一种以猪胆为原料生产熊去氧胆酸的方法.pdf

本发明提供一种以新鲜猪胆汁为原料分离鹅去氧胆酸的方法，进一步，本发明提供一种以新鲜猪胆汁为原料生产熊去氧胆酸的方法。经过酸化，从猪胆中提取结合胆汁酸，除去脂肪酸和蛋白质等杂质，再经水解(皂化)、双氧水脱色，制取纯净的猪胆汁酸，溶剂浸洗提取鹅去氧胆酸，分离得到的鹅去氧胆酸经氧化、还原制得熊去氧胆酸。通过本发明的方法，改善了熊去氧胆酸的制备工艺，在简化工艺和提高产率方面都获得了积极的效果。

权利要求书
1.  一种以猪胆为原料分离鹅去氧胆酸的方法，包括对猪胆汁或提取胆红素后的猪胆汁进行酸化，获得结合胆汁酸后再进行水解皂化，制取纯净的猪胆汁酸，在室温下，用溶剂提纯鹅去氧胆酸。

2.  根据权利要求1的方法，其中，所述猪胆汁为新鲜猪胆汁，所述用溶剂提纯鹅去氧胆酸的步骤包括在室温下，用溶剂浸洗的方法分离猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸，所述溶剂选自NaOH，氨性丙酮，二氯甲烷。

3.  一种以猪胆为原料生产熊去氧胆酸的方法，包括对猪胆汁或提取胆红素后的猪胆汁进行酸化，获得结合胆汁酸后再进行水解皂化，制取纯净的猪胆汁酸，在室温下，用溶剂提纯鹅去氧胆酸，提取的鹅去氧胆酸经氧化、还原制得熊去氧胆酸。

4.  根据权利要求3的方法，其中，所述猪胆汁为新鲜猪胆汁，所述用溶剂提纯鹅去氧胆酸的步骤包括在室温下，用溶剂浸洗的方法分离猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸，所述溶剂选自NaOH水溶液，氨性丙酮，二氯甲烷。

5.  根据权利要求3或4的方法，其中，提纯的鹅去氧胆酸，用铬酸钾或铬酸钠作氧化剂，以金属钠作还原剂，在适宜反应条件下制得熊去氧胆酸。

说明书一种以猪胆为原料生产熊去氧胆酸的方法
技术领域
本发明涉及一种熊去氧胆酸的制备方法，尤其涉及一种以猪胆为原料生产熊去氧胆酸的制备方法，更具体的说，本发明通过，从而提供一种纯度高、产率大的熊去氧胆酸的制备方法。
背景技术
熊去氧胆酸(Ursodexycholic acid)简称UDCA，是熊胆的主要成分，其化学名称为(3α，7β)-二羟基-5β胆烷酸，是鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid)的7β-羟基差向异构体。自从20世纪80年代，发现熊去氧胆酸具有有效溶解胆固醇性结石作用以来，不断有新的研究显示熊去氧胆酸在利胆、护肝中具有积极的作用。近年来，国外报道了UDCA不仅对于治疗原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、慢性活动性肝炎具有良好疗效，还可用于治疗慢性肝炎和肝移植后排斥反应。目前，在临床上熊去氧胆酸主要应用于治疗各种肝胆、消化道疾病。随着分子生物学、以及熊去氧胆酸基础和临床研究的不断进步，人们发现熊去氧胆酸在促进免疫调节、治疗冠心病等方面也有积极作用。因此，随着研究的深入，熊去氧胆酸的利用价值越来越被认识和受到人们的重视，对熊去氧胆酸的需求量也在逐年升高。
但是，天然熊胆的来源日益减少，人们一直在努力寻求除以天然熊胆获取熊去氧胆酸之外的替代方法。早期，熊去氧胆酸是通过从牛、羊胆汁中分离提取的胆酸为起始原料，然后经过复杂的化学方法生产的，其中，制成鹅去氧胆酸后需经氧化还原生成熊去氧胆酸。但是，这一方法步骤多、生产时间长、成本高。上世纪80年代后，酶学、微生物发酵方法发展起来。用酶学、微生物发酵方法将鹅去氧胆酸异构化，或通过石胆酸β-羟基化生产熊去氧胆酸，但是，这种方法仍然具有步骤多、生产时间长、成本高的缺陷。
