79 可以改变为酸性氨基酸天冬氨酸 或谷氨酸， 以大大降低激活素结合同时保持 GDF11 结合。如本领域技术人员知晓的， 大多数 描述的突变、 变体或修饰可在核酸水平或在一些情况下通过翻译后修饰或化学合成作出。 这种技术是本领域公知的。
在某些实施方案中， 本发明考虑在 ActRIIB 中具有特定突变的 GDF 捕获物多肽， 从而改变 ActRIIB 多肽的糖基化。GDF 捕获物多肽中的示范性糖基化位点在图 1 中举例说 明 ( 例如， 下划线 NX(S/T) 位点 )。可对此类突变进行选择， 以便引入或消除一个或多个糖 基化位点， 例如 O- 联或 N- 联糖基化位点。天冬酰胺 - 联的糖基化识别位点通常包含三肽 序列， 即天冬酰胺 -X- 苏氨酸 ( 其中 “X” 为任意氨基酸 )， 其被适当的细胞糖基化酶特异性 识别。还可通过对野生型 ActRIIB 多肽序列进行一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加或取代 ( 对于 O- 联糖基化位点 ) 来进行改变。在糖基化识别位点的第一或第三氨基酸位置 之一或两者进行的多种氨基酸取代或去除 ( 和 / 或在第二位的氨基酸去除 ) 导致在修饰的 三肽序列处的非糖基化。增加 GDF 捕获物多肽上的碳水化合物部分的数量的另一种方式是 通过将糖苷化学或酶促偶联至 GDF 捕获物多肽。根据所用的偶联模式， 糖可被连接至 (a) 精氨酸和组氨酸 ； (b) 游离羧基基团 ； (c) 游离巯基基团， 例如半胱氨酸的那些 ； (d) 游离羟 基基团， 例如丝氨酸、 苏氨酸或羟脯氨酸的那些 ； (e) 芳族残基， 例如苯丙氨酸、 酪氨酸或色 氨酸的那些 ； 或者 (f) 谷氨酰胺中的酰胺基团。这些方法描述在 WO 87/05330 和 Aplin 和 Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 中， 其并入本文作为参考。可 化学和 / 或酶促实现将存在于 GDF 捕获物多肽上的一个或多个碳水化合物部分去除。化学 去糖基化可涉及， 例如， 将 GDF 捕获物多肽暴露至化合物三氟甲磺酸或等同的化合物。该处 理导致除了连接糖 (N- 乙酰葡糖胺或 N- 乙酰半乳糖胺 ) 以外大部分或全部糖的裂解， 同时 保持氨基酸序列完整。化学去糖基化进一步由 Hakimuddin 等人 (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 和 Edge 等人 (1981) Anal. Biochem. 118:131 描述。GDF 捕获物多 肽上的碳水化合物部分的酶促裂解可通过采用 Thotakura 等人 (1987) Meth. Enzymol. 138:350 所述的多种内切和外切糖苷酶来实现。适当时， GDF 捕获物多肽的序列可根据所用 表达系统的类型进行调整， 因为哺乳动物、 酵母、 昆虫和植物细胞均可导入可受到肽的氨基 酸序列影响的不同的糖基化模式。 一般而言， 虽然其它的哺乳动物表达细胞系也预期有用， 但是用于人类的 GDF 捕获物多肽会在提供适当糖基化的哺乳动物细胞系 ( 例如 HEK293 或 CHO 细胞系 ) 中表达。
本公开内容进一步考虑生成变体的方法， 特别是生成 GDF 捕获物多肽的组合变体 组、 包含任选地截短变体的方法 ； 组合突变体集合对于鉴定 GDF 捕获物序列特别有用。 筛选 此类组合文库的目的可以是生成例如具有改变的特性， 如改变的药动学或改变的配体结合 的 GDF 捕获物多肽变体。下文提供了多种筛选测定， 此类测定可用于评估变体。例如， 可针 对结合 ActRIIB 多肽、 防止 ActRIIB 配体与 ActRIIB 多肽结合或者干扰 ActRIIB 配体引起 的信号传导的能力筛选 GDF 捕获物多肽变体。
GDF 捕获物多肽或其变体的活性也可在基于细胞的测定或体内测定中进行测试。 例如， 可以评估 GDF 捕获物多肽变体对参与血细胞生成的基因的表达的作用。根据需要， 这 可以在一种或多种重组 ActRIIB 配体蛋白 ( 例如激活素 ) 的存在下进行， 且可转染细胞以 产生 GDF 捕获物多肽和 / 或其变体， 以及任选地 ActRIIB 配体。同样地， 可给小鼠或其它动 物施用 GDF 捕获物多肽， 并可应用本领域公知方法评估一种或多种血液测量值， 例如 RBC 计 数、 血红蛋白水平、 血细胞比容水平、 铁储存或网织红细胞计数。
可生成相对于参考 GDF 捕获物多肽具有选择性效力的组合衍生的变体。这种变体 蛋白质当从重组 DNA 构建体表达时可以应用在基因治疗方案中。同样地， 诱变可以产生变 体， 该变体的胞内半衰期明显不同于相应的未修饰的 GDF 捕获物多肽。例如， 改变的蛋白可 变得对于蛋白水解降解或导致未修饰的 GDF 捕获物多肽破坏或以其它方式灭活的其它过 程更加稳定或更加不稳定。这些变体以及编码它们的基因可用于通过调节 GDF 捕获物多肽 的半衰期来改变 GDF 捕获物多肽水平。例如， 短的半衰期可以产生更为短暂的生物效应， 并 且， 对于可诱导的表达系统的部分， 可允许对细胞中重组 GDF 捕获物多肽水平的更紧密控 制。在 Fc 融合蛋白中， 可在接头 ( 如有 ) 和 / 或 Fc 部分进行突变以改变该蛋白的半衰期。在某些实施方案中， 除 ActRIIB 多肽中天然存在的任意修饰之外， 本发明的 GDF 捕 获物多肽可进一步包括翻译后修饰。这些修饰包括， 但不限于， 乙酰化、 羧化、 糖基化、 磷酸 化、 脂化和酰化。其结果是， GDF 捕获物多肽可包含非氨基酸元件， 例如聚乙二醇、 脂质、 多 糖或单糖以及磷酸酯。该种非氨基酸元件对 GDF 捕获物多肽功能性的作用可按照本文针对 其它 GDF 捕获物多肽变体描述地进行测试。当 GDF 捕获物多肽通过裂解 GDF 捕获物多肽的 新生形式在细胞中产生时， 翻译后加工也可能对蛋白正确的折叠和 / 或功能是重要的。不 同的细胞 ( 例如 CHO、 HeLa、 MDCK、 293、 WI38、 NIH-3T3 或 HEK293) 对这种翻译后活性具有特 异性的细胞结构和特征机制， 并可以进行选择以确保 GDF 捕获物多肽的正确修饰和加工。
在某些方面， GDF 捕获物多肽包括具有 ActRIIB 多肽的至少一部分和一个或多 个融合结构域的融合蛋白。熟知的这种融合结构域的实例包括， 但不限于， 聚组氨酸、 Glu-Glu、 谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)、 硫氧还蛋白、 蛋白 A、 蛋白 G、 免疫球蛋白重链恒定区 (Fc)、 麦芽糖结合蛋白 (MBP) 或人血清白蛋白。可选择融合结构域来赋予所需的特性。例 如， 有些融合结构域对于通过亲和层析分离该融合蛋白特别有用。 针对亲和纯化的目的， 使 用亲和层析的相关基质， 例如谷胱甘肽 -、 淀粉酶 -、 以及镍 - 或钴 - 缀合的树脂。该类基 质中许多可以 “试剂盒” 形式获得， 例如可与 (HIS6) 融合配偶体一起使用的 Pharmacia GST 纯化系统和 QIA 表达™系统 (Qiagen)。作为另一实例， 可选择融合结构域以促进 GDF 捕获 物多肽的检测。该种检测结构域的实例包括各种荧光蛋白 ( 例如， GFP) 以及 “表位标记” ， 其通常为能够获得特异性抗体的短肽序列。 可容易地获得特异性单克隆抗体的熟知表位标 记包括 FLAG、 流感病毒血细胞凝集素 (HA) 和 c-myc 标记。在一些情况下， 融合结构域具有 蛋白酶切割位点， 例如对于 Xa 因子或凝血酶， 其允许相关的蛋白酶部分消化该融合蛋白， 从而由其释放重组蛋白。 该释放的蛋白可随后通过后续的层析分离从该融合结构域分离出 来。在某些优选实施方案中， GDF 捕获物多肽与在体内稳定 GDF 捕获物多肽的结构域 ( “稳 定剂” 结构域 ) 相融合。 “稳定” 表示增加血清半衰期的任意情况， 而不论它是由破坏减少、 肾清除率降低或其它药代动力学作用所引起。与免疫球蛋白的 Fc 部分的融合体已知能对 多种蛋白赋予所需药代动力学特性。 同样地， 与人血清白蛋白的融合体可赋予期望的特性。 可供选择的其它融合结构域类型包括多聚化 ( 例如， 二聚化、 四聚化 ) 结构域和功能性结构 域 ( 其赋予附加的生物功能， 如进一步增加红细胞水平 )。
作为一个特定实例， 本发明提供了 GDF 捕获物， 其为 ActRIIB-Fc 融合蛋白， 包含与 Fc 结构域融合的 ( 例如配体 - 结合 )ActRIIB 多肽的胞外域。示范性 Fc 结构域的序列如下 所示 (SEQ ID NO: 6)。任选地， Fc 结构域在诸如 Asp-265、 赖氨酸 322 和 Asn-434 的残基具有一个或多个 突变。在某些情况下， 具有一个或多个所述突变 ( 例如 Asp-265 突变 ) 的突变体 Fc 结构域 与 Fcγ 受体的结合能力相对于野生型 Fc 结构域有所下降。在其它情况下， 具有一个或多 个所述突变 ( 例如 Asn-434 突变 ) 的突变体 Fc 结构域与 I 类 MHC 相关的 Fc 受体 (FcRN)
的结合能力相对于野生型 Fc 结构域有所上升。
可以理解该融合蛋白的不同元件可以与所需功能性一致的任意方式排列。例如， GDF 捕获物多肽可置于异源结构域的 C- 末端， 或者替代地， 异源结构域可置于 GDF 捕获物多 肽的 C- 末端。该 GDF 捕获物多肽结构域和该异源结构域无需在融合蛋白中彼此相邻， 并且 在任一结构域的 C- 或 N- 末端或者在结构域之间可包含另外的结构域或氨基酸序列。
在某些实施方案中， GDF 捕获物融合蛋白包含式 A-B-C 示出的氨基酸序列。B 部分 是 N- 和 C- 末端截短的 ActRIIB 多肽， 由相应于 SEQ ID NO: 26 的氨基酸 26-132 的氨基酸 序列组成。A 和 C 部分可独立为 0、 1 个或多于 1 个氨基酸， 并且 A 和 C 部分在存在时对 B 都 是异源的。A 和 / 或 C 部分可通过接头序列与 B 部分连接。示范性接头包括短多肽接头如 2-10、 2-5、 2-4、 2-3 个甘氨酸残基， 例如， Gly-Gly-Gly 接头。其它适当的接头在本文上述。 在某些实施方案中， GDF 捕获物融合蛋白包含式 A-B-C 中列出的氨基酸序列， 其中 A 是前导 序列， B 由 SEQ ID NO: 26 的氨基酸 26-132 组成并且 C 是增强体内稳定性、 体内半衰期、 摄 取 / 施用、 组织定位或分布、 蛋白质复合体形成和 / 或纯化中的一个或多个的多肽部分。在 某些实施方案中， GDF 捕获物融合蛋白包含式 A-B-C 中列出的氨基酸序列， 其中 A 是 TPA 前 导序列， B 由 SEQ ID NO: 26 的氨基酸 26-132 组成， 并且 C 是免疫球蛋白 Fc 结构域。优选 的 GDF 捕获物融合蛋白包含 SEQ ID NO: 26 中列出的氨基酸序列。
在某些实施方案中， 本发明的 GDF 捕获物多肽包含能够稳定该 GDF 捕获物多肽的 一种或多种修饰。例如， 这些修饰提高 GDF 捕获物多肽的体外半衰期， 提高 GDF 捕获物多肽 的循环半衰期或减少 GDF 捕获物多肽的蛋白水解降解。这些稳定化修饰包括， 但不限于， 融 合蛋白 ( 包括， 例如， 包含 GDF 捕获物多肽和稳定剂结构域的融合蛋白 )、 糖基化位点的修 饰 ( 包括， 例如， 向 GDF 捕获物多肽添加糖基化位点 ) 以及碳水化合物部分的修饰 ( 包括， 例如， 从 GDF 捕获物多肽除去碳水化合物部分 )。在融合蛋白的情况下， GDF 捕获物多肽融 合于稳定剂结构域如 IgG 分子 ( 例如 Fc 结构域 )。本文所用的术语 “稳定剂结构域” 不仅 指融合蛋白情况下的融合结构域 ( 例如 Fc)， 还包括非蛋白质修饰， 例如碳水化合物部分， 或非蛋白质聚合物， 例如聚乙二醇。
在某些实施方案中， 本文使得可以获得 GDF 捕获物多肽的分离和 / 或纯化形式， 其 分离自其它蛋白， 或者另外地基本不含其它蛋白。
