针对TGFΒ的抗体.pdf

本发明涉及抗体分子，特别是结合转化生长因子β(TGFβ)的抗体分子，及其用途。更具体而言，本发明涉及结合且优选中和TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的抗体分子，即所谓的“泛特异性”抗体分子，以及此类抗体分子的用途。本发明内的优选实施方案是抗体分子，无论是完整的抗体(例如IgG，如IgG1或IgG4)还是抗体片段(例如scFv、Fab、dAb)。

1.  结合并中和人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的分离的特异性结合成员，包括抗体的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包括HCDR1、HCDR2和HCDR3这一CDRs组，并且其中所述抗原结合结构域采用人VH1家族基因，和其中所述HCDR3具有选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：25的氨基酸序列。

2.  根据权利要求1的特异性结合成员，其中所述人VH1家族基因是人VH1-2基因。

3.  根据权利要求2的特异性结合成员，其中所述人VH1-2基因是DP-10或DP-88基因。

4.  根据权利要求1－3中任一项的特异性结合成员，其中所述抗原结合结构域进一步包括LCDR1、LCDR2和LCDR3这一CDRs组，并且其中所述抗原结合结构域采用人Vκ3家族基因，和其中所述LCDR3具有选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：30的氨基酸序列。

5.  根据权利要求4的特异性结合成员，其中所述HCDR3和LCDR3选自：
(a)分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10，
(b)分别为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：20，和
(c)分别为SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：30。

6.  根据权利要求4的特异性结合成员，其中所述人Vκ3家族基因是人VκDPK22基因。

7.  根据权利要求1的特异性结合成员，其中所述VH结构域的HCDR1、HCDR2和HCDR3在种系重链框架内。

8.  根据权利要求1的特异性结合成员，其中所述VH结构域的HCDR1、HCDR2和HCDR3在来自所述种系氨基酸序列并包含至多12个突变的框架内。

9.  根据权利要求4的特异性结合成员，其中所述Vκ结构域的LCDR1、LCDR2和LCDR3在种系重链框架内。

10.  根据权利要求4的特异性结合成员，其中所述Vκ结构域的LCDR1、LCDR2和LCDR3在来自所述种系Vκ氨基酸序列并包含至多5个突变的框架内。

11.  结合并中和人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的分离的特异性结合成员，包括抗体的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域采用人VHDP-10基因或人VH DP-88基因，并且包括包含SEQ ID NO：31中的氨基酸序列的FR4氨基酸序列。

12.  根据权利要求11的特异性结合成员，其中所述抗原结合结构域采用人VH DP-10基因或人VH DP-88基因，并且包括HCDR1、HCDR2和HCDR3这一CDRs组，其中所述HCDR3具有选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：25的氨基酸序列，并进一步包括包含SEQ ID NO：31中的氨基酸序列的FR4氨基酸序列。

13.  根据权利要求11的特异性结合成员，其中所述抗原结合结构域进一步采用人Vκ3家族基因和人Jκ5基因。

14.  根据权利要求13的特异性结合成员，其中采用人Vκ3家族基因和人Jκ5基因的所述抗原结合结构域包括LCDR1、LCDR2和LCDR3这一CDRs组，并且其中所述LCDR3具有选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：30的氨基酸序列。

15.  结合并中和人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的分离的特异性结合成员，包括抗体的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包括：
(a)SEQ ID NO：3的氨基酸序列的HCDR1，SEQ ID NO：4的氨基酸序列的HCDR2，SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HCDR3；
(b)SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HCDR1，SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HCDR2，SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HCDR3；或
(c)SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HCDR1，SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HCDR2，SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HCDR3。

16.  根据权利要求15的分离的特异性结合成员，其中所述抗原结合结构域进一步包括抗体VL结构域。

17.  根据权利要求15的分离的特异性结合成员，其中所述抗原结 合结构域所包括的LCDRs选自：
(a)SEQ ID NO：8的氨基酸序列的LCDR1，SEQ ID NO：9的氨基酸序列的LCDR2，SEQ ID NO：10的氨基酸序列的LCDR3；
(b)SEQ ID NO：18的氨基酸序列的LCDR1，SEQ ID NO：19的氨基酸序列的LCDR2，SEQ ID NO：20的氨基酸序列的LCDR3；和
(c)SEQ ID NO：28的氨基酸序列的LCDR1，SEQ ID NO：29的氨基酸序列的LCDR2，SEQ ID NO：30的氨基酸序列的LCDR3。