与此同时，化学合成方法也有了许多创新和改进。起始原料除胆酸外，也选用了猪胆酸，猪去氧胆酸，去氧胆酸或其它甾体化合物，如胆固醇，黄体酮和植物甾醇等生产熊去氧胆酸。但仍然是步骤更多，时间更长，成本更高，更难有生产实际意义。
例如，现有技术中报道了以雄甾烯二酮原料，经九步反应制备熊去氧胆酸的制备方法，(Helvetica.Chimica Acta.1984.67(2)612)，但其价格较贵，合成中引进侧链的难度大。而现有技术中报道的全合成方法(J.Org.Chem.1982.47(2).2331)，共有四十余步反应，工艺复杂，不易掌握。
还有报道采用4-孕甾烯-3，20-二酮(黄体酮)为起始原料，经八步反应制备熊去氧胆酸的制备方法，但是原始材料4-孕甾烯-3，20-二酮(黄体酮)本身是孕激素的药物，该起始原料的提取较为繁琐，且生产熊去氧胆酸的制备工艺也较复杂。
王钟麒等(《中国科学》辑(7)：680-6851991)报道了从猪去氧胆酸立体选择性合成熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的新法。在胆汁中，CDCA异构化生成HDCA，也许只是瞬间的过程。但用化学方法从HDCA转化成CDCA需经6-7步的化学反应。庄治平等(《有机化学》(4)：281-2851986)对′5β-a-羟基-7-羰基胆烷酸的还原反应′进行了研究。分别用NaBH4、NaBH4-NiCl、KBH4-KOH、K(S-C4H9)3BH，Al(1-Pro)3、Na-NiCl、Li-CH3OH作还原剂作了比较，收率为37-85％不等。以Li-CH3OH：为最好，熊去氧胆酸的收率75％。
现有技术中还报道了从鸡胆汁微生物转化熊去氧胆酸法生产熊去氧胆酸的方法，鸡胆汁接种产气真杆菌和大肠杆菌，pH 9.8-10.2，培养12-23小时，转化率25-45％，鸡胆汁中俄去氧胆酸含量为4-5％(鸡胆汁中总胆汁酸含量为8-9％)，转化为熊去氧胆酸的1.25-2.25％，再提取，收率为1-2％。上述方法生产熊去氧胆酸成本高、产量低，不适于生产。
1985年，发明者就提出从猪胆汁中提取分离猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸生产熊去氧胆酸是一举三得的最经济最有效的方法(《药学通报》20(11)：678-681 1985)。1987年，章公大报道了从猪胆汁中分离纯化鹅去氧胆酸的方法(《生物化学与生物物理进展》(4)：68-71 1987)，其中，在猪胆汁中直接加入NaOH进行水解，以酸化的方式得到猪胆汁酸，然后，用乙酸乙酯加活性炭脱色，分离猪去氧胆酸，再从滤液中经甲酯化、乙酰化等步骤分离鹅胆去氧胆酸，并用乙酸乙酯纯化。同年，丁新腾等报道了从猪胆汁提取鹅去氧胆酸及猪胆酸的方法(《医药工业》18(9)：4161987])，也是采用鲜新猪胆汁中直接加NaOH，酸化得到猪胆汁酸的方式，然后经甲酯化，用苯(或甲苯)加成物分离猪去氧胆酸。还有报道根据加拿大专利CA1041479，以猪胆汁和鸡胆汁作比较研究，用乙醚提取鹅去氧胆酸，猪胆汁的收率为1.9g/1L(纯度为92％)；鸡胆汁的收率为0.6g/1L(纯度为80％)。1988年，沈季铭等报道了猪胆汁中胆烷酸的分离和鉴定方法(《医药工业》19(12)：529-5301988)，从提取胆红素后的猪胆汁进行皂化，接着将所得的猪去氧胆酸用乙酸乙酯重结晶，其所剩母液用甲醇-硫酸甲酯化，再用硅胶柱层析，用石油醚-丙酮洗脱，相继获得3a-羟基-6-氧代-5胆烷酸甲酯(3.5％)，鹅去氧胆酸甲酯(61.8％)，猪去氧胆酸甲酯7.5％)，猪胆酸(2.5％)和微量的3a-羟基-6-氧代-5β-胆烷酸甲酯′等。