在某些实施方案中， 本发明的 GDF 捕获物多肽 ( 未修饰的或修饰的 ) 可以通过 各种公知技术产生。例如， 这种 GDF 捕获物多肽可以应用标准蛋白质化学技术合成， 如在 Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) 和 Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman 和 Company, New York (1992) 中 描 述 的 那 些。 此 外， 自 动 肽 合 成 仪 是 可 商 购 的 ( 例 如， Advanced ChemTech Model396; Milligen/Biosearch 9600)。 可选地， GDF 捕获物多肽、 其片段或变体 可应用本领域公知的各种表达系统重组产生 ( 例如， 大肠杆菌、 中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞、 COS 细胞、 杆状病毒 )。在又一实施方案中， 修饰的或未修饰的 GDF 捕获物多肽可通过应用 例如蛋白酶， 例如胰蛋白酶、 嗜热菌蛋白酶、 糜蛋白酶、 胃蛋白酶或配对碱性氨基酸转换酶 (PACE) 消化重组产生的全长 GDF 捕获物多肽产生。计算机分析 ( 应用可购得的软件， 例如 MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) 可以用于识别蛋白水解切割 位点。可选地， 这种 GDF 捕获物多肽可从重组产生的全长 GDF 捕获物多肽产生， 如本领域已知的标准技术， 如通过化学裂解 ( 例如， 溴化氰、 羟胺 )。
3. 编码 GDF 捕获物多肽的核酸 在某些方面， 本发明提供了编码本文公开的任意 GDF 捕获物多肽的分离和 / 或重组核 酸。 SEQ ID NO: 4 编码天然存在的 ActRIIB 前体多肽， 而 SEQ ID NO: 5 编码可溶性 ActRIIB 多肽， 和 SEQ ID NOs: 25、 27、 30 和 31 编码可溶性 GDF 捕获物。所述主题核酸可以是单链 的或是双链的。这样的核酸可以是 DNA 或 RNA 分子。这些核酸可以在， 例如， 制备 GDF 捕获 物多肽的方法中使用， 或者作为直接的治疗剂 ( 例如在基因治疗方法中 ) 使用。
在某些方面， 编码 GDF 捕获物多肽的主题核酸应进一步理解为包括作为 SEQ ID NOs: 5、 25、 27、 30 和 31 的变体的核酸。变体核苷酸序列包括变化一个或多个核苷酸取代、 添加或缺失的序列， 如等位基因变体 ； 并将因此包括不同于在 SEQ ID NOs: 5、 25、 27、 30 和 31 中指定的编码序列的核苷酸序列的编码序列。
在某些实施方案中， 本发明提供了与 SEQ ID NO: 5、 25、 27、 30 或 31 具有至少 80%、 85%、 90%、 95%、 97%、 98%、 99% 或 100% 同一性的分离或重组核酸序列。 本领域普通技术人员将 能理解 ： 与 SEQ ID NO: 5、 25、 27、 30 或 31 互补的核酸序列， 以及 SEQ ID NO: 5、 25、 27、 30 或 31 的变体同样在本发明的范围之内。在进一步的实施方案中， 本发明的核酸序列可以是 分离的、 重组的和 / 或与异源核苷酸序列融合， 或者在 DNA 文库中。
在其它实施方案中， 本发明的核酸还包括在高度严格的条件下与 SEQ ID NO: 5、 25、 27、 30 或 31 所示的核苷酸序列， SEQ ID NO: 5、 25、 27、 30 或 31 的互补序列或其片段杂 交的核苷酸序列。如上文所讨论的， 本领域普通技术人员将容易理解， 促进 DNA 杂交的合适 的严格条件是可以改变的。 例如， 可在 6.0 x 氯化钠 / 柠檬酸钠 (SSC)、 约 45℃下杂交， 然后 在 2.0 x SSC、 50℃下洗涤。例如， 洗涤步骤中的盐浓度可从低严格性的约 2.0 x SSC、 50℃ 至高严格性的约 0.2 x SSC、 50℃中选择。此外， 洗涤步骤中的温度可从低严格性条件的室 温， 即约 22℃上升至高严格条件的约 65℃。温度和盐可都改变， 或者可将温度或盐浓度保 持恒定， 而改变另一变量。在一种实施方案中， 本发明提供以下核酸 ： 其在 6 x SSC、 室温的 低严格条件下杂交， 然后在 2 x SSC、 室温下洗涤。
由于遗传密码的简并性而不同于 SEQ ID NO: 5、 25、 27、 30 或 31 所示核酸的分离 的核酸也在本发明的范围内。例如， 许多氨基酸由一个以上的三联体密码所指定。指定相 同氨基酸的密码子， 或称同义密码子 ( 例如， CAU 和 CAC 为组氨酸的同义密码子 ) 可导致不 影响蛋白氨基酸序列的 “沉默” 突变。在某些实施方案中， GDF 捕获物多肽将由替代核苷酸 序列编码。替代核苷酸序列相对于天然 GDF 捕获物核酸序列产生， 但仍编码相同融合蛋白。 在某些实施方案中， 具有 SEQ ID NO: 26 的 GDF 捕获物由包含 SEQ ID NO: 30 的替代核酸 序列编码。然而， 预期在哺乳动物细胞中存在确实导致主题蛋白的氨基酸序列改变的 DNA 序列多态性。本领域技术人员将能理解 ： 在编码特定蛋白的核酸中一个或多个核苷酸 ( 最 多约 3-5% 的核苷酸 ) 的这些变异可能由于天然等位基因变异而在特定物种的个体中存在。 任一和全部这些核苷酸变异以及由此产生的氨基酸多态性均在本发明的范围之内。
在某些实施方案中， 本发明的重组核酸可以在表达构建体中可操作地连接至一种 或多种调节性核苷酸序列。调节性核苷酸序列通常适合用于表达的宿主细胞。本领域已知 用于多种宿主细胞的多种类型的合适的表达载体以及合适的调节序列。 所述一种或多种调 节性核苷酸序列通常可包括， 但不限于， 启动子序列、 前导或信号序列、 核糖体结合位点、 转录起始和终止序列、 翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。本发明也考虑本领域 已知的组成型或诱导型启动子。所述启动子可以是天然存在的启动子， 或者是合并了一个 以上启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可存在于细胞中的附加体 ( 例如质粒 ) 上， 或者表达构建体可插入染色体中。 在优选的实施方案中， 表达载体包含选择标记基因， 从而 允许选择转化的宿主细胞。 选择标记基因已为本领域熟知， 并将随所用的宿主细胞而改变。
在本发明的某些方面， 在表达载体中提供主题核酸， 所述表达载体包含编码 GDF 捕获物多肽并可操作地连接于至少一种调节序列的核苷酸序列。调节序列已为本领域所 了解， 并选择用于指导 GDF 捕获物多肽的表达。因此， 术语调节序列包括启动子、 增强子以 及其它表达控制元件。示范性的调节序列描述于 Goeddel ； Gene Expression Technology: Methods in Enzymology， Academic Press， San Diego， CA (1990)。例如， 在与 DNA 序列可 操作地连接时控制该 DNA 序列表达的多种表达控制序列中的任意一种可用于这些载体中， 以表达编码 GDF 捕获物多肽的 DNA 序列。这些有用的表达控制序列包括， 例如， SV40 的早 期和晚期启动子、 tet 启动子、 腺病毒和巨细胞病毒立即早期启动子、 RSV 启动子、 lac 系统、 trp 系统、 TAC 或 TRC 系统、 由 T7 RNA 聚合酶指导表达的 T7 启动子、 噬菌体 λ 的主要操纵 子和启动子区、 fd 外壳蛋白的控制区、 3- 磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、 酸性 磷酸酶的启动子， 例如 Pho5、 酵母 α- 交配因子的启动子、 杆状病毒系统的多角体启动子以 及已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其它序列， 及其各种组合。 应当理解， 表 达载体的设计可取决于诸如待转化宿主细胞的选择和 / 或需要表达的蛋白类型等因素。此 外， 还应考虑载体的拷贝数、 控制拷贝数的能力以及由该载体编码的任何其它蛋白 ( 例如 抗生素标记 ) 的表达。
本发明的重组核酸可通过将克隆的基因或其部分连接至适于在原核细胞、 真核细 胞 ( 酵母、 禽类、 昆虫或哺乳动物 ) 或两者中表达的载体中而产生。生产重组 GDF 捕获物多 肽的表达载体包括质粒和其它载体。 例如， 合适的载体包括如下类型的质粒 ： 用于在原核细 胞 ( 例如大肠杆菌 ) 中表达的 pBR322- 衍生的质粒、 pEMBL- 衍生的质粒、 pEX - 衍生的质 粒、 pBTac - 衍生的质粒以及 pUC - 衍生的质粒。
一些哺乳动物表达载体同时包含促进载体在细菌中繁殖的原核序列和一种或 多种在真核细胞中表达的真核转录单位。pcDNAI/amp、 pcDNAI/neo、 pRc/CMV、 pSV2gpt、 pSV2neo、 pSV2-dhfr、 pTk2、 pRSVneo、 pMSG、 pSVT7、 pko-neo 和 pHyg 衍生的载体是适于真 核细胞转染的哺乳动物细胞表达载体的实例。这些载体中的一些用来自细菌质粒 ( 如 pBR322) 的序列进行修饰， 以促进在原核和真核细胞这两者中的复制和药物抗性选择。或 者， 病毒的衍生物如牛乳头瘤病毒 (BPV-1) 或 EB 病毒 (pHEBo、 pREP- 衍生的和 p205) 可用 于真核细胞中蛋白的瞬时表达。其它病毒 ( 包括逆转录病毒 ) 表达系统的实例可在下文有 关基因治疗送递系统的描述中找到。 用于制备质粒和转化宿主生物的各种方法为本领域熟 知。其它合适的原核和真核细胞表达系统以及一般的重组程序参见 Molecular Cloning A Laboratory Manual， 2nd Ed.， ed. Sambrook， Fritsch 和 Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989) Chapters 16 和 17。在某些情况下， 可能需要采用杆状病毒表达 系统来表达重组多肽。 这些杆状病毒表达系统的实例包括 pVL- 衍生的载体 ( 例如 pVL1392、 pVL1393 和 pVL941)、 pAcUW- 衍生的载体 ( 例如 pAcUW1) 以及 pBlueBac- 衍生的载体 ( 例 如含 β-gal 的 pBlueBac III)。在优选的实施方案中， 将设计用于在 CHO 细胞中产生主题 GDF 捕获物多肽的载 体， 例 如 Pcmv-Script 载 体 (Stratagene， La Jolla， Calif)、 pcDNA4 载 体 (Invitrogen， Carlsbad， Calif.) 和 pCI-neo 载体 (Promega， Madison， Wisc)。显而易见地， 该主题基因构 建体可用于引起该主题 GDF 捕获物多肽在培养物中繁殖的细胞中表达， 例如， 以产生蛋白， 包括融合蛋白或变体蛋白， 用于纯化。
本发明内容还涉及用包含一种或多种主题 GDF 捕获物多肽的编码序列 ( 例如， SEQ ID NO: 4、 5、 25、 27、 30 或 31) 的重组基因转染的宿主细胞。所述宿主细胞可以是任何原核 或真核细胞。例如， 本发明的 GDF 捕获物多肽可在细菌细胞如大肠杆菌、 昆虫细胞 ( 例如采 用杆状病毒表达系统 )、 酵母或哺乳动物细胞中表达。 其它合适的宿主细胞已为本领域技术 人员所熟知。
因此， 本发明进一步涉及生产主题 GDF 捕获物多肽的方法。例如， 用编码 GDF 捕获 物多肽的表达载体转染的宿主细胞可在适当条件下培养， 以允许发生该 GDF 捕获物多肽的 表达。所述 GDF 捕获物多肽可被分泌并从细胞和含有该 GDF 捕获物多肽的培养基的混合物 中分离。或者， GDF 捕获物多肽可保留在细胞质内或者在膜级份中， 收获、 裂解该细胞并分 离蛋白。细胞培养物包含宿主细胞、 培养基和其它副产物。细胞培养的合适培养基为本领 域熟知。该主题 GDF 捕获物多肽可从细胞培养基、 宿主细胞或两者中采用本领域已知的用 于纯化蛋白的技术分离， 该技术包括离子交换层析、 凝胶过滤层析、 超滤、 电泳、 用 GDF 捕获 物多肽的特定表位的特异性抗体进行免疫亲和纯化。在优选的实施方案中， GDF 捕获物多 肽是包含促进其纯化的结构域的融合蛋白。
在另一实施方案中， 编码纯化前导序列 ( 例如在重组 GDF 捕获物多肽的所需部分 的 N 末端的聚组氨酸 / 肠激酶切割位点序列 ) 的融合基因， 可允许通过采用 Ni2+ 金属树脂的 亲和层析来纯化表达的融合蛋白。然后该纯化前导序列可通过肠激酶处理而去除， 以提供 纯化的 GDF 捕获物多肽 ( 例如， 参见 Hochuli 等人， (1987) J. Chromatography 411: 177 ； 和 Janknecht 等人， PNAS USA 88:8972)。