18.  根据权利要求15的分离的特异性结合成员，其中所述VH结构域的HCDR1、HCDR2和HCDR3在种系重链框架内。

19.  根据权利要求18的分离的特异性结合成员，其中所述种系重链框架是人VH1家族框架。

20.  根据权利要求15的分离的特异性结合成员，其中所述VH结构域的HCDR1、HCDR2和HCDR3在种系人重链框架VH1DP-10或DP-88内。

21.  根据权利要求17的分离的特异性结合成员，其中所述VL结构域的LCDR1、LCDR2和LCDR3在种系轻链框架内。

22.  根据权利要求21的分离的特异性结合成员，其中所述种系轻链框架是人Vκ3家族框架。

23.  根据权利要求21的分离的特异性结合成员，其中所述抗原结合结构域进一步采用人Jκ5基因。

24.  根据权利要求22的分离的特异性结合成员，其中所述人Vκ3家族基因是VκDPK22基因。

25.  分离的特异性结合成员，其包括具有至多5个突变的PET1073G12VH结构域(SEQ ID NO：2)或其抗原结合部分。

26.  分离的特异性结合成员，其包括具有至多5个突变的PET1074B9VH结构域(SEQ ID NO：12)或其抗原结合部分。

27.  分离的特异性结合成员，其包括具有至多5个突变的PET1287A10VH结构域(SEQ ID NO：22)或其抗原结合部分。

28.  根据权利要求10的分离的特异性结合成员，其进一步包括具有至多5个突变的PET1073G12VL结构域(SEQ ID NO：7)或其抗原结合 部分。

29.  根据权利要求25的分离的特异性结合成员，其进一步包括具有至多5个突变的PET1074B9VL结构域(SEQ ID NO：17)或其抗原结合部分。

30.  根据权利要求26的分离的特异性结合成员，其进一步包括具有至多5个突变的PET1287A10VL结构域(SEQ ID NO：27)或其抗原结合部分。

31.  抗体，其包括PET1073G12VH结构域(SEQ ID NO：2)和PET1073G12VL结构域(SEQ ID NO：7)。

32.  抗体，其包括PET1074B9VH结构域(SEQ ID NO：12)和PET1074B9VL结构域(SEQ ID NO：17)。

33.  抗体，其包括PET1287A10VH结构域(SEQ ID NO：22)和PET1287A10VL结构域(SEQ ID NO：27)。

34.  根据权利要求1－30中任一项的分离的特异性结合成员，其包括scFv抗体分子。

35.  根据权利要求1－30中任一项的分离的特异性结合成员，其包括抗体恒定区。

36.  根据权利要求35的分离的特异性结合成员，其中所述恒定区来自IgG4。

37.  组合物，其包括根据权利要求1－30中任一项的特异性结合成员。

38.  分离的核酸，其包含编码根据权利要求1－30中任一项的特异性结合成员的核苷酸序列。

39.  宿主细胞，其用根据权利要求38的核酸转化。

40.  生产特异性结合成员的方法，其包括在用于生产所述特异性结合成员的条件下培养根据权利要求39的宿主细胞，并分离和/或纯化所述特异性结合成员。

41.  根据权利要求40的方法，其进一步包括将所述特异性结合成员或者抗体VH或VL可变结构域配制到包含至少一种另外的活性组分的组 合物中。

42.  生产特异地结合人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的特异性结合成员的方法，所述方法包括：
(a)提供编码VH结构域的起始核酸或各自编码VH结构域的核酸的起始储库，其中所述VH结构域包括种系人框架VH1DP-10或DP-88，并且任何一个包括待被取代的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，或缺乏HCDR1、HCDR2和/或HCDR3编码区；
(b)将所述起始核酸或起始储库与供体核酸组合，其中所述供体核酸编码潜在的HCDR或所述供体核酸编码潜在的HCDRs，从而使得所述供体核酸插入到所述起始核酸或起始储库的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3区内，以便提供编码VH结构域的核酸的产物储库；
(c)表达所述产物储库的核酸以产生产物VH结构域；
(d)任选地将所述产物VH结构域与一个或多个VL结构域组合；
(e)选择对于人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的特异性结合成员，所述特异性结合成员包括产物VH结构域和任选地VL结构域；和
(f)回收所述特异性结合成员或编码其的核酸。

43.  根据权利要求42的方法，其中所述供体核酸编码下列氨基酸序列或通过下列氨基酸序列的突变而产生：
(a)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：23的HCDR1；
(b)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：24的HCDR2；和/或
(c)SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：25的HCDR3。