但是，在所有上述的猪胆汁酸制备过程中，都是在原胆汁或提取胆红素后的猪胆汁中直接加NaOH进行水解的，在分离鹅去氧胆酸前都是用乙酸乙酯分离猪去氧胆酸的，并未注意到对于原料中脂肪和蛋白质等杂质的去除，溶剂的节省和操作的简化。
由此可见，为克服现有技术的不足，有必要在现有技术的基础上，对熊去氧胆酸的制备工艺进行改进，通过去除原料中的脂肪和蛋白质等杂质，在提取鹅去氧胆酸时，通过溶剂浸洗，从而在提高产物纯度、产率、简化步骤、节省材料方面取得熊去氧胆酸制备工艺的积极效果。
发明内容
申请人在不断研究和探索中发现，在各种家禽和家畜中，其胆汁中胆汁酸的组成差别是很大的。例如，鸭胆胆汁酸的组成是以胆酸为主的，和牛、羊胆汁相类似。这与以鹅去氧胆酸为主的鹅胆和鸡胆有根本的差别，但鹅胆和鸡胆资源少，价格高。实际上，在动物胆汁中，鹅去氧胆酸含量高的，资源最丰富的是猪胆(约为鸡胆汁的3倍以上)。从猪胆中提取鹅去氧胆酸，再用化学方法生产熊去氧胆酸是最具生产实用意义的。
本发明以胆汁酸的生物合成和胆固醇的代谢关系为基础，以生物体作为′生物药厂’来生产鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸，生理生化学研究表明，外源性(食物)的胆固醇进入体内，在肝脏被代谢生成鹅去氧胆酸，而肝脏自身合成的内源性胆固醇在肝脏内代谢成胆酸。同时，根据活体引流胆汁的成分分析表明，猪胆(肝胆汁)的成分，主要是鹅去氧胆酸，含量约58.4-82.4％，猪去氧胆酸(HDCA)的含量约3.7-31.8％(附图1)；熊肝胆汁亦是如此，故猪胆汁中也含有熊胆酸(附图2)。有结果表明，猪胆盐中含游离型和结合型熊去氧胆酸含量共约3％；猪胆汁中含熊去氧胆酸约0.6％。这说明，猪去氧胆酸和熊去氧胆酸都是在胆囊中由鹅去氧胆酸异构化生成的。故尽量减少胆汁在胆囊中的滞留时间，胆汁鲜新是可以提高鹅去氧胆酸含量比例的。总之，猪胆是最值得综合开发的资源之一，因猪去氧胆酸是一种安全、有效的降脂药，在分离猪去氧胆酸的同时，也有利于熊去氧胆酸的纯化。
鹅去氧胆酸的立体结构决定其7a-羟基的不稳定性，特别是在酸性条件下，易异构化和降解。如成品中残留矿酸，在干燥过程中，即可降低含量。而在碱性条件下较稳定，且也决定极性溶剂中它的溶解度比猪去氧胆酸高。本发明包括先对新鲜猪胆汁或提取胆红素后的猪胆汁进行酸化，制成结合胆汁酸，除去胆汁中的脂肪和蛋白质等杂质，再水解(皂化)，利于猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的分离和纯化，在游离猪胆汁酸钠盐水溶液中加双氧水脱色，消除一般用活性炭脱色时对产品和溶媒吸附的损失，选用NaOH、丙酮等浸洗猪去氧胆酸，从所剩母液中用二氯甲烷等除去含氧代(酮基)胆烷酸，得到鹅去氧胆酸，并用乙酸乙酯重结晶。
在鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法中，主要采用氧化还原法。′氧化′多用Haslewoow氧化法，或NBS试剂，Jones试剂氧化法；′还原′除庄治平等研究的种种还原剂外，本发明选用金属钠作还原剂，溶媒可用甲醇、无水乙醇、丙醇或丁醇等。