制备融合基因的技术已经熟知。本质上， 采用平端或交错端的用于连接的末端， 根据常规技术连接编码不同多肽序列的各种 DNA 片段， 限制酶消化以提供合适的末端， 根 据需要补平粘端， 碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接， 并且酶促连接。在另一实施方案 中， 融合基因可通过包括自动化 DNA 合成仪的常规技术合成。或者， 可使用在两个连续基因 片段之间产生互补突出端的锚定引物进行基因片段的 PCR 扩增， 此两个连续基因片段随后 可退火形成嵌合基因序列 ( 例如， 参见 Current Protocols in Molecular Biology ， eds. Ausubel 等人， John Wiley & Sons: 1992)。
4. 筛选测定 在某些方面， 本发明涉及主题 GDF 捕获物多肽 ( 例如 , 可溶性变体 ActRIIB 多肽 ) 用 于鉴定作为 ActRIIB 多肽的激动剂或拮抗剂的化合物 ( 药剂 ) 的应用。 可测试通过该筛选 所鉴定的化合物， 以评估它们在体内或体外调节红细胞、 血红蛋白和 / 或网织红细胞水平 的能力。这些化合物可以在， 例如， 动物模型中测试。
有多种方法筛选通过靶向 ActRIIB 信号传导来提高红细胞或血红蛋白水平的治 疗剂。在某些实施方式中， 可进行化合物的高通量筛选， 从而鉴定在选定的细胞系上干扰 ActRIIB- 介导的作用的药剂。在某些实施方式中， 实施该测定以筛选并鉴定特异性抑制或减少 ActRIIB 多肽与其结合配偶体， 如 ActRIIB 配体 ( 例如， 激活素、 Nodal、 GDF8、 GDF11 或 BMP7) 的结合的化合物。或者， 该测定可用于鉴定增加 ActRIIB 多肽与其结合配偶体如 ActRIIB 配体的结合的化合物。 在进一步的实施方式中， 化合物可通过其与 ActRIIB 多肽相 互作用的能力来鉴定。
多种测定形式可满足需要， 且根据本公开内容， 未在本文明确描述的测定可被本 领域普通技术人员所理解。如本文所述， 本发明的测试化合物 ( 药剂 ) 可通过任意组合的 化学方法生成。或者， 该主题化合物可以是在体内或体外合成的天然存在的生物分子。用 于测试其作为组织生长调节剂的能力的待测试化合物 ( 药剂 ) 可通过， 例如， 细菌、 酵母、 植 物或其它生物产生 ( 例如， 天然产物 )， 通过化学方法产生 ( 例如， 小分子， 包括肽模拟物 ) 或重组产生。本发明考虑的测试化合物包括非肽基有机分子、 肽、 多肽、 肽模拟物、 糖、 激素 和核酸分子。在特定实施方式中， 该测试药剂是分子量小于约 2000 道尔顿的小有机分子。
本发明的测试化合物可以作为单独的、 分散的实体提供， 或者在更复杂的文库中 提供， 例如通过组合化学制备。这些文库可包含， 例如， 醇、 卤代烷、 胺、 酰胺、 酯、 醛、 醚和其 它有机化合物类别。测试化合物可以分离形式或化合物的混合物展示于测试系统 ( 特别是 在初始筛选步骤中 )。任选地， 化合物任选可用其它化合物衍生， 并具有促进该化合物分离 的衍生基团。衍生基团的非限制性实例包括， 生物素、 荧光素、 洋地黄毒苷、 绿色荧光蛋白、 同位素、 聚组氨酸、 磁珠、 谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)、 可光活化的交联剂或其任意组合。
在许多对化合物和天然提取物文库进行测试的药物筛选程序中均期望使用高通 量测定， 从而使给定时间范围内所考察的化合物数量达到最大化。在无细胞系统中进行的 测定 ( 如可以用纯化或半纯化蛋白衍生 ) 常被优选为 “初级” 筛选， 因为可以产生它们， 从 而允许快速开发和相对容易检测由测试化合物介导的分子靶中的改变。此外， 测试化合物 的细胞毒性或生物利用度通常在体外系统中可被忽略， 使测定替代地主要集中在药物对分 子靶的作用， 其可通过 ActRIIB 多肽与其结合配偶体 ( 例如， ActRIIB 配体 ) 之间的结合亲 和力的改变所显示。
仅为阐述目的， 在本发明的示例性筛选测定中， 感兴趣的化合物与分离和纯化的 ActRIIB 多肽 ( 其通常能够结合 ActRIIB 配体， 如适用于分析目的 ) 相接触。然后向化合物 与 ActRIIB 多肽的混合物中添加含有 ActRIIB 配体的组合物。对 ActRIIB/ActRIIB 配体复 合物的检测和定量为测定化合物抑制 ( 或加强 )ActRIIB 多肽和其结合蛋白质之间复合物 形成的效力提供了手段。 该化合物的效力可通过由不同浓度的测试化合物所得的数据生成 剂量反应曲线而进行评估。此外， 还可进行对照测定以提供用于比较的基线。例如， 在对照 测定中， 向含有 ActRIIB 多肽的组合物中添加分离和纯化的 ActRIIB 配体， 并在缺乏测试化 合物的情况下对 ActRIIB/ActRIIB 配体复合物的形成进行定量。应当理解， 一般而言混合 反应物的顺序可以变化， 并且可以同时混合。此外， 细胞提取物和裂解物可取代纯化蛋白， 用于产生合适的无细胞测定系统。
ActRIIB 多肽和其结合蛋白之间的复合物形成可通过多种技术检测。例如， 可采 32 35 14 3 用， 例如， 可检测地标记的蛋白如放射性标记的 ( 例如， P、 S、 C 或 H)、 荧光标记的 ( 例 如， FITC) 或酶标记的 ActRIIB 多肽或其结合蛋白， 通过免疫测定或通过色谱检测对复合物 形成的调节进行定量。
在某些实施方式中， 本发明考虑使用荧光极化测定和荧光共振能量转移 (FRET)测定来直接或间接测量 ActRIIB 多肽和它的结合蛋白之间的相互作用程度。此外， 其它检 测模式， 例如基于光波导 (PCT 公开 WO 96/26432 和美国专利号 5,677,196)、 表面等离子共 振 (SPR)、 表面电荷传感器和表面力传感器的那些， 可适用于本发明的多种实施方式。
此外， 本发明考虑使用相互作用捕获测定 ( 也称为 “双杂交测定” ) 来鉴定破坏 或加强 ActRIIB 多肽及其结合配偶体之间的相互作用的药剂。例如， 参见， 美国专利号 5,283,317 ； Zervos 等 人 (1993) Cell 72:223-232 ； Madura 等 人 (1993) J Biol Chem 268:12046-12054 ； Bartel 等 人 (1993) Biotechniques 14:920-924 ； 以 及 Iwabuchi 等 人 (1993) Oncogene 8:1693-1696)。在特定实施方式中， 本发明考虑使用逆向双杂交系 统来鉴定使 ActRIIB 多肽及其结合蛋白之间的相互作用解离的化合物 ( 例如， 小分子或 肽 )。 例 如， 参 见 Vidal 和 Legrain， (1999) Nucleic acids Res 27:919-29 ； Vidal 和 Legrain， (1999) Trends Biotechnol 17:374-81 ； 以及美国专利号 5,525,490 ； 5,955,280 ； 和 5,965,368。
在某些实施方式中， 可通过与 ActRIIB 多肽相互作用的能力来鉴定主题化合物。 化合物与 ActRIIB 多肽之间的相互作用可以是共价或非共价的。例如， 这种相互作用可应 用体外生物化学方法在蛋白水平上鉴定， 所述生物化学方法包括光交联、 放射性标记的配 体结合以及亲和层析 (Jakoby WB 等人， 1974， Methods in Enzymology 46: 1)。在某些 情况下， 可在基于机理的测定 ( 例如检测结合 ActRIIB 多肽的化合物的测定 ) 中筛选化合 物。这可包括固相或液相结合事件。或者， 编码 ActRIIB 多肽的基因可用报道系统 ( 例如， β- 半乳糖苷酶、 萤光素酶或绿色荧光蛋白 ) 转染进入细胞， 并优选通过高通量筛选对文库 进行筛选或用文库的各个成员进行筛选。 可使用其它的基于机理的结合测定， 例如， 检测自 由能变化的结合测定。可在靶被固定至孔、 珠或芯片或者被固定化抗体捕获或者被毛细管 电泳分辨的情况下实施结合测定。 结合化合物通常可采用比色或荧光或表面等离子共振进 行检测。
5. 示例性治疗用途 在某些实施方式中， 本发明的 GDF 捕获物多肽可用于在哺乳动物 ( 如啮齿动物和灵长 类动物， 特别是在人类患者 ) 中提高红细胞水平。另外地， 如本文示出， GDF 捕获物多肽可 联合 EPO 受体激活剂应用以在较低剂量范围实现红细胞增加。这可在减低已知脱靶效果和 与高剂量 EPO 受体激活剂相关的风险中有益。在某些实施方式中， 本发明提供了通过给个 体施用治疗有效量的 GDF 捕获物多肽或 GDF 捕获物多肽和 EPO 受体激活剂的联合 ( 或联合 治疗 ) 而治疗或预防有需要的个体的贫血的方法。这些方法可用于哺乳动物 ( 特别是人 ) 的治疗性或预防性治疗。
GDF 捕获物多肽可联合 EPO 受体激活剂应用以降低对 EPO 副作用易感的患者中这 些激活剂的需要剂量。EPO 的主要副作用是血细胞比容或血红蛋白水平的过度增加和红 细胞增多症。提高的血细胞比容水平可以引起高血压 ( 更尤其是高血压恶化 ) 和血管血 栓。已报告的 EPO 的其它副作用， 涉及高血压的其中一些是头痛、 流感样综合征、 旁路阻塞、 归于血栓症的心肌梗塞和脑惊厥、 高血压脑病和红细胞 applasia(Singibarti, (1994) J. Clin Investig 72(suppl 6), S36-S43; Horl 等人 (2000) Nephrol Dial Transplant 15(suppl 4), 51-56; Delanty 等人 (1997) Neurology 49, 686-689; Bunn (2002) N Engl J Med 346(7), 522-523)。本文公开的 GDF 捕获物多肽对红细胞水平的快速效果表明这些制剂通过与 EPO 不 同的机制起作用。相应地， 这些拮抗剂可用于增加对 EPO 不充分应答的患者中的红细胞和 血红蛋白水平。例如， GDF 捕获物多肽可有益于其中施用正常至增加 (>300 IU/kg/ 周 ) 剂 量的 EPO 不导致血红蛋白水平增加直至靶水平的患者。具有不充分 EPO 应答的患者发现于 所有类型的贫血， 但较高数目的非应答者已在患有癌症的患者和患有末期肾脏疾病的患者 中特别频繁地观察到。对 EPO 的不充分应答可以是组成性的 ( 即在用 EPO 初次治疗后观察 到 ) 或获得性的 ( 例如在用 EPO 反复治疗后观察到 )。
本文所用的 “预防” 病症或状况的治疗剂指在统计样本中相对未治疗的对照样本 减少治疗样本中的病症或状况的发生， 或者相对未治疗的对照样本延迟病症或状况的一种 或多种症状的发作或减少其严重性的化合物。本文所用的术语 “治疗” 包括预防指定的状 况或者在其形成后改善或消除该状况。在任一情况下， 预防或治疗可在医师或其他健康护 理提供者所提供的诊断和该治疗剂的施用的预期结果中得到辨别。
如本文所示， 任选地与 EPO 受体激活剂联合的本文公开的 GDF 捕获物多肽可用于 提高健康个体的红细胞、 血红蛋白或网织红细胞水平， 且这些 GDF 捕获物多肽可用于选定 的患者群体。合适的患者群体的实例包括具有不希望的低红细胞或血红蛋白水平的患者， 例如患有贫血的患者， 以及具有发展不希望的低红细胞或血红蛋白水平的风险的患者， 例 如正要进行可能导致大量失血的大手术或其它过程的患者。在一个实施方式中， 采用 GDF 捕获物多肽治疗具有足够红细胞水平的患者以提高红细胞水平， 然后抽出血液并保存， 供 以后输血使用。
任选地与 EPO 受体激活剂联合的本文公开的 GDF 捕获物多肽可用于提高患有贫血 的患者中的红细胞水平。 当在人类中观察血红蛋白水平时， 尽管考虑个体变异， 低于适当的 年龄和性别分类的正常值的水平可表示贫血。 例如， 12 g/dl 的血红蛋白水平通常认为是一 般成年群体中的正常值的下限。潜在的原因包括失血、 营养缺乏、 药物反应、 与骨髓和多种 疾病有关的各种问题。更具体而言， 贫血与多种病症相关， 其包括， 例如， 慢性肾功能衰竭、 骨髓异常增生综合征、 类风湿关节炎、 骨髓移植。贫血还可与如下状况相关 ： 实体瘤 ( 如乳 腺癌、 肺癌、 结肠癌 ) ； 淋巴系统的肿瘤 ( 如慢性淋巴细胞白血病， 非何杰金淋巴瘤和何杰金 淋巴瘤 ) ； 造血系统的肿瘤 ( 如白血病、 骨髓异常增生综合征、 多发性骨髓瘤 ) ； 放疗 ； 化疗 ( 如含铂的方案 ) ； 炎性和自身免疫疾病， 包括但不限于类风湿关节炎、 其它炎性关节炎疹、 系统性红斑狼疮 (SLE)、 急性或慢性皮肤疾病 ( 例如， 牛皮癣 )、 炎性肠病 ( 例如， 克罗恩病 和溃疡性结肠炎 ) ； 急性或慢性肾疾病或衰竭， 包括特发性或先天性状况 ； 急性或慢性肝疾 病； 急性或慢性出血 ； 由于患者的异体或自体抗体和 / 或由于宗教原因 ( 例如， 某些耶和华 证人 ) 而不能输注红细胞的情况 ； 感染 ( 例如， 疟疾， 骨髓炎 ) ； 血红蛋白病， 包括， 例如， 镰 状细胞疾病、 地中海贫血 ； 药物使用或滥用， 例如， 酒精滥用 ； 由于任何避免输血的原因导 致的贫血的儿科患者 ； 以及由于担心循环负荷而不能接受输血的患贫血的年长患者或基础 心肺疾病患者。