44.  根据权利要求42或43的方法，其进一步包括使所述回收的特异性结合成员与抗体恒定区融合。

45.  根据权利要求42的方法，其中所述特异性结合成员是scFv抗体分子。

46.  根据权利要求42的方法，其中所述特异性结合成员是Fab抗体分子。

47.  根据权利要求42的方法，其中所述特异性结合成员是完整的 抗体。

48.  通过施用药学上有效量的根据权利要求37的组合物来治疗选自纤维化疾病、癌症或免疫介导型疾病的疾病或病症的方法。

49.  根据权利要求1－30中任一项的特异性结合成员在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自纤维化疾病、癌症或免疫介导型疾病的疾病或病症。

50.  用于抑制TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3信号传导的方法，其包括使TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3在体内与根据权利要求1－30中任一项的特异性结合成员接触的步骤。

51.  用于抑制TGFβ1、2或3介导的纤连蛋白产生的方法，其包括使TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3与根据权利要求1－30中任一项的特异性结合成员接触的步骤。

52.  用于抑制TGFβ1、2或3介导的VEGF产生的方法，其包括使TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3与根据权利要求1－30中任一项的特异性结合成员接触的步骤。

53.  用于调节细胞增殖的方法，所述调节选自：
(a)减少TGFβ1、2或3介导的上皮细胞增殖抑制；
(b)减少TGFβ1、2或3介导的内皮细胞增殖抑制；和
(c)抑制TGFβ1、2或3介导的平滑肌细胞增殖，
所述方法包括使表达TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3的细胞与根据权利要求1－30中任一项的特异性结合成员接触的步骤。

54.  用于抑制环孢菌素诱导的TGFβ1、2或3活性的方法，其包括使TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3与根据权利要求1－30中任一项的特异性结合成员接触的步骤。

55.  用于增加NK细胞活性的方法，其包括使表达TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3的细胞与根据权利要求1－30中任一项的特异性结合成员接触的步骤。

56.  用于抑制TGFβ1、2或3介导的免疫抑制的方法，其包括使表达TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3的细胞与根据权利要求1－30中任一项的 特异性结合成员接触的步骤。

57.  用于抑制表达TGFβ1、2或3的肿瘤生长的方法，其包括使表达TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3的细胞与根据权利要求1－30中任一项的特异性结合成员接触的步骤。

58.  特异地结合并中和TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的分离的特异性结合成员，包括来自人VH1基因家族的种系重链框架序列。

59.  根据权利要求58的分离的特异性结合成员，其中所述种系重链框架序列来自人DP-10VH1基因家族。

60.  根据权利要求59的分离的特异性结合成员，其中所述种系重链框架序列来自人DP-88VH1基因家族。

61.  特异地结合并中和人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的分离的特异性结合成员，包括来自人Vκ3基因家族的种系轻链序列。