因此，本发明的目的在于提供一种以猪胆为原料分离鹅去氧胆酸的方法，包括对新鲜猪胆汁或提取胆红素后的猪胆汁进行酸化，获得结合胆汁酸后再进行水解皂化，制取纯净的猪胆汁酸，在室温下，用溶剂提纯鹅去氧胆酸。其中，由于通过酸化作用除去了胆汁中的脂肪和蛋白质等杂质，相比于现有技术中在原胆汁或提取胆红素后的猪胆汁中直接加NaOH进行水解的方法，提高了产物的纯度及产率。
进一步，所述用溶剂提纯鹅去氧胆酸的步骤包括在室温下，用NaOH水溶液，氨性丙酮，二氯甲烷等溶剂浸洗的方法分离猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸。这样，既节省溶剂，简化操作，也减少受热氧化生成含氧代(酮基)的胆烷酸。
更进一步，本发明的目的在于提供一种从猪胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，优选以新鲜猪胆汁为原料，包括对新鲜猪胆汁或提取胆红素后的猪胆汁进行酸化，获得结合胆汁酸后再进行水解皂化，制取纯净的猪胆汁酸，在室温下，用溶剂提纯鹅去氧胆酸，经氧化、还原制得熊去氧胆酸。
进一步，所述用溶剂提纯鹅去氧胆酸的步骤包括在室温下，用NaOH水溶液，氨性丙酮，二氯甲烷等溶剂浸洗的方法分离猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸。
进一步，提纯的鹅去氧胆酸，用铬酸钾或铬酸钠作氧化剂，以金属钠作还原剂，在适宜反应条件下制得熊去氧胆酸。
附图说明
附图1：猪胆汁的色谱及含量测定。
附图2：猪胆囊汁荧光分析图谱。
附图3：显示鹅去氧胆酸的羟基和异构化。
附图4：从鹅去氧胆酸制备熊去氧胆酸化学分子示意图。
具体实施方式
因此，本发明的目的在于提供一种从猪胆汁中分离鹅去氧胆酸的方法，优选以提取的新鲜猪胆汁为原料；为除去胆汁中的脂肪和蛋白质等杂质，对新鲜猪胆汁或提取胆红素后的猪胆汁进行酸化，提取结合胆汁酸后再水解皂化，制取纯净的猪胆汁酸，以利于猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸分离提纯。
本发明的目的还在于提供一种从猪胆汁中制备熊去氧胆酸的方法，优选以提取的新鲜猪胆汁为原料；为除去胆汁中的脂肪和蛋白质等杂质，对新鲜猪胆汁或提取胆红素后的猪胆汁进行酸化，提取结合胆汁酸后再水解皂化，制取纯净的猪胆汁酸，以利于猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸分离提纯。
具体的说，本发明的熊去氧胆酸的生产方法是先在新鲜猪胆汁中加入饱和石灰水，煮沸，生成胆红素钙盐沉淀，该沉淀钙盐可作生产胆红素备用，滤出的胆汁经酸化后提取结合胆汁酸，从而除去了胆色素、脂肪和蛋白质等杂质；然后水解皂化处理，得游离的胆汁酸钠盐水溶液，进行脱色、酸化，析出胆汁酸，用溶剂浸洗的方法，分离猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸，之后采用氧化还原法由鹅去氧胆酸生产熊去氧胆酸。