任选地与 EPO 受体激活剂联合的 GDF 捕获物多肽对于治疗低增殖性骨髓的贫血 ( 其典型地与红细胞 (RBC) 形态的很少改变相关 ) 是合适的。低增殖性贫血包括 ： 1) 慢性 疾病的贫血， 2) 肾疾病的贫血， 和 3) 与低代谢状态相关的贫血。 在这些类型的每一种中， 内 源性促红细胞生成素水平对于观察到的贫血程度是不适当低的。其它低增殖性贫血包括 ：4) 早期缺铁性贫血， 和 5) 由骨髓损伤导致的贫血。在这些类型中， 内源性促红细胞生成素 水平对于观察到的贫血程度是合适地升高的。
最常见的类型是慢性疾病的贫血， 所述慢性疾病包括炎症、 感染、 组织损伤和诸如 癌的状况， 并且通过低促红细胞生成素水平和骨髓中对促红细胞生成素的反应不足这两者 来区分 (Adamson, 2008, Harrison’ s Principles of Internal Medicine, 17th ed.; McGraw Hill, New York, pp 628-634)。很多因素会导致癌相关的贫血。一些与疾病过 程本身和炎性细胞因子如白介素 -1、 干扰素 -γ 和肿瘤坏死因子的产生相关 (Bron 等 人 , 2001, Semin Oncol 28(Suppl 8):1-6)。在其效果中， 炎症诱导关键的铁调节肽铁 调素 (hepcidin)， 从而抑制铁从巨噬细胞运出， 并且通常限制用于红细胞生成的铁利用度 (Ganz, 2007, J Am Soc Nephrol 18:394-400)。经各种途径的失血也会导致癌相关的贫 血。由于癌进展导致的贫血的普遍程度随癌类型而不同， 从前列腺癌中的 5% 直至多发性骨 髓瘤中的 95%。癌相关的贫血对患者具有明显后果， 包括疲乏和生活质量下降、 疗效降低和 死亡率上升。
慢性肾疾病与低增殖性贫血相关， 所述贫血的严重程度随肾损害的程度改变。所 述贫血主要是由于促红细胞生成素的产生不足和红细胞存活减少。 慢性肾疾病通常在数年 或数十年的时间中逐渐进展到末期 (5 期 ) 疾病， 此时需要进行透析或肾移植来使患者存 活。贫血通常在此过程的早期发生， 并且随疾病进展恶化。已充分记载了肾疾病的贫血的 临床后果， 包括发展左心室肥厚、 认知功能受损、 生活质量下降和免疫功能改变 (Levin 等 人 , 1999, Am J Kidney Dis 27:347-354; Nissenson, 1992, Am J Kidney Dis 20(Suppl 1):21-24; Revicki 等人 , 1995, Am J Kidney Dis 25:548-554; Gafter 等人 , 1994, Kidney Int 45:224-231)。如申请人在慢性肾疾病的小鼠模型中所证明的 ( 参见下文实施 例 )， 任选地与 EPO 受体激活剂联合的 GDF 捕获物多肽可以用于治疗肾疾病的贫血。
很多导致低代谢速率的状况会产生轻到中度低增殖性贫血。 在所述状况中包括内 分泌缺陷状况。例如， 在阿狄森病、 甲状腺机能减退、 甲状旁腺功能亢进或去势或用雌激素 治疗的男性中会发生贫血。轻到中度贫血也可以随蛋白的饮食摄取减少 ( 在老年人中特 别普遍的一种状况 ) 而发生。最后， 具有由几乎任何原因导致的慢性肝病的患者中也会发 展贫血 (Adamson, 2008, Harrison’ s Principles of Internal Medicine, 17th ed.; McGraw Hill, New York, pp 628-634)。
大量急性失血如外伤或产后出血引起的贫血称为急性出血后贫血。 急性失血最初 引起血容量不足， 没有贫血， 因为存在 RBC 连同其它血液成分的按比例耗竭。但是， 血容量 不足会快速地触发将流体从血管外转移到血管腔隙的生理机制， 这导致血液稀释和贫血。 如果是慢性的， 则失血逐渐耗竭机体铁储存和最终导致铁缺乏。如申请人在小鼠模型中说 明的 ( 参见下文实施例 )， 任选地与 EPO 受体激活剂联合的 GDF 捕获物多肽可以用于从急性 失血的贫血快速恢复。
缺铁性贫血是不断增加的铁缺乏的分级进展 ( 其包括作为中间阶段的铁的负平 衡和缺铁性红细胞生成 ) 中的最终阶段。铁缺乏可以由增加的铁需求、 减少的铁摄取或 增加的铁丢失导致， 其在以下状况中示例 ： 诸如妊娠、 饮食不足、 肠吸收不良、 急性或慢性 炎症， 以及急性或慢性失血。伴随这种类型的轻到中度贫血， 骨髓保持低增殖性， 并且 RBC 形态大致正常 ； 但是， 即使轻度贫血也会导致一些小红细胞低血色素的 RBC， 并且， 向严重缺铁性贫血的转变伴随骨髓的高增殖和越来越普遍存在的小红细胞和低血色素的 RBC (Adamson, 2008, Harrison’ s Principles of Internal Medicine, 17th ed.; McGraw Hill, New York, pp 628-634)。 缺铁性贫血的适当治疗取决于其原因和严重程度， 口服铁 制剂、 肠胃外铁制剂和 RBC 输注是主要的常规选择。任选地与 EPO 受体激活剂联合的 GDF 捕获物多肽可以单独或与常规治疗方法联合用于治疗慢性缺铁性贫血， 特别是用于治疗多 因素来源的贫血。
低增殖性贫血可以由骨髓的原发功能障碍或衰竭 ( 而不是继发于炎症、 感染或癌 进展的功能障碍 ) 导致。突出的实例是由癌化疗药物或癌放疗导致的骨髓抑制。广泛的临 床试验综述发现 100% 的化疗后患者中会发生轻度贫血， 而在多至 80% 的这些患者中会发生 更严重的贫血 (Groopman 等人 , 1999, J Natl Cancer Inst 91:1616-1634)。 骨髓抑制药 物包括 ： 1) 烷化剂， 如氮芥 ( 如美法仑 ) 和亚硝基脲 ( 如链脲霉素 ) ； 2) 抗代谢药， 如叶酸 拮抗剂 ( 如氨甲喋呤 )、 嘌呤类似物 ( 如硫鸟嘌呤 ) 和嘧啶类似物 ( 如吉西他滨 ); 3) 细 胞毒性抗生素如蒽环类抗生素 ( 如阿霉素 ); 4) 激酶抑制剂 ( 如吉非替尼 ); 5) 有丝分 裂抑制剂如紫杉烷类 ( 如紫杉醇 ) 和长春花生物碱 ( 如长春瑞滨 ); 6) 单克隆抗体 ( 如 利妥昔单抗 ); 和 7) 拓扑异构酶抑制剂 ( 如托泊替康和依托泊苷 )。如在化疗诱导的贫 血的小鼠模型中所证明的 ( 参见下文实施例 )， 任选地与 EPO 受体激活剂联合的 GDF 捕获物 多肽可以用于治疗化疗剂和 / 或放疗导致的贫血。 任选地与 EPO 受体激活剂联合的 GDF 捕获物多肽也适合于治疗 RBC 成熟紊乱的贫 血， 其特征部分在于尺寸不足 ( 小红细胞 )、 尺寸过大 ( 巨红细胞 )、 奇形怪状或异常颜色的 ( 低血色素的 )RBC。
尽管较低的目标水平可引起较少的心血管副作用， 可采用目的在于将患者恢复 至目标血红蛋白水平的给药方案来治疗患者， 该目标血红蛋白水平通常在约 10 g/dl 和 约 12.5 g/dl 之间， 典型地约为 11.0 g/dl( 也参见 Jacobs 等人 (2000) Nephrol Dial Transplant 15， 15-19)。或者， 血细胞比容水平 ( 细胞占血样体积的百分比 ) 可用作对红 细胞状况的测量值。 对于健康个体的血细胞比容水平， 成年男性的范围为 41-51%， 成年女性 的范围为 35-45%。目标血细胞比容水平通常约为 30-33%。此外， 血红蛋白 / 血细胞比容水 平随个体而变化。因此， 最佳情况下， 该目标血红蛋白 / 血细胞比容水平可针对每位患者进 行个体化。
在某些实施方案中， 本发明提供通过测量患者中一个或多个血液学参数用于管理 已用 GDF 捕获物多肽治疗或是 GDF 捕获物多肽治疗候选者的患者的方法。血液学参数可用 于评价对于是 GDF 捕获物多肽治疗候选者的患者的适当给药、 监测在用 GDF 捕获物多肽治 疗期间的血液学参数、 评价是否在用 GDF 捕获物多肽治疗期间调节剂量、 和 / 或评价 GDF 捕 获物多肽的适当的维持剂量。如果血液学参数中的一个或多个在正常水平外， 用 GDF 捕获 物多肽给药可降低、 延迟或停止。
可根据本文提供的方法测量的血液学参数包括例如， 红细胞水平、 血压、 铁储存和 与增加的红细胞水平相关的体液中发现的其它药剂， 其应用本领域公知方法。这种参数可 应用来自患者的血样确定。红细胞水平、 血红蛋白水平和 / 或血细胞比容水平的增加可引 起血压的增加。
在一个实施方案中， 如果一个或多个血液学参数在正常范围之外或在正常高侧，则在为 GDF 捕获物多肽治疗候选者的患者中， GDF 捕获物多肽的开始施用可延迟， 直至血液 学参数已自然地或经治疗干预回复到正常或可接受的水平。例如， 如果候选患者是高血压 或高血压前期， 则患者可用降压药治疗以便降低患者的血压。适用于个别患者的状况的任 何降压药都可应用， 包括例如， 利尿药、 肾上腺素能抑制剂 ( 包括 α 受体阻滞剂和 β 受体 阻滞剂 )、 血管扩张剂、 钙通道阻滞剂、 血管紧张素转换酶 (ACE) 抑制剂或血管紧张素 II 受 体阻滞剂。血压可可选地应用饮食和锻炼方案治疗。类似地， 如果候选患者具有低于正常 或正常低侧的铁储存， 则患者可用适当的饮食和 / 或铁补充方案治疗， 直至患者的铁储存 回复到正常或可接受的水平。对于具有高于正常红细胞水平和 / 或血红蛋白水平的患者， 则施用 GDF 捕获物多肽可延迟， 直至水平回复到正常或可接受的水平。
在某些实施方案中， 如果一个或多个血液学参数在正常范围外， 或在正常高侧， 则 在为 GDF 捕获物多肽治疗候选者的患者中， 开始施用可延迟。但是， GDF 捕获物多肽的剂量 或给药频率可设置为会降低施用 GDF 捕获物多肽时增加的血液学参数中的不可接受增加 的风险的量。可选地， 治疗方案可针对组合 GDF 捕获物多肽和解决不期望水平的血液学参 数的治疗剂的患者开发。例如， 如果患者具有提高的血压， 则可设计牵涉施用 GDF 捕获物多 肽和降压药的治疗方案。对于具有低于期望的铁储存的患者， 可开发 GDF 捕获物多肽和铁 补充的治疗方案。
在一个实施方案中， 可对为 GDF 捕获物多肽治疗候选者的患者确立对于一个或多 个血液学参数的基线参数， 并且基于基线值对该患者确立适当的给药方案。 可选地， 基于患 者的医疗史确立的基线参数可用于告知对患者的适当的 GDF 捕获物多肽给药方案。例如， 如果健康患者具有高于限定正常范围的确立的基线血压读数， 在 GDF 捕获物多肽治疗前可 不必使患者的血压成为对一般群体考虑为正常的范围。在 GDF 捕获物多肽治疗前患者的一 个或多个血液学参数的基线值也可用作相关比较值来监测 GDF 捕获物多肽治疗期间血液 学参数的任何变化。
在某些实施方案中， 一个或多个血液学参数在 GDF 捕获物多肽治疗的患者中测 量。该血液学参数可用于在治疗期间监测患者并允许调整或停止 GDF 捕获物多肽给药或另 一治疗剂的额外给药。例如， 如果施用 GDF 捕获物多肽导致血压、 红细胞水平或血红蛋白水 平增加， 或铁储存降低， 则 GDF 捕获物多肽的剂量可在量或频率方面降低， 以便降低 GDF 捕 获物多肽对一个或多个血液学参数的作用。如果施用 GDF 捕获物多肽导致不利于患者的一 个或多个血液学参数变化， 则 GDF 捕获物多肽的给药可临时地、 直至血液学参数回复到可 接受的水平、 或永久地停止。类似地， 如果一个或多个血液学参数在减低施用 GDF 捕获物多 肽的剂量或频率后不在可接受的范围内， 则给药可停止。作为减低或停止 GDF 捕获物多肽 给药的替代或附加， 患者可给予解决血液学参数的不期望水平的额外治疗剂， 例如， 降压药 或铁补充剂。例如， 如果用 GDF 捕获物多肽治疗的患者具有提高的血压， 则 GDF 捕获物多肽 给药可在相同水平持续， 并且将降压药加入治疗方案， GDF 捕获物多肽给药可降低 ( 例如， 量和 / 或频率 ) 并且将降压药加入治疗方案， 或 GDF 捕获物多肽给药可停止并且患者可用 降压药治疗。