62.  根据权利要求61的分离的特异性结合成员，其中所述轻链的框架区来自DPK-22。

63.  根据权利要求35的分离的特异性结合成员，其中所述恒定区来自IgG1。

针对TGFβ的抗体
本申请是申请日为2006年2月8日、申请号为200680008838.9、发明名称为“针对TGFβ的抗体”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及抗体分子，特别是结合转化生长因子β(TGFβ)的抗体分子，及其用途。更具体而言，本发明涉及结合且优选中和TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的抗体分子，即所谓的“泛特异性”抗体分子，以及此类抗体分子的用途。
背景
TGFβ在1981年首次被鉴别(Roberts等人，1981)。在人类中存在3种同种型：TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3(Swiss Prot登录号分别为P01137、P08112和P10600)，在其生物活性状态下，它们是25kDa同型二聚体，包括两个通过链间二硫桥连接的具有112个氨基酸的单体。TGFβ1与TGFβ2的不同在于27，并且与TGFβ3的不同在于22，主要是保守性氨基酸改变。这些差异已在通过X射线晶体学测定的TGFβ3D结构上作图(Schlunegger等人，1992；Peer等人，1996)，并且已确定受体结合区域(Griffith等人，1996；Qian等人，1996)。
人TGFβs非常类似于小鼠TGFβs：人TGFβ1与小鼠TGFβ1只有1个氨基酸的差异，人TGFβ2与小鼠TGFβ2只有3个氨基酸的差异，并且人TGFβ3与小鼠TGFβ3相同。因此，在小鼠(包括转基因小鼠)中生产针对人TGFβs的抗体是困难的。
TGFβs是参与细胞增殖和分化、胚胎发育、细胞外基质形成、骨发育、伤口愈合、血细胞生成以及免疫和炎症应答的多功能细胞因子(Border等人，1995a)。TGFβs的失调导致病理过程，这些病理过程在人中已牵涉众多病状，例如出生缺陷、癌症、慢性炎症、自身免 疫和纤维化疾病(Border等人，1994；Border等人，1995b)。
在许多纤维化动物模型中已使用中和抗体作为拮抗剂进行了研究(Border等人，1995b；Border等人，1994)，例如肾小球肾炎(Border等人，1990)、神经瘢痕化(Logan等人，1994)、皮肤瘢痕化(Shah等人，1994)和肺纤维化(Giri等人，1993)。这些模型代表的所有疾病代表了未满足的对新型治疗产品的需要(Bonewald，1999；Jackson，1998)。然而，在这些及其他动物研究中使用的抗体已在动物中产生，并且它们在人中的治疗益处可能是有限的，因为其具有诱导免疫原性应答的可能性以及其具有快速的药物代谢动力学清除(Vaughan等人，1998)。对于治疗TGFβ介导的疾病，人抗体是更希望的。
已知各种抗体片段能够特异地并且以良好的亲和力结合靶蛋白。例如，只包含通过短肽连接体连接在一起的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体片段，称为单链Fv(scFv)，已被广泛使用。中和TGFβ1(CAT-192)或TGFβ2(CAT-152或Trabio^TM)的人抗体以前已产生(EP 0 945 464，EP 0 853 661，Thompson等人1999)。然而，本领域中可获得的大多数TGFβ抗体是非人的。此外，在本发明之前唯一针对TGFβ的泛特异性(pan-specific)单克隆抗体是啮齿类动物的。
与人TGFβ1和人TGFβ2结合的针对中和性和非中和性表位的多克隆抗体已在兔(Danielpour等人，1989b；Roberts等人，1990)、鸡(R&D Systems，Minneapolis)和火鸡(Danielpour等人，1989c)中产生。代表了部分TGFβ序列的肽也已用作免疫原来在兔中产生中和性多克隆抗血清(Border等人，1990；Flanders等人，1988)。此类非人多克隆抗体不适合于人治疗用途。
1D11.16是鼠类泛特异性抗TGFβ抗体，其在广泛范围的体外测定法中中和人和小鼠TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3(Dasch等人，1989；Dasch等人，1996；R&D System关于MAB1835的产品页)，并且于在纤维化动物模型中的原理验证研究之中是有效的(Ling等人，2003； Miyajima等人，2000；Schneider等人，1999；Khanna等人，1999；Shenkar等人，1994)。然而，因为1D11.16是鼠类单克隆抗体(Dasch等人，1989；Dasch等人，1996)，所以它不适合在人中的治疗用途。
附图简述
图1显示了PET1073G12种系IgG4(实心正方形)和1D11.16(空心圆圈)对来自NHLF细胞的经TGFβ1(a)、TGFβ2(b)或TGFβ3(c)(10pM)诱导的纤连蛋白产生的中和作用(％抑制)。实心三角形代表以最高浓度(100nM)测试的无关IgG4。数据显示为一式两份进行的n次实验的平均值±SE平均值。关于IC₅₀值见表2。
图2显示了PET1074B9种系IgG4(实心正方形)和1D11.16(空心圆圈)对来自NHLF细胞的经TGFβ1(a)、TGFβ2(b)或TGFβ3(c)(10pM)诱导的纤连蛋白产生的中和作用(％抑制)。实心三角形代表以最高浓度(100nM)测试的无关IgG4。数据显示为一式两份进行的n次实验的平均值±SE平均值。关于IC₅₀值见表2。