更具体的说，本发明包括从新鲜猪胆汁中提取分离鹅去氧胆酸、生产熊去氧胆酸的方法，包括取新鲜的猪胆汁，加饱和石灰水，煮沸，生成胆色素钙盐，然后滤出胆红素钙盐，滤出的胆汁中加入稀盐酸，酸化至pH2-3，析出结合胆汁酸，用水煮洗，滤出的结合胆汁酸中加入NaOH水溶液，然后煮沸、水解24小时左右，随后冷却，用稀盐酸调至pH8-9，煮沸，冷却后过滤，滤液中加入双氧水放置过夜，脱色，再用稀盐酸酸化至pH2-3，析出游离的胆汁酸，在室温下，用NaOH水溶液，氨性丙酮，二氯甲烷等溶剂浸洗的方法分离猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸，取鹅去氧胆酸溶于1L冰醋酸中，加乙酸钠，搅拌使其溶解，然后加铬酸钾于水溶液，室温下静置过夜，加入水，有结晶析出，取3α-羟基-7-酮基胆烷酸置于三颈瓶中，加入正丁醇搅拌使其溶解，升温至115℃左右时，开始分次投入金属钠，当反应至液面金属钠完全溶解消失，逐渐有白色絮状物析出继续反应半小时，加水，在搅拌下升温，使其溶解至透明，然后减压蒸出有机溶剂，其残留物加水使其溶解，过滤，滤液用稀盐酸酸化至pH2-3，析出得游离熊去氧胆酸。
在下文中，参照实施例，说明了制备熊去氧胆酸的具体方法。
实施例
实施例1：析出猪结合胆汁酸和鹅去氧胆酸的分离
取新鲜猪胆汁，加饱和石灰水3-4％，煮沸，生成胆红素钙盐沉淀，滤出，留做生产胆红素备用。将滤出的胆汁用稀盐酸酸化至PH2-3，析出猪结合胆汁酸，过滤，滤出的猪结合胆汁酸用水煮洗2次，加8-10倍的10％左右NaOH水溶液，加热回流水解20-24小时，用稀盐酸或稀硫酸酸化至PH8-9，加热煮沸，冷却后，加3-4％双氧水脱色，再用稀盐酸化至PH2-3，析出游离猪胆汁酸，水洗至中性。加15-20％NaOH水溶液，搅拌，此时，猪去氧胆酸难溶析出，可分离猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸。倾出碱液，滤出猪去氧胆酸。合并倾出和滤出的碱液，再用稀盐酸酸化，析出鹅去氧胆酸粗品，用1-2倍二氯化碳浸洗，除去含酮基的胆汁酸，得鹅去氧胆酸，用乙酸乙酯(或乙腈)重结晶，m.p142-144℃收率约5-8％，纯度高达99％左右。
或者取上述得到的游离猪胆汁酸，水洗至中性后，干燥、粉碎后加1-1.5倍氨性丙酮浸洗，过滤，得猪去氧胆酸；滤液回收丙酮后，残留物加1-2倍二氯化碳浸洗后，用乙酸乙酯(或乙腈)重结晶，得鹅去氧胆酸，，m.p.142-144℃收率约5-8％。
实施例2：熊去氧胆酸的制备
取鹅去氧胆酸20g，溶于1000ml冰醋酸中，加乙酸钠150-200g。经搅拌使其溶解，然后加入铬酸钾15-20g(100ml水中的)，室温下静置反应一夜，加水180-200ml，析出结晶，过滤，水洗，干燥，得白色粉末，为3a-羟基-7-酮基胆烷酸(m.p.194-196℃)，收率84-85％。
取3a-羟基-7-酮基胆烷酸40g置3000ml三颈瓶中，加正丁醇1L搅拌使溶解，升温至115-120℃左右时，开始分次投入金属钠75-80g。当反应至液面金属钠完全消失后，逐渐有白色絮状物析出，继续反应半小时，加水1200ml在搅拌下升温，使其溶解至透明。然后减压蒸出有机溶剂，其残留物加水4000-5000ml使其溶解，过滤，滤液用稀盐酸酸化至析出游离的熊去氧胆酸，水煮洗至中性，干燥，得37-39g(mp.191-193℃)，收率95-97％，用乙醇重结晶，mp.198-203℃，纯度高达99％左右。
工业应用
本发明方法从猪胆汁中分离鹅去氧胆酸，方法简便，产率高，成本也较低，是生产熊去氧胆酸的较佳路线，利用本发明的方法可以用于工业上从猪胆汁中制备熊去氧胆酸。