在某些实施方案中， 正用 GDF 捕获物多肽治疗的患者或要用 GDF 捕获物多肽治疗 的候选患者是需要肌肉生长的患者， 如患有神经肌肉障碍或肌肉产生障碍的患者、 或处于 发生神经肌肉障碍或肌肉产生障碍的风险中的患者。例如， 患者或候选患者可患有下列病症或处于发生下列病症的风险中 ： Lou Gehrig 病 (ALS)、 癌症厌食症 - 恶病质综合征、 肌营 养不良症、 肌肉萎缩、 充血阻塞性肺疾病 ( 和与 COPD 相关的肌肉萎缩 )、 肌肉萎缩综合征、 少肌症或恶病质。肌营养不良症指一组退行性肌肉疾病， 特征是骨骼肌以及有时心肌和呼 吸肌的逐渐变弱和劣化。可用包括主题 GDF 捕获物多肽的方案治疗的示范性肌营养不良包 括： 杜氏肌营养不良 (DMD)、 贝克肌营养不良 (BMD)、 埃 - 德二氏肌营养不良 (EDMD)、 肢带肌 营养不良 (LGMD)、 面肩肱型肌营养不良 (FSH 或 FSHD) ( 也称为 Landouzy-Dejerine)、 营 养不良性肌强直 (MMD) ( 也称为斯坦纳特病 )、 眼咽肌营养不良 (OPMD)、 远侧肌营养不良 (DD)、 先天性肌营养不良 (CMD)。
6. 药物组合物 在某些实施方案中， 本发明的化合物 ( 例如， GDF 捕获物多肽 ) 与药学可接受的载体一 起配制。例如， GDF 捕获物多肽可单独施用或作为药物制剂 ( 治疗组合物 ) 的组分施用。可 以配制所述主题化合物， 从而以任何方便的方式施用， 用于人或兽医中。
在某些实施方式中， 本发明的治疗方法包括作为移植物或装置全身或局部施用组 合物。在施用时， 用于本发明的治疗组合物当然地呈无致热原、 生理学可接受的形式。除了 GDF 捕获物多肽以外的、 也可任选包含在上述组合物中的治疗有用的药剂可在本发明的方 法中与主题化合物 ( 例如， GDF 捕获物多肽 ) 同时或序贯施用。
典型地， 将肠胃外施用化合物。适合肠胃外施用的药物组合物可包含一种或多种 GDF 捕获物多肽， 其与以下组分组合 ： 一种或多种药学可接受的无菌等渗水溶液或非水溶 液、 分散液、 混悬液或乳状液 ； 或者可在即将使用之前重配成无菌的可注射溶液或分散液的 无菌粉末， 其可含有抗氧化剂、 缓冲剂、 抑菌剂、 使制剂与预期的接受者的血液等渗的溶质、 或者悬浮剂或增稠剂。 可在本发明药物组合物中采用的合适的水性和非水性载体的实例包 括水、 乙醇、 多元醇 ( 如甘油、 丙二醇、 聚乙二醇等 ) 及其合适的混合物 ； 植物油， 如橄榄油 ； 以及可注射的有机酯， 如油酸乙酯。例如， 可通过使用包覆材料如卵磷脂， 在分散液的情况 下通过维持所需要的粒度， 以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
此外， 可以用于送递到靶组织部位 ( 如骨髓 ) 的形式将组合物包封或注射。在某 些实施方案中， 本文所述的组合物可包含能够将一种或多种治疗化合物 ( 如 GDF 捕获物多 肽 ) 送递到靶组织部位 ( 如骨髓 ) 的基质， 为发育中组织提供结构且最优能够被再吸收进 入体内。例如， 所述基质可提供 GDF 捕获物多肽的缓慢释放。此类基质可由当前用于其它 植入医疗应用中的材料形成。
基质材料的选择基于生物相容性、 生物可降解性、 机械性质、 美学外观和界面性 质。主题组合物的具体应用将限定合适的制剂。用于组合物的可能的基质可以是生物可降 解的和在化学上定义的硫酸钙、 磷酸三钙、 羟磷灰石、 聚乳酸和聚酸酐。其它可能的材料是 生物可降解的且在生物学上充分定义的， 例如骨或真皮胶原。进一步的基质包括纯蛋白或 细胞外基质组分。 其它可能的基质是不可生物降解且经化学定义的， 例如烧结的羟磷灰石、 生物玻璃、 铝酸盐或其它陶瓷。 基质可包含任意上述类型的材料的组合， 例如聚乳酸与羟磷 灰石或者胶原蛋白与磷酸三钙的组合。可以在组成上 ( 如钙 - 铝酸盐 - 磷酸盐 ) 改变生物 陶瓷， 并进行加工， 以改变孔径、 粒度、 粒子形状和生物可降解性。
在某些实施方案中， 本发明的方法可以口服施用， 例如为以下的形式 ： 胶囊、 扁囊 剂、 丸剂、 片剂、 糖锭 ( 使用矫味的基料 (flavored basis)， 通常是蔗糖和阿拉伯树胶或西黄耆胶 )、 粉剂、 颗粒或作为在水性或非水性液体中的溶液或混悬液、 或者作为水包油或油 包水的液体乳状液、 或作为酏剂或糖浆、 或作为锭剂 ( 采用惰性基质， 如明胶和甘油或者蔗 糖和阿拉伯树胶 ) 和 / 或作为漱口剂等等， 每种形式含有预定量的药剂作为有效成分。药 剂也可以以大丸剂、 药糖剂 (electuary) 或糊剂的形式给予。
在用于口服施用的固体剂型 ( 胶囊、 片剂、 丸剂、 糖衣剂、 粉剂、 颗粒等等 ) 中， 一 种或多种本发明的治疗化合物可与一种或多种药学可接受的载体 ( 例如柠檬酸钠或磷酸 二钙 ) 和 / 或任意以下物质混合 ： (1) 填充剂或增量剂， 如淀粉、 乳糖、 蔗糖、 葡萄糖、 甘露醇 和 / 或硅酸 ； (2) 粘结剂， 诸如， 例如羟甲基纤维素、 藻酸盐、 明胶、 聚乙烯吡咯烷酮、 蔗糖和 / 阿拉伯树胶 ； (3) 保湿剂如甘油 ； (4) 崩解剂， 如琼脂 - 琼脂、 碳酸钙、 马铃薯或木薯淀粉、 藻 酸、 某些硅酸盐以及碳酸钠 ； (5) 溶液阻滞剂， 如石蜡 ； (6) 吸收促进剂， 如季铵化合物 ； (7) 湿润剂， 如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯 ； (8) 吸附剂， 如高岭土和膨润土 ； (9) 润滑剂， 如滑石、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁、 固体聚乙二醇、 十二烷基硫酸钠及其混合物 ； 以及 (10) 着色剂。在胶 囊、 片剂和丸剂的情况下， 药物组合物还可以包含缓冲剂。 相似类型的固体组合物也可以在 软和硬填充明胶胶囊中用作填充剂， 所述胶囊使用诸如以下的赋形剂 ： 乳糖或奶糖， 以及高 分子量聚乙二醇等等。
用于口服施用的液体剂型包括药学可接受的乳状液、 微乳状液、 溶液、 混悬液、 糖 浆和酏剂。 除了活性成分之外， 液体剂型可包含本领域通常使用的惰性稀释剂， 如水或其它 溶剂， 增溶剂和乳化剂， 如乙醇、 异丙醇、 碳酸乙酯、 乙酸乙酯、 苯甲醇、 苯甲酸苄酯、 丙二醇、 1,3- 丁二醇， 油 ( 尤其是棉籽油、 花生油、 玉米油、 胚芽油、 橄榄油、 蓖麻油和芝麻油 )， 甘油， 四氢糠醇， 聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯， 及其混合物。除了惰性稀释剂， 口服组合 物也可以包含佐剂， 如湿润剂、 乳化剂和悬浮剂、 甜味剂、 矫味剂、 着色剂、 香料和防腐剂。
除了活性化合物， 混悬液可包含悬浮剂， 如乙氧基化异十八醇、 聚氧乙烯山梨醇、 失水山梨糖醇酯、 微晶纤维素、 偏氢氧化铝、 膨润土、 琼脂 - 琼脂和西黄耆胶， 及其混合物。
本发明的组合物也可以含有佐剂， 如防腐剂、 湿润剂、 乳化剂和分散剂。通过引入 各种抗菌剂和抗真菌剂 ( 例如对羟基苯甲酸酯、 氯丁醇、 苯酚山梨酸等 ) 来保证防止微生物 的作用。也可希望将等渗剂 ( 如糖、 氯化钠等 ) 包含入组合物中。此外， 可通过包含延迟吸 收的试剂 ( 如单硬脂酸铝和明胶 ) 来延长可注射药物形式的吸收。
可以理解剂量方案可由主治医师考虑改变本发明主题化合物 ( 例如， GDF 捕获物 多肽 ) 的作用的各种因素来确定。所述各种因素包括， 但不限于， 患者的红细胞计数， 血红 蛋白水平或其它诊断评估， 所需的目标红细胞计数， 患者的年龄、 性别和饮食， 可导致红细 胞水平降低的任意疾病的严重性、 施用时间以及其它临床因素。向最终组合物中添加其它 已知的生长因子也可能影响剂量。可通过周期性评估红细胞和血红蛋白水平， 以及评估网 织红细胞水平和其它的造血过程指示剂来监测进展。
在某些实施方式中， 本发明还提供了用于体内生成 GDF 捕获物多肽的基因治疗。 该种治疗可通过将 GDF 捕获物多核苷酸序列导入具有上述列举的病症的细胞或组织实现 其疗效。可采用重组表达载体 ( 例如嵌合病毒或胶体分散系统 ) 实现 GDF 捕获物多核苷酸 序列的送递。优选使用靶向的脂质体进行 GDF 捕获物多核苷酸序列的治疗性送递。
本文教导的可用于基因治疗的各种病毒载体包括腺病毒、 疱疹病毒、 痘苗病毒或 RNA 病毒如逆转录病毒。该逆转录病毒载体可以是鼠或禽类逆转录病毒的衍生物。可插入单个外源基因的逆转录病毒载体的实例包括， 但不限于 ： 莫洛尼鼠氏白血病毒 (MoMuLV)、 Harvey 鼠肉瘤病毒 (HaMuSV)、 鼠乳腺肿瘤病毒 (MuMTV) 以及劳斯肉瘤病毒 (RSV)。许多其 它的逆转录病毒载体可掺入多种基因。所有这些载体可转移或掺入选择标记基因， 从而可 鉴别和生成转导的细胞。 逆转录病毒载体可通过连接例如糖、 糖脂或蛋白而具有靶特异性。 优选通过使用抗体实现靶向作用。本领域技术人员将认识到， 特定的多核苷酸序列可被插 入逆转录病毒基因组或连接至病毒包膜， 以允许包含 GDF 捕获物多核苷酸的逆转录病毒载 体的靶特异性送递。
或者， 可采用编码逆转录病毒结构基因 gag、 pol 和 env 的质粒通过传统的磷酸钙 转染直接转染组织培养细胞。然后用含有感兴趣的基因的载体质粒转染这些细胞。所得的 细胞将逆转录病毒载体释放进入培养基。
GDF 捕获物多核苷酸的另一靶向送递系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括大 分子复合物、 纳米胶囊、 微球体、 珠以及基于脂质的系统 ( 包括水包油乳状液、 胶束、 混合胶 束以及脂质体 )。本发明优选的胶体系统为脂质体。脂质体是可在体外和体内用作送递载 体的人工膜泡。 RNA、 DNA 和完整的病毒体可被包封在水相内部， 并以生物活性形式送递至细 胞 ( 例如， 参见 Fraley 等人， Trends Biochem. Sci.， 6:77， 1981)。使用脂质体载体有效转 移基因的方法已为本领域所知， 例如， 参见 Mannino 等人， Biotechniques， 6:682， 1988。脂 质体的组成通常为磷脂的组合， 并常与类固醇、 特别是胆固醇联用。 也可使用其它的磷脂或 其它的脂质。脂质体的物理特征依赖于 pH、 离子强度以及二价阳离子的存在。
用于产生脂质体的脂质的例子包括磷脂酰基化合物， 如磷脂酰甘油、 磷脂酰胆碱、 磷脂酰丝氨酸、 磷脂酰乙醇胺、 鞘脂、 脑苷脂以及神经节苷脂。例示性的磷脂包括卵磷脂酰 胆碱、 二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。 脂质体的靶向也可能基于， 例如器官特 异性、 细胞特异性和细胞器特异性， 并且在本领域内是已知的。 实施例 以上对本发明进行了一般描述， 参考以下的实施例将更容易理解本发明， 实施例 仅仅是为了举例说明本发明的某些实施方案和实施方案， 并不意欲限制本发明。
实施例 1 ：GDF 捕获物的产生 申请人如下构建 GDF 捕获物。将具有修饰的 ActRIIB 胞外域 ( 其具有相对于 GDF11 和 / 或筒箭毒碱大大降低的激活素 A 结合 ( 作为 SEQ ID NO: 1 中位置 79 的亮氨酸 - 至 - 天 冬氨酸取代的后果 ) ) 的多肽与人或小鼠 Fc 结构域融合， 其间带有最小接头 (3 个甘氨酸氨 基酸 )。该构建体分别称为 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 和 ActRIIB(L79D 20-134)-mFc。 类似地实施在位置 79 带有谷氨酸而不是天冬氨酸的可选形式 (L79E)。也产生相对于下文 的 SEQ ID NO: 7 在位置 226 带有丙氨酸而不是缬氨酸的可选形式并在测试的各方面等价 实施。位置 79( 相对于 SEQ ID NO: 1， 或相对于 SEQ ID NO: 7 的位置 60) 的天冬氨酸在 下文以灰色突出显示。相对于 SEQ ID NO: 7 在位置 226 的缬氨酸也在下文以灰色突出显 示。
GDF 捕获物 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 在下文显示为从 CHO 细胞系纯化 (SEQ ID NO: 7)。
GDF 捕获物的 ActRIIB- 衍生的部分具有下文示出的氨基酸序列 (SEQ ID NO: 32)， 并且该部分会用作单体， 或用作作为单体、 二聚体或更高级复合体的非 -Fc 融合蛋白。