图3显示了PET1287A10种系IgG4(实心正方形)和1D11.16(空心圆圈)对来自NHLF细胞的经TGFβ1(a)、TGFβ2(b)或TGFβ3(c)(10pM)诱导的纤连蛋白产生的中和作用(％抑制)。实心三角形代表以最高浓度(100nM)测试的无关IgG4。数据显示为一式两份进行的n次实验的平均值±SE平均值。关于IC₅₀值见表2。
发明概述
在本发明的各个方面中提供了下文包括的实施方案的主题。本发明的进一步的方面和实施方案在本文的说明书中公开。
本发明提供了对于TGFβ特别是人TGFβ的特异性结合成员。特别提供了针对TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的特异性结合成员。本发明内的优选实施方案是抗体分子，无论是完整的抗体(例如IgG，如IgG1 或IgG4)还是抗体片段(例如scFv、Fab、dAb)。提供了抗体抗原-结合区域和抗体的抗原结合位点，如包含此类区域的抗体VH和VL结构域。提供了在VH和VL结构域内的互补性决定区CDRs，其可以在不同框架区FR's内提供，以视情况而形成VH或VL结构域。抗原结合位点可以由抗体VH结构域和/或VL结构域或其抗原结合部分组成。
在一个方面，本发明提供了对于人TGFβ的特异性结合成员，其包括抗体的抗原结合位点、HCDR组、LCDR组或两者和/或人抗体VH结构域、VL结构域或两者。
HCDR1、HCDR2和HCDR3这一组可以具有选自下列的序列：
HCDR1SEQ ID NO：3、HCDR2SEQ ID NO：4、HCDR3SEQ ID NO：5(在本文中称为“PET1073G12的HCDRs组”)；
HCDR1SEQ ID NO：13、HCDR2SEQ ID NO：14、HCDR3SEQ ID NO：15(在本文中称为“PET1074B9的HCDRs组”)；
HCDR1SEQ ID NO：23、HCDR2SEQ ID NO：24、HCDR3SEQ ID NO：25(在本文中称为“PET1287A10的HCDRs组”)。
LCDR1、LCDR2和LCDR3这一组可以具有选自下列的序列：
LCDR1SEQ ID NO：8、LCDR2SEQ ID NO：9、LCDR3SEQ ID NO：10(在本文中称为“PET1073G12的LCDRs组”)；
LCDR1SEQ ID NO：18、LCDR2SEQ ID NO：19、LCDR3SEQ ID NO：20(在本文中称为“PET1074B9的LCDRs组”)；
LCDR1SEQ ID NO：28、LCDR2SEQ ID NO：29、LCDR3SEQ ID NO：30(在本文中称为“PET1287A10的LCDRs组”)。
PET1073G12的HCDRs组与PET1073G12的LCDRS组一起在本文中称为PET1073G12的CDRs组。
PET1074B9的HCDRs组与PET1074B9的LCDRS组一起在本文中称为PET1074B9的CDRs组。
PET1287A10的HCDRs组与PET1287A10的LCDRS组一起在本文中称为PET1287A10的CDRs组。
本发明还提供了包含如本文公开的HCDRs组的VH结构域，同样地 还分开地提供了包含如本文公开的LCDRs组的VL结构域。优选地，这样的VH结构域是与这样的VL结构域配对的，并且最优选地VH和VL结构域的配对与如本文所示的克隆中的一样。
本发明进一步提供了包括HCDR1、HCDR2和HCDR3这一HCDRs组的VH结构域，其中所述HCDRs组相应于具有1个或2个氨基酸置换的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的HCDRs组。
本发明进一步提供了包括LCDR1、LCDR2和LCDR3这一LCDRs组的VL结构域，其中所述CDRs组相应于具有1个或2个氨基酸置换的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的LCDRs组。
本发明还提供了在此类VH和/或VL结构域内包括抗体的抗原结合位点的特异性结合成员。
跟随将多变量数据分析技术应用于结构/特性-活性关系的计算化学的引导(Wold等人,Multivariate data analysis in chemistry.Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry(Ed.：B.Kowalski)，D.Reidel Publishing Company，Dordrecht，Holland，1984(ISBN90-277-1846-6))，抗体的定量的活性-特性关系可以使用众所周知的数学技术例如统计回归、模式识别和分类来获得(Norman等人,Applied Regression Analysis.Wiley-Interscience；第三版(April1998)ISBN：0471170828；Abraham Kandel，Eric Backer.Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis.Prentice Hall PTR；(May11，1995)，ISBN：0133418847；Wojtek Krzanowski.Principles of Multivariate Analysis：A User's Perspective(Oxford Statistical Science Series，No22(Paper)).Oxford University Press；(December2000)，ISBN：0198507089；Ian H.Witten，Eibe Frank.Data Mining：Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations.Morgan Kaufmann；(October11，1999)，ISBN：1558605525；David G.T.Denison(编者)，Christopher C.Holmes，Bani K.Mallick，Adrian F.M.Smith.Bayesian Methods  for Nonlinear Classification and Regression(Wiley Series in Probability and Statistics).John Wiley&Sons；(July2002)，ISBN：0471490369；Arup K.Ghose,Vellarkad N.Viswanadhan.Combinatorial Library Design and Evaluation Principles,Software,Tools,and Applications in Drug Discovery.ISBN：0-8247-0487-8)。