GDF 捕获物蛋白质在 CHO 细胞系中表达。考虑 3 个不同的前导序列 ： 组 织 纤 溶 酶 原 激 活 剂 ( T P A ) ：(i) 蜜蜂蜂毒素 (HBML) ： ( i i )(iii) 天然的 ：
。选择的形式利用 TPA 前导序列并具有下列未加工氨基酸序列 ：该多肽由下列核酸序列 (SEQ ID NO:12) 编码 ：纯化可通过一系列柱色谱步骤， 包括例如下列中的 3 个或更多以任何顺序实现 ： 蛋白 质 A 色谱、 Q 琼脂糖色谱、 苯基琼脂糖色谱、 尺寸排阻色谱和阳离子交换色谱。纯化可以用 病毒过滤和缓冲液交换完成。 在纯化方案的一个实例中， 使细胞培养基通过蛋白质 A 柱， 在 150 mM Tris/NaCl (pH 8.0) 中洗涤， 然后在 50 mM Tris/NaCl (pH 8.0) 中洗涤并用 0.1 M 甘氨酸 pH 3.0 洗脱。将低 pH 洗脱物保持在室温 30 分钟， 作为病毒清除步骤。然后使洗 脱物中和并通过 Q 琼脂糖离子交换柱并在 50 mM Tris pH 8.0、 50 mM NaCl 中洗涤， 并在 50 mM Tris pH 8.0( 带有 150 mM 至 300 mM 的 NaCl 浓度 ) 中洗脱。然后将洗脱物变更到 50 mM Tris pH 8.0、 1.1 M 硫酸铵中并通过苯基琼脂糖柱、 洗涤并在 50 mM Tris pH 8.0( 带 有 150 mM 至 300 mM 的硫酸铵 ) 中洗脱。将洗脱物透析并过滤进行应用。
额外的 GDF 捕获物 ( 修饰的 ActRIIB-Fc 融合蛋白从而降低激活素 A 结合相对于 筒箭毒碱或 GDF11 的比 ) 描述于 PCT/US2008/001506 和 WO 2006/012627 中， 其并入本文作 为参考。
实施例 2. 对于 GDF-11 和激活素 - 介导的信号传导的生物分析。
应用 A-204 报道基因分析来评价 ActRIIB-Fc 蛋白质和 GDF 捕获物对通过 GDF-11 和 激 活 素 A 的 信 号 传 导 的 作 用。 细 胞 系 ： 人 横 纹 肌 肉 瘤 ( 衍 生 自 肌 肉 )。 报 道 载 体 ： pGL3(CAGA)12 ( 描述于 Dennler 等人 , 1998, EMBO 17: 3091-3100)。 CAGA12 基序存在于 TGF-Β 反应性基因 ( PAI-1 基因 ) 中， 因此这一载体通常用于通过 Smad2 和 3 发信号的因 子。
第1日： 将 A-204 细胞分到 48- 孔板中。
第2日： 将 A-204 细胞用 10 ug pGL3(CAGA)12 或 pGL3(CAGA)12(10 ug)+ pRLCMV (1 ug) 和 Fugene 转染。
第3日： 加入因子 ( 稀释到培养基 + 0.1 % BSA 中 )。抑制剂需要在加入细胞前 与因子预温育 1 小时。6 小时后， 将细胞用 PBS 漂洗并裂解细胞。
随后进行萤光素酶分析。在不存在任何抑制剂的情况下， 激活素 A 显示报道基因 表达的 10 倍刺激和 ED50 ~ 2 ng/ml。GDF-11 ： 16 倍刺激， ED50 ： ~ 1.5 ng/ml。
ActRIIB(20-134) 是该分析中激活素、 GDF-8 和 GDF-11 活性的有效抑制剂。也在 该分析中测试变体。实施例 3. 通过 N- 末端和 C- 末端截短的 GDF-11 抑制 产生带有 N- 末端和 / 或 C- 末端截短的 ActRIIB(20-134)-hFc 变体并测试其作为 GDF-11 和激活素的抑制剂的活性。活性在下文示出 ( 如在条件培养基中测量的 ) ： C- 末端 ActRIIB-hFc 截短 ：可见， C- 末端 3 个 ( 以… PPT 终止 )、 6 个 ( 以 … YEP 终止 ) 或更多个氨基酸的 截短引起分子活性 3 倍或更高的降低。 ActRIIB 部分的最后 15 个氨基酸的截短引起活性的 更多丢失 ( 参见 WO2006/012627)。
氨基末端截短在 ActRIIB(20-131)-hFc 蛋白质的背景中作出。活性在下文示出 ( 如在条件培养基中测量的 ) ： N- 末端 ActRIIB-hFc 截短 ：
相应地， 2 个、 3 个或 4 个氨基酸从 N- 末端的截短引起比带有全长胞外域的形式 更具活性蛋白质的产生。另外的实验显示， 5 个氨基酸的截短 ActRIIB(25-131)-hFc 与未 截短形式具有等价的活性， 并且在 N- 末端的额外缺失持续降低蛋白质的活性。因此， 最 佳的构建体会具有在 SEQ ID NO: 1 的氨基酸 133-134 之间终止的 C- 末端和在 SEQ ID NO: 1 的氨基酸 22-24 起始的 N- 末端。相应于氨基酸 21 或 25 的 N- 末端会产生类似于 ActRIIB(20-134)-hFc 构建体的活性。 这些截短可也在 GDF 捕获物的上下文中应用， 如 L79D 或 L79E 变体。
实施例 4. ActRIIB-Fc 变体， 基于细胞的活性。
在基于细胞的分析中测试 ActRIIB-Fc 蛋白质和 GDF 捕获物的活性， 如上述。结果 在下表中概述。一些变体在不同的 C- 末端截短构建体中进行测试。如上文论述， 5 或 15 个 氨基酸的截短引起活性降低。GDF 捕获物 (L79D 和 L79E 变体 ) 显示激活素结合的实质丢 失， 同时保持几乎 GDF-11 的野生型抑制。
与 GDF11 和激活素 A 的可溶性 ActRIIB-Fc 结合 ：
+ 活性差 ( 大致 1×10-6 KI) ++ 中等活性 ( 大致 1×10-7 KI) +++ ( 野生型 ) 活性良好 ( 大致 1×10-8 KI) ++++ 高于野生型活性。
已评估几种变体在大鼠中的血清半衰期。ActRIIB(20-134)-Fc 具有大约 70 小时 的血清半衰期。ActRIIB(A24N 20-134)-Fc 具有大约 100-150 小时的血清半衰期。A24N 变 体在基于细胞的分析 ( 上述 ) 和体内分析 ( 下文 ) 中具有等价于野生型分子的活性。结合 较长半衰期， 这意味着随着时间的过去 A24N 变体将产生比野生型分子更大的每单位蛋白 质的作用。 A24N 变体和上文测试的任何其它变体可与 GDF 捕获物分子结合， 如 L79D 或 L79E 变体。
实施例 5. GDF-11 和激活素 A 结合。
在 BiaCoreTM 分析中测试某些 ActRIIB-Fc 蛋白质和 GDF 捕获物与配体的结合。
应用抗 -hFc 抗体将 ActRIIB-Fc 变体或野生型蛋白质捕获在系统中。将配体注射 和流动在捕获的受体蛋白质上。结果在下文的表中概述。
配体结合特异性 IIB 变体。这 些 数 据 证 明 基 于 细 胞 分 析 数 据 表 明， A24N 变 体 保 持 类 似 于 ActRIIB(20-134)-hFc 分子的配体 - 结合活性， 并且 L79D 或 L79E 分子保持筒箭毒碱和 GDF11 结合但显示明显降低 ( 不可计量 ) 的与激活素 A 的结合。
已产生和测试其它变体， 如 WO2006/012627( 整体并入本文作为参考 ) 中报告的， 参见例如第 59-60 页， 其应用偶联于该装置的配体和在偶联配体上的流动受体。显著地， K74Y、 K74F、 K74I( 和大概在 K74 的其它疏水性取代， 如 K74L) 和 D80I 引起激活素 A 结合与 GDF11 结合的比相对于野生型 K74 分子降低。关于这些变体的数据表在下文重现 ： 对 GDF11 和激活素 A 的可溶性 ActRIIB-Fc 变体结合 (BiaCore 分析 )
* 没有观察的结合 -- < 1/5 WT 结合 ~ 1/2 WT 结合 + WT ++ < 2× 增加的结合 +++ ~5× 增加的结合 ++++ ~10× 增加的结合 +++++ ~ 40× 增加的结合。
实施例 6. ActRIIB-hFc 刺激非人灵长动物中的红细胞生成 将 ActRIIB(20-134)-hFc (IgG1) 对雄性和雌性食蟹猴通过皮下注射每周 1 次施用 1 个 月。将 48 只食蟹猴 (24/ 性别 ) 指定到 4 个治疗组中的 1 个中 (6 只动物 / 性别 / 组 ) 并皮 下注射施用载体或 3、 10 或 30 mg/kg 的 ActRIIB-hFc， 每周 1 次， 进行 4 周 ( 总共 5 个剂量 )。 评价的参数包括一般临床病理学 ( 血液学、 临床化学、 凝血和验尿 )。 至 15 天， ActRIIB-hFc 在治疗动物中引起统计学显著提高的平均绝对网织红细胞值。至 36 天， ActRIIB-hFc 引起 几种血液学变化， 包括提高的平均绝对网织红细胞和红细胞分布宽度值和较低的平均微粒 血红蛋白浓度。所有治疗组和两种性别都受影响。这些效果与 ActRIIB-hFc 对不成熟网织红细胞从骨髓释放的正面作用一致。 这一效果在药物从治疗动物洗出后逆转 ( 至研究第 56 天 )。相应地， 我们推断 ActRIIB-hFc 刺激红细胞生成。
实施例 7. ActRIIB-mFc 通过刺激脾红细胞生成活性促进小鼠中的红细胞生成 方面 在本研究中， 分析体内施用 ActRIIB(20-134)-mFc 对骨髓和脾中造血祖先的频率的作 用。一组 C57BL/6 小鼠注射以 PBS 作为对照并且第二组小鼠施用两个剂量的 10 mg/kg 的 ActRIIB-mFc， 并且两组都在 8 天后处死。应用外周血进行全血计数， 并应用股骨和脾进行 体外产克隆分析来评价每一器官中的淋巴、 红细胞和骨髓祖细胞含量。在本研究的短时间 框架中， 没有见到治疗小鼠中红细胞、 血红蛋白或白细胞水平的显著变化。在股骨中， 在对 照和治疗组之间没有有核细胞数目或祖先含量的差异。在脾中， 化合物治疗组经历成熟红 细胞祖先 (CFU-E) 集落数目 / 皿、 频率和总祖先数目 / 脾的统计学显著增加。此外， 在骨髓 数目 (CFU-GM)、 不成熟红细胞 (BFU-E) 和总祖先数目 / 脾中见到增加。
动物 ： 将 16 只 6-8 周龄的 C57BL/6 雌性小鼠用于研究中。以 10 mg/kg 的剂量在第 1 和 3 天 给 8 只小鼠皮下注射测试化合物 ActRIIB-mFc， 并且以每只小鼠 100 μL 的体积给 8 只小鼠 皮下注射载体对照磷酸缓冲盐水 (PBS)。第一次注射后 8 天根据相关动物管理指南处死所 有小鼠。通过心脏穿刺收集来自个体动物的外周血 (PB) 样品， 并且将其用于全血计数和分 类计数 (CBC/Diff)。从每只小鼠收获股骨和脾。
进行的测试 ： CBC/Diff 计数 通过心脏穿刺收集来自每只小鼠的 PB， 并且放置在合适的微量采血管 (microtainer) 中。将样品送到 CLV， 用于在 CellDyn 3500 计数器上进行分析。
产克隆测定 用下文描述的体外基于甲基纤维素的培养基系统评估骨髓、 红细胞和淋巴系的产克隆 祖先。
成熟的红细胞祖先 在 MethoCultTM 3334， 即一种含有重组人 (rh) 促红细胞生成素 (3 U/mL) 的基于甲基 纤维素的培养基中培养成熟的红细胞 (CFU-E) 系的产克隆祖先。
淋巴祖先 在 MethoCult® 3630， 即一种含 rh 白介素 7 (10 ng/mL) 的基于甲基纤维素的培养基中 培养淋巴 (CFU-pre-B) 系的产克隆祖先。
骨髓和未成熟红细胞祖先 在 MethoCultTM 3434， 即一种含重组鼠 (rm) 干细胞因子 (50 ng/mL)、 rh 白介素 6 (10 ng/mL)、 rm 白介素 3 (10 ng/mL) 和 rh 促红细胞生成素 (3 U/mL) 的基于甲基纤维素的培 养基中培养粒细胞 - 单核细胞 (CFU-GM)、 红细胞 (BFU-E) 和多能细胞 (CFU-GEMM) 系的产克 隆祖先。
方法 ： 通过标准方案处理小鼠股骨和脾。 简言之， 通过使用 21 号针头和 1 cc 注射器， 用含 2% 胎牛血清 (IMDM 2% FBS) 的 Iscove 改良的 Dulbecco 培养基冲洗股骨腔， 获得骨髓。通过70 μM 过滤器挤压脾并用 IMDM 2% FBS 冲洗过滤器， 获得脾细胞。 然后用 Neubauer 计数室 在单细胞悬浮液上进行 3% 冰醋酸中的有核细胞计数， 从而可以计算每个器官的总细胞。为 了除去污染红细胞， 随后用 3 倍体积的氯化铵裂解缓冲液稀释总脾细胞， 并在冰上温育 10 分钟。然后洗涤细胞并且将其重悬于 IMDM 2% FBS 中， 进行第二次细胞计数， 以确定裂解后 的细胞的细胞浓度。