抗体的特性可以得自抗体序列的经验和理论模型(例如，可能接触的残基或计算的物理化学特性的分析)、功能和三维结构，并且这些特性可以单独和组合考虑。
已知原子结构的抗体的分析已阐明抗体结合位点的序列和三维结构之间的关系(Chothia C.等人,Journal Molecular Biology(1992)227，799-817；Al-Lazikani等人,Journal Molecular Biology(1997)273(4)，927-948)。这些关系暗示，除了VH结构域中的第三个区域(环)外，结合位点环具有少数主链构象中的一种：正则结构(canonical structures)。已显示，在特定环中形成的正则结构由其大小以及在环和框架区内的关键位点处某些残基的存在来确定(Chothia等人和Al-Lazikani等人，同上)。
这一序列-结构关系的研究可以用于预测在已知序列但未知三维结构的抗体中的那些残基，它们在维持其CDR环的三维结构中是重要的并因此在维持结合特异性中是重要的。这些预测可以通过将预测与来自先导物优化实验(lead optimization experiments)的输出结果进行比较来证实。在结构方法中，可以使用任何可免费获得或商业的软件包例如WAM(Whitelegg，N.R.u.和Rees，A.R(2000)Prot.Eng.，12,815-824)来形成抗体分子的理论模型。然后，蛋白质可视化和分析软件包例如Insight II(Accelerys，Inc.)或Deep View(Guex，N.和Peitsch，M.C.Electrophoresis(1997)18，2714-2723)可用于评估在CDR和FR中每个位置上的可能置换。这个信息随后可用于进行可能对活性具有最小或有利影响的置换。
在CDRs、抗体VH或VL结构域和特异性结合成员的氨基酸序列内进行置换所需的技术一般是本领域可获得的。使用可能或不能被预测 对活性具有最小或有利影响的置换，可以制备变体序列，并且测试结合和/或中和TGFβ的能力和/或任何其他所需特性。这在下文中进一步讨论。
如已注明的，本发明提供了特异性结合成员，其包括指定的CDRs组，特别是PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10的CDRs组，以及在CDRs组内有1个或2个置换的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的CDRs组。
提供了在抗体框架区或其他蛋白质支架例如纤连蛋白或细胞色素B内的相关CDRs组。优选采用抗体框架区。
在一个优选实施方案中，重链采用人V_H1家族基因。在各种实施方案中，与人V_H1家族基因的种系氨基酸序列相比较，重链框架氨基酸序列包含1－12，优选3－12，和更优选3－8个氨基酸差异。在某些实施方案中，重链框架序列是种系序列。在特别优选的实施方案中，重链的抗体框架区可以是来自V_H1家族的人DP-10(V_H1-69)或人DP-88(V_H1-e)。优选地，使用人DP-10基因的实施方案在第27、78和94位残基处具有非种系氨基酸。在某些实施方案中，第27位残基是酪氨酸，第78位残基是苏氨酸，和第94位残基是丝氨酸或亮氨酸。在某些实施方案中，轻链采用与种系氨基酸序列相比较具有1－5，优选1－4，更优选1－3个氨基酸差异的人Vκ3家族基因。在某些实施方案中，轻链框架序列是种系人Vκ3家族基因序列。在特别优选的实施方案中，轻链框架区可以是人DPK-22(A27)。在某些此类实施方案中，第2位残基是非种系氨基酸。在某些实施方案中，第2位残基是苏氨酸。
在一个高度优选的实施方案中，提供了具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH结构域，这被称为“PET1073G12VH结构域”，或具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的VH结构域，这被称为“PET1074B9VH结构域”，或具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH结构域，这被称为“PET1287A10VH结构域”。
在一个进一步高度优选的实施方案中，提供了具有SEQ ID NO：7 的氨基酸序列的VL结构域，这被称为“PET1073G12VL结构域”，或具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VL结构域，这被称为“PET1074B9VL结构域”，或具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL结构域，这被称为“PET1287A10VL结构域”。根据本发明提供的一个高度优选的实施方案由PET1073G12VH结构域(SEQ ID NO：2)和PET1073G12VL结构域(SEQ ID NO：7)组成。根据本发明提供的另一高度优选的实施方案由PET1074B9VH结构域(SEQ ID NO：12)和PET1074B9VL结构域(SEQ ID NO：17)组成。根据本发明提供的另一高度优选的实施方案由PET1287A10VH结构域(SEQ ID NO：22)和PET1287A10VL结构域(SEQ ID NO：27)组成。根据本发明提供的这些或任何其他抗体抗原-结合位点可以以任何所希望的抗体分子形式提供，例如scFv、Fab、IgG1、IgG4、dAb等，如本文其他地方进一步讨论的。
在一个进一步高度优选的实施方案中，本发明提供了IgG4抗体分子，其包括PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH结构域，优选还包括相应的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VL结构域。
本发明提供了包括PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH结构域和/或PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VL结构域的其他IgG4或其他抗体分子，正如提供了包括在抗体VH结构域内的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的HCDRs组，和/或在抗体VL结构域内的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的LCDRs组的其他抗体分子。
为了方便，在这里指出，本文中使用的“和/或”被视为具有或不具有另一个的所述两个指定特征或组分中每一个的具体公开。例如“A和/或B”被视为(i)A、(ii)B以及(iii)A和B中每一个的具体公开，就像每一个单独在本文中列出。
如所注明的，在本发明的某些实施方案中提供了特异性结合成员，其结合人TGFβ的所有3种同种型，并且包括PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH和/或VL结构域，或者那些结构域的抗原结合部分。
在某些实施方案中，将VH结构域与VL结构域配对以提供抗原结 合位点。在一个优选实施方案中，将PET1073G12VH结构域(SEQ ID NO：2)与PET1073G12VL结构域(SEQ ID NO：7)配对，从而使得形成了包括PET1073G12VH和VL结构域的抗原结合位点。在一个优选实施方案中，将PET1074B9VH结构域(SEQ ID NO：12)与PET1074B9VL结构域(SEQ ID NO：17)配对，从而使得形成了包括PET1074B9VH和VL结构域的抗原结合位点。在一个优选实施方案中，将PET1287A10VH结构域(SEQ ID NO：22)与PET1287A10VL结构域(SEQ ID NO：27)配对，从而使得形成了包括PET1287A10VH和VL结构域的抗原结合位点。在其他实施方案中，将PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH与除相应的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VL以外的VL结构域配对。本领域中良好地建立了轻链混杂(promiscuity)。
类似地，本文公开的任何HCDRs组可以在VH结构域中提供，所述VH结构域单独地或与VL结构域相组合地用作特异性结合成员。可以提供具有本文公开的HCDRs组的VH结构域，并且如果将此类VH结构域与VL结构域配对，那么可以提供具有本文公开的LCDRs组的VL结构域。HCDRs组和LCDRs组的配对可以是如本文关于PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10抗体所公开的那样。VH和/或VL结构域的框架区可以是种系框架。重链结构域的框架区可以选自V_H-1家族，并且优选的V_H-1框架是DP-10或DP-88框架。轻链的框架区可以选自Vк3家族，并且优选的此类框架是DPK-22。
一个或多个CDRs可以取自VH或VL结构域，其序列是本文公开的并且引入合适的框架中。这在本文中进一步讨论。同样可采用如使用本文描述的方法获得的抗体的其他CDRs和CDRs组。
抗体VH结构域、抗体VL结构域、HCDRs组、LCDRs组、CDRs组、一种或多种HCDRs例如HCDR3、和/或一种或多种LCR's例如LCDR3，可以在本文关于其他分子所公开的本发明任何方面和实施方案中采用，例如具有改善的效力的抗原结合位点的突变和选择方法。
本发明的VH和VL结构域以及CDRs的变体，包括其氨基酸序列在本文中列出的并且可以在对于TGFβ的特异性结合成员中采用的那 些，可以通过序列改变或突变以及筛选的方法获得。本发明还提供了此类方法。
如所讨论的，可以根据本发明采用其序列在本文中具体公开的任何VH和VL结构域的可变结构域氨基酸序列变体。特别的变体可以包括一个或多个氨基酸序列改变(添加、删除、置换和/或插入氨基酸残基)，可以是少于约20个改变、少于约15个改变、少于约10个改变或少于约5个改变，4、3、2或1个改变。改变可以在一个或多个框架区和/或一个或多个CDRs中进行。
根据本发明的进一步方面，提供了人、人源化、嵌合或合成的特异性结合成员，其与任何特异性结合成员竞争或交叉竞争结合抗原，所述任何特异性结合成员结合所述抗原并包括特异性的抗体抗原-结合区、本文公开的VH和/或VL结构域、本文公开的CDRs或HCDR3组、或这些中的任何一种的变体。结合成员之间的竞争可以在体外容易地测定，例如使用ELISA和/或通过将特异性的报告分子标记至一个结合成员，其可以在其他未标记的结合成员存在下被检测，从而使得能够鉴定结合相同表位或重叠表位的特异性结合成员。结合成员之间的交叉竞争可以容易地通过进行反转测定法(reverse assay)来测定，例如通过颠倒标记的和未标记的结合成员以鉴定在两个方向上阻断结合的对。