制备细胞原液， 并添加到每个基于甲基纤维素的培养基制剂中， 以获得每个培 养基制剂中每种组织的最优铺板浓度。将骨髓细胞以每个培养皿 1×105 个细胞铺板 到 MethoCultTM 3334 中， 以 评 估 成 熟 的 红 细 胞 祖 先， 以 每 个 培 养 皿 2×105 个 细 胞 铺 板到 MethoCultTM 3630 中， 以评估淋巴祖先， 并且以每个培养皿 3×104 个细胞铺板到 MethoCultTM 3434 中， 以评估未成熟的红细胞和骨髓祖先。将脾细胞以每个培养皿 4×105 个细胞铺板到 MethoCultTM 3334 中， 以评估成熟的红细胞祖先， 以每个培养皿 4×105 个细 胞铺板到 MethoCultTM 3630 中， 以评估淋巴细胞祖先， 并且以每个培养皿 2×105 个细胞铺 板到 MethoCultTM 3434 中， 以评估未成熟的红细胞和骨髓祖先。铺板到三个重复培养皿的 培养物在 37℃、 5% CO2 中温育， 直到由受过训练的人进行集落计数和评价。将成熟的红细 胞祖先培养 2 天， 将淋巴祖先培养 7 天， 并将成熟的红细胞和骨髓祖先培养 12 天。
分析 对于产克隆测定的三次重复培养物， 并且对于对照和治疗组对所有数据集计算平均值 +/-1 个标准差。
如下计算每个组织中的集落形成细胞 (CFC) 的频率 ： 每个培养皿铺板的细胞 每个培养皿评分的平均 CFC 每个股骨或脾的总 CFC 如下计算 ： 评分的总 CFC× 每个股骨或脾的有核细胞计数 (RBC 裂解后 ) 培养的有核细胞数 进行标准 t 检验， 用于评估在 PBC 对照小鼠和化合物治疗小鼠之间细胞或造血祖先的 平均数是否有差异。由于集落计数可能具有主观性， 小于 0.01 的 p 值认为是显著的。每组 的平均值 (+/- SD) 示于下表。
表： 血液学参数
表 : 来自股骨和脾的 CFC初步分析表明 p < 0.005。
用 ActRIIB(20-134)-mFc 治疗小鼠在本研究的短时间框架内不导致红细胞或血 红蛋白含量的显著增加。但是， 对祖细胞含量的作用是显著的。在股骨中， 在对照和治 疗组之间有核细胞数目或祖细胞含量方面没有差异。在脾中， 化合物治疗组在红细胞裂 解前的有核细胞数目和每个培养皿的成熟红细胞祖先 (CFU-E) 集落数目、 每个脾的频率 和总祖先数方面经历了统计学显著的增加。此外， 在每个脾的骨髓祖先 (CFU-GM)、 不成 熟红细胞祖先 (BFU-E) 和总祖先数目方面观察到了增加。相应地， 期望经过更长时期， ActRIIB(20-134)-mFc 治疗可导致提高的红细胞和血红蛋白含量。
实施例 8 ： GDF 捕获物在体内增加红细胞水平 将 12 周大的雄性 C57BL/6NTac 小鼠指定到 2 个治疗组中的 1 个中 (N=10)。 通过皮下注 射 (SC) 以 10 mg/kg 对小鼠给予载体或变体 ActRIIB 多肽 ( “GDF 捕获物” ) [ActRIIB(L79D 20-134)-hFc]， 每周 2 次， 进行 4 周。在研究停止时， 通过心脏穿刺收集全血到含 EDTA 管中 并应用 HM2 血液学分析仪 (Abaxis, Inc) 分析细胞分布。
组指定*与载体对照相比， 用 GDF 捕获物治疗对白细胞 (WBC) 数目不具有统计学显著效果。 与对照相比， 红细胞 (RBC) 数目在治疗组中增加 ( 参见下表 )。血红蛋白含量 (HGB) 和血细 胞比容 (HCT) 也都由于额外的红细胞而增加。红细胞的平均宽度 (RDWc) 在治疗动物中较 高， 表明 不成熟红细胞群增加。因此， 用 GDF 捕获物治疗导致红细胞增加， 没有对白细胞群 的可识别效果。
血液学结果
*=p<0.05, **= p<0.01。
实施例 9: GDF 捕获物对于体内增加红细胞水平优于 ActRIIB-Fc 将 19 周龄的雄性 C57BL/6NTac 小鼠随机指定到 3 个组中的一个中。小鼠通过皮下 注射给予载体 (10 mM Tris 缓冲盐水， TBS)、 野生型 ActRIIB(20-134)-mFc 或 GDF 捕获物 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc， 每周 2 次， 进行 3 周。在基线和给药 3 周后颊部放血收集血液 并应用血液学分析仪 (HM2, Abaxis, Inc.) 分析细胞分布。
与载体对照相比， 用 ActRIIB-Fc 或 GDF 捕获物治疗不具有对白细胞 (WBC) 数目的 显著效果。与对照或野生型构建体相比， 红细胞计数 (RBC)、 血细胞比容 (HCT) 和血红蛋白 水平在 GDF 捕获物治疗小鼠中都提高 ( 参见下表 )。因此， 在直接比较中， GDF 捕获物促进 红细胞增加至比野生型 ActRIIB-Fc 蛋白质显著更高的程度。事实上， 在本实验中， 野生型 ActRIIB-Fc 蛋白质不引起红细胞的统计学显著增加， 表明较长或较高剂量对于展现该效果是需要的。
3 周给药后的血液学结果**=p<0.01。
实施例 10. 带有截短的 ActRIIB 胞外域的 GDF 捕获物的产生 如实施例 1 中描述的， 称为 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 的 GDF 捕获物这样产生 ： 通过 TPA 前导序列与含有亮氨酸 - 至 - 天冬氨酸取代 ( 在 SEQ ID NO: 1 中的残基 79) 的 ActRIIB 胞外域 (SEQ ID NO: 1 中的残基 20-134) 的 N- 末端融合以及人 Fc 结构域与最小接头 (3 个甘氨酸残基 ) 的 C- 末端融合 ( 图 3)。相应于该融合蛋白的核苷酸序列在图 4 中示出。
称为 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 的带有截短的 ActRIIB 胞外域的 GDF 捕获物这 样产生 ： 通过 TPA 前导序列与含有亮氨酸 - 至 - 天冬氨酸取代 ( 在 SEQ ID NO: 1 中残基 79) 的截短的胞外域 (SEQ ID NO: 1 中的残基 25-131) 的 N- 末端融合以及人 Fc 结构域与 最小接头 (3 个甘氨酸残基 ) 的 C- 末端融合 ( 图 5)。相应于该融合蛋白的核苷酸序列在图 6 中示出。
实施例 11. 通过带有双截短的 ActRIIB 胞外域的 GDF 捕获物的选择性配体结合 用 Biacore ™仪器在体外评价 GDF 捕获物和其它 ActRIIB-hFc 蛋白质对几种配体的亲 和力。 结果在下面的表中概述。 Kd 值通过归于复合体的非常快的缔合和解离的稳态亲和力 拟合获得， 其防止 k 结合和 k 解离的准确确定。
ActRIIB-hFc 变体的配体选择性 ：与缺乏 L79D 取代的 ActRIIB-hFc 配对物相比， 带有截短的胞外域的 GDF 捕获物 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 等于或胜过更长变体 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 展示的配体 选择性， 激活素 A 和激活素 B 结合明显丢失并且几乎完全保留 GDF11 结合。注意单独的截 短 ( 没有 L79D 取代 ) 不改变此处展示的配体间的选择性 [ 比较 ActRIIB(L79 25-131)-hFc 与 ActRIIB(L79 20-134)-hFc]。
实施例 12. 带有替代核苷酸序列的 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 的产生 为了产生 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc， 将在天然位置 79 (SEQ ID NO: 1) 带有天冬氨 酸取代和带有 N- 末端和 C- 末端截短 (SEQ ID NO: 1 中的残基 25-131) 的人 ActRIIB 胞外 域在 N- 末端与 TPA 前导序列而不是天然 ActRIIB 前导序列和在 C- 末端与人 Fc 结构域通过 最小接头 (3 个甘氨酸的残基 ) 融合 ( 图 5)。编码该融合蛋白的一个核苷酸序列在图 6 中 示出 (SEQ ID NO: 27)， 并且编码完全相同融合蛋白的可选核苷酸序列在图 9 中示出 (SEQ
ID NO: 30)。该蛋白质应用实施例 1 中描述的方法学表达和纯化。
实施例 13. 带有截短的 ActRIIB 胞外域的 GDF 捕获物增加小鼠中红细胞祖先的 增殖 评价 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 来确定其对红细胞祖先增殖的效果。 将雄性 C57BL/6 小鼠 (8 周龄 ) 用 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (10 mg/kg， 皮下 ； n = 6) 或载体 (TBS; n = 6) 在第 1 和 4 天治疗， 然后在第 8 天安乐死， 以收集脾、 胫骨、 股骨和血液。分离脾和骨髓 的细胞， 在含有 5% 胎牛血清的 Iscove 改良的 Dulbecco 培养基中稀释， 在专门的甲基纤维 素基培养基中悬浮， 并培养 2 或 12 天以评估在集落形成单位 - 红细胞 (CFU-E) 和爆发形成 单位 - 红细胞 (BFU-E) 期分别产克隆祖先的水平。用于 BFU-E 确定的甲基纤维素基培养基 (MethoCult M3434, Stem Cell Technologies) 包括重组鼠干细胞因子、 白介素 -3 和白介 素 -6， 其在用于 CFU-E 确定的甲基纤维素培养基中不存在 (MethoCult M3334, Stem Cell Technologies)， 同时两种培养基都含有促红细胞生成素等其它成分。对于 BFU-E 和 CFU-E 二者， 克隆数目在衍生自各组织样品的两个培养板中确定， 并且结果的统计学分析基于小 鼠数目 / 治疗组。
来自用 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 治疗的小鼠的脾 - 衍生的培养物具有的 CFU-E 克隆数目是来自对照小鼠的相应培养物的 2 倍 (P < 0.05)， 而 BFU-E 克隆数目不显著不同 于体内治疗。 来自骨髓培养物的 CFU-E 或 BFU-E 克隆数目也不显著不同于治疗。 如期望的， 相比对照， 在用 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 治疗的小鼠中， 在安乐死下， 在脾 - 衍生的培养 物中增加的 CFU-E 克隆数目伴随红细胞水平 (11.6% 增加 )、 血红蛋白浓度 (12% 增加 ) 和血 细胞比容水平 (11.6% 增加 ) 的显著 (P < 0.001) 变化。这些结果表明， 体内施用带有截短 的 ActRIIB 胞外域的 GDF 捕获物可以刺激红细胞祖先增殖， 作为其增加红细胞水平的总体 效果的一部分。
实施例 14. 带有截短的 ActRIIB 胞外域的 GDF 捕获物抵销小鼠中化学治疗 - 诱 导的贫血 申请人研究了在基于紫杉醇的化学治疗 - 诱导的小鼠模型贫血中 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 对红细胞生成参数的作用， 其通过阻断微管聚合抑制细胞分裂。将雄性 C57BL/6 小鼠 (8 周龄 ) 指定到 4 个治疗中的 1 个中 ： 1) 紫杉醇 (25 mg/kg， 腹膜内 ) 2) ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (10 mg/kg， 腹膜内 ) 3) 紫杉醇 + ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 4) 载体 (TBS)。
紫杉醇在第 0 天施用， 而 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 或载体在第 0 和 3 天施用。 从单独的群在第 1、 3 和 5 天收集血样进行 CBC 分析， 对于治疗组 1-3 的结果 ( 上述 ) 表示 为在给定时间点与载体的差异百分数。归于紫杉醇毒性的损耗是仅紫杉醇组在第 3 天 ( 其 中 n = 1) 的问题， 否则 n = 3-5/ 治疗 / 时间点。与载体相比， 单独的紫杉醇在第 5 天降低 血红蛋白浓度几乎 13%， 而添加 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 防止这一紫杉醇 - 诱导的下降 ( 图 11)。类似的效果对于血细胞比容和 RBC 水平见到。在紫杉醇不存在的情况下， 与载体 相比在第 3 和 5 天 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 增加血红蛋白浓度 10%( 图 11)。因此， 带有 截短的 ActRIIB 胞外域的 GDF 捕获物可以增加红细胞水平， 其足以抵销化学治疗 - 诱导的贫血。