因此，本发明的一个进一步的方面提供了包括抗体的抗原结合位点的特异性结合成员，其与PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10抗体分子，特别是PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10scFv和/或IgG4，竞争或交叉竞争结合TGFβ。在各种实施方案中，抗体是人、人源化、嵌合或合成的抗体。在进一步的方面，本发明提供了包括人、人源化、嵌合或合成的抗体的抗原结合位点的特异性结合成员，其与本发明的抗原结合位点竞争或交叉竞争结合TGFβ，其中人、人源化、嵌合或合成的抗体的抗原结合位点由VH结构域和VL结构域组成，并且其中VH和VL结构域包括如本文公开的CDRs组。
考虑到本文公开的信息，在本领域中可得各种方法以用于获得针 对TGFβ的人、人源化、嵌合或合成的抗体，并且其可以与PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10抗体分子，具有PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的CDRs组的抗体分子，具有PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10HCDRs组的抗体分子，或具有PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10LCDRs组的抗体分子竞争或交叉竞争结合TGFβ。
在一个进一步的方面，本发明提供了用于获得一个或多个能够结合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的特异性结合成员的方法，该方法包括使根据本发明的特异性结合成员文库与所述TGFβs接触，并且选择所述文库中的一个或多个能够结合所有所述TGFβs的特异性结合成员。
所述文库可以展示在噬菌体颗粒表面上，每个颗粒包含编码展示在其表面上的抗体VH可变结构域(并且任选地，如果存在，还有所展示的VL结构域)的核酸。
选择能够结合抗原并展示在噬菌体颗粒上的特异性结合成员之后，可以从展示所述选择的特异性结合成员的噬菌体颗粒上获取核酸。通过表达具有取自噬菌体颗粒(所述噬菌体颗粒展示所述选择的特异性结合成员)的核酸的序列的核酸，此类核酸可以用于后续生产特异性结合成员或抗体VH可变结构域(和任选地，抗体VL可变结构域)。
具有所述选择的特异性结合成员的抗体VH结构域的氨基酸序列的抗体VH结构域可以以分离的形式提供，如可以提供包括此类VH结构域的特异性结合成员。可以进一步测试结合所有3种TGFβ同种型的能力，以及与PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10(例如以scFv形式和/或IgG形式，例如IgG4)竞争或交叉竞争结合所有3种人的TGFβ同种型的能力。如下文进一步讨论的，可以测试中和TGFβ的能力。
根据本发明的特异性结合成员可以以PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10抗体分子(例如scFv，或优选IgG4)的亲和力，或以大于上述分子之一的亲和力结合TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3。根据本发明的特异性结合成员可以以PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10抗体分子(例如scFv，或优选PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10 IgG4)的效力，或以大于上述分子之一的效力中和TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3。
根据本发明的特异性结合成员可以以PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10抗体分子(例如scFv，或优选IgG4)的效力，或以大于上述分子之一的效力中和天然存在的TGFβ。不同特异性结合成员的结合亲和力和中和效力可以在适当条件下进行比较。
本发明的优选实施方案优选包括人、人源化、嵌合或合成的抗体，其中和天然存在的TGFβ，其中和效力等于或大于由PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH结构域和相应的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VL结构域形成的TGFβ抗原结合位点的效力。
除了抗体序列外，根据本发明的特异性结合成员还可以包括其他氨基酸，所述其他氨基酸例如形成肽或多肽，例如折叠的结构域，或者赋予该分子除了结合抗原的能力以外的另一种功能特征。本发明的特异性结合成员可以携带可检测的标记，或可以缀合至毒素或靶向性部分或酶(例如，经由肽基键或连接体)。
在进一步的方面，本发明提供了分离的核酸，其包含编码根据本发明的特异性结合成员、VH结构域和/或VL结构域或CDR的序列，以及提供了制备本发明的特异性结合成员、VH结构域和/或VL结构域或CDR的方法，所述方法包括在一定条件下表达所述核酸从而导致产生所述特异性结合成员、VH结构域和/或VL结构域、或CDR，并将其回收。
根据本发明的特异性结合成员可以在人或动物机体的治疗或诊断方法中使用，例如治疗(这可以包括预防性治疗)人患者中的疾病或病症的方法，其包括给所述患者施用有效量的本发明的特异性结合成员。根据本发明可治疗的病状包括其中TGFβ起作用的任何病状，尤其是纤维化疾病的治疗、伤口愈合的调节和癌症治疗。
更具体而言，本发明的特异性结合成员可用于在体外或体内抑制3种人TGFβ同种型中的任何一种或全部的活性。此类活性包括但不限于，TGFβ介导的信号传导，细胞外基质(ECM)沉积，