实施例 15.带有截短的 ActRIIB 胞外域的 GDF 捕获物逆转小鼠中肾切除术诱导的贫血 申请人研究了慢性肾疾病的肾切除小鼠模型中 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 对贫血的 作用。雄性 C57BL/6 小鼠 (11 周龄 ) 经历假手术或单侧肾切除术以降低促红细胞生成素产 生的能力。 使小鼠进行 1 周术后恢复， 并然后用 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (10 mg/kg， 腹 膜内 ； n = 15/ 状况 ) 或载体 (TBS; n = 15/ 状况 ) 每周治疗 2 次周， 总共 4 周。给药开始 前和治疗 4 周后收集血样。尽管载体处理的肾切除术小鼠经过 4- 周治疗期展示红细胞数 目的显著下降， 用 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 治疗不仅防止该下降， 而且增加红细胞水平 高于基线 17% (P < 0.001)( 图 12)， 尽管肾脏促红细胞生成素产生能力降低。在肾切除的 小鼠中， ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 也产生血红蛋白浓度和血细胞比容水平从基线的显著 增加， 并且在肾切除状况下显著刺激这些红细胞生成参数的每一个至与假手术状况大约相 同的程度 ( 图 13)。因此， 带有截短的 ActRIIB 胞外域的 GDF 捕获物可以增加红细胞水平， 其足以逆转慢性肾脏疾病模型中的贫血。
实施例 16. 带有截短的 ActRIIB 胞外域的 GDF 捕获物改进大鼠中从失血诱导的 贫血的恢复 申请人研究了在急性失血诱导的大鼠贫血 ( 急性出血后贫血 ) 模型中 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 对红细胞生成参数的作用。雄性 Sprague-Dawley 大鼠 ( 大约 300 g) 在卖主 (Harlan) 处接受长期颈导管 (jugular catheter)。在第 -1 天， 经过 5- 分钟时期通过导管 在异氟烷麻醉下将 20% 的总血液容量从每一大鼠抽出。去除的血量基于根据下列关联计算 的总血量的值， 所述关联来自 Lee 和同事 (J Nucl Med 25:72-76, 1985)， 用于体重大于 120 g 的大鼠 ： 总血量 (ml) = 0.062 × 体重 (g) + 0.0012。
在 取 血 时 间 通 过 导 管 置 换 等 量 的 磷 酸 缓 冲 盐 水。 大 鼠 用 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (10 mg/kg， 皮下 ； n = 5) 或载体 (TBS; n = 5) 在第 0 和 3 天治疗。用于 CBC 分析的血样通过导管在第 -1( 基线 )、 0、 2、 4 和 6 天去除。
对照大鼠响应于 20% 失血， 红细胞水平至第 0 天下降将近 15%。这些水平在第 2 和 4 天保持显著低于基线， 并且至第 6 天未完全恢复 ( 图 14)。尽管用 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 治疗的大鼠在 20% 失血后显示几乎相同的红细胞水平降低， 这些大鼠然后至 第 2 天展示这些水平的完全恢复， 随后在第 4 和 6 天进一步提高， 这代表在相应时间点相对 于对照水平高度显著的改进 ( 图 14)。类似的结果对于血红蛋白浓度获得。这些发现说明， 带有截短的 ActRIIB 胞外域的 GDF 捕获物可以产生红细胞水平从急性出血引起的贫血的 较快恢复。
实施例 17. 带有截短的 ActRIIB 细胞外域的 GDF 捕获物增加非人灵长动物中的 红细胞水平 评 价 在 食 蟹 猴 中 两 个 GDF 捕 获 物 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 和 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 刺激红细胞产生的能力。猴用 GDF 捕获物 (10 mg/kg; n = 4 雄性 /4 雌性 ) 或载体 (n = 2 雄性 /2 雌性 ) 在第 1 和 8 天皮下治疗。在第 1( 治疗前基线 )、 3、 8、 15、 29 和 44 天收集血样， 并分析红细胞水平 ( 图 15)、 血细胞比容 ( 图 16)、 血红蛋白水平 ( 图 17)和网织红细胞水平 ( 图 18)。载体治疗猴在所有治疗后时间点显示降低水平的红细胞、 血 细胞比容和血红蛋白， 重复采血的期望效果。与之相比， 用 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 或 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 治疗至第一治疗后时间点 ( 第 3 天 ) 增加这些参数并在研究持 续时间将其维持在实质上提高的水平 ( 图 15-17)。 重要的是， 与载体相比， 用 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 或 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 治疗的猴中的网织红细胞水平在第 8、 15 和 29 天实质上增加 ( 图 18)。这一结果说明， GDF 捕获物治疗增加红细胞前体产生， 导致提高的 红细胞水平。
总之， 这些数据说明截短的 GDF 捕获物以及全长变体可以用作 GDF11 的选择性拮 抗剂和潜在相关的配体以增加体内红细胞形成。
实施例 18. 衍生自 ActRIIB5 的 GDF 捕获物 其它人报告了替代的可溶形式的 ActRIIB( 指定为 ActRIIB5)， 其中外显子 4， 包括 ActRIIB 跨膜结构域， 已由不同的 C- 末端序列替换 (WO2007/053775)。
不含其前导序列的天然人 ActRIIB5 的序列如下 ：亮氨酸 - 至 - 天冬氨酸取代或其它酸性取代可在所述天然位置 79 进行 ( 下划线和以 灰色突出显示 ) 以构建变体 ActRIIB5(L79D)， 其具有下列序列 ：该变体可用 TGGG 接头与人 Fc 连接以产生具有下列序列的人 ActRIIB5(L79D)-hFc 融 合蛋白 ：该构建体可在 CHO 细胞中表达。
实施例 19. 用 EPO 和带有截短的 ActRIIB 胞外域的 GDF 捕获物的联合治疗在小 鼠中的作用 EPO 通 过 增 加 红 细 胞 前 体 增 殖 诱 导 红 细 胞 形 成， 而 GDF 捕 获 物 可 以 补 充 或 增 强 EPO 的效果的方式潜在地影响红细胞形成。因此， 申请人研究用 EPO 和 ActRIIB(L79D25-131)-hFc 联 合 治 疗 对 红 细 胞 生 成 参 数 的 作 用。 雄 性 C57BL/6 小 鼠 (9 周 龄 ) 给 予 单 次 腹 膜 内 注 射 单 独 的 重 组 人 EPO( 依 伯 汀 α， 1800 单 位 /kg)、 单 独 的 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc(10 mg/kg)、 EPO 和 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc、 或载体 (Tris- 缓冲盐水 )。 给药后 72 h 对小鼠安乐死来收集血液、 脾和股骨。
处理脾和股骨以获得红细胞前体细胞进行流式细胞术分析， 去除后， 将脾在含有 5% 胎牛血清的 Iscove 改良的 Dulbecco 培养基中切碎并通过用来自无菌 1-mL 注射器的活 塞挤过 70-µm 细胞滤网机械离解。对股骨清除任何残留肌肉或结缔组织并修剪末端， 以允 许通过经与 3-mL 注射器连接的 21 号针用含有 5% 胎牛血清的 Iscove 改良的 Dulbecco 培 养基冲洗残留的骨干收集骨髓。将细胞悬液离心 (2000 rpm， 10 min) 并将细胞团块重悬浮 6 在含有 5% 胎牛血清的 PBS 中。将来自个组织的细胞 (10 ) 用抗 - 小鼠 IgG 温育以封闭非 特异性结合， 然后用针对小鼠细胞表面标记 CD71( 转铁蛋白受体 ) 和 Ter119( 与细胞表面 血型糖蛋白 A 结合的抗原 ) 的荧光标记抗体温育、 洗涤、 和通过流式细胞术分析。通过用 碘化丙啶复染将样品中的死细胞从分析排除。通过在分化过程中降低的 CD71 标记程度和 在起始于前成红细胞期的末端红细胞分化期间增加的 Ter119 标记程度评估脾或骨髓中的 红细胞分化 (Socolovsky 等人 , 2001, Blood 98:3261-3273; Ying 等人 , 2006, Blood 108:123-133)。因此， 应用流式细胞术确定前成红细胞 (CD71 高 Ter119 低 )、 嗜碱成红细胞 高 高 中 高 (CD71 Ter119 )、 多染色性 + 正染色成红细胞 (CD71 Ter119 ) 和晚期正染色成红细胞 + 网织红细胞 (CD71 低 Ter119 高 ) 的数目， 如所述的。
用 EPO 和 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 联合治疗引起红细胞令人惊讶地剧烈增加。 在这一实验的 72-h 时间框架中， 单独 EPO 和 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 与载体相比都不 显著增加血细胞比容， 而用两种药剂联合治疗引起血细胞比容几乎 25% 增加， 这是意料不 到地协同的， 即， 大于它们单独效果的总和 ( 图 19)。这一类型的协同作用通常考虑为证明 个别药剂通过不同细胞机制起作用。类似结果也对血红蛋白浓度 ( 图 20) 和红细胞浓度 ( 图 21) 观察到， 其各自也通过联合治疗协同增加。
红细胞前体水平的分析显示更复杂的方式。在小鼠中， 认为脾是负责诱导性 ( “应 激” ) 红细胞生成的主要的器官。脾组织在 72 h 的流式细胞计数分析显示 EPO 与载体相 比显著改变红细胞生成前体概况， 增加嗜碱成红细胞数目超过 170%， 代价是晚期前体 ( 晚 期正染色成红细胞 + 网织红细胞 )， 其降低超过三分之一 ( 图 22)。重要的是， 联合治疗 与载体相比显著增加嗜碱成红细胞， 但比单独 EPO 的程度低， 同时支持晚期前体的不减少 的成熟 ( 图 22)。因此， 用 EPO 和 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 联合治疗通过前体增殖和成 熟的平衡增强增加红细胞生成。与脾相对， 联合治疗后骨髓中的前体细胞概况不略微不同 于单独 EPO 之后的那种。 申请人根据脾前体概况预测联合治疗会引起增加的网织红细胞水 平并会伴有成熟红细胞水平的持续提高， 如果实验延长超过 72 h。
总之， 这些发现说明带有截短的 ActR IIB 胞外域的 GDF 捕获物可以与 EPO 联合施 用以协同地增加红细胞体内形成。通过补充但未限定机制的作用， GDF 捕获物可以减缓单 独 EPO 受体激活剂的强增殖效果， 并仍然允许以较低剂量的 EPO 受体激活剂获得红细胞的 靶水平， 由此避免与较高水平的 EPO 受体激活相关的潜在的副作用或其它问题。
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尽管已经讨论了主题的特定实施方式， 以上的说明书仅作阐述之用， 而不具有限 制性。在阅读本说明书和以下权利要求书后， 本发明的许多变化形式对于本领域技术人员 而言将是显而易见的。 本发明的完整范围应当参照权利要求书及其所有的等同范围以及说 明书及各种变化形式得以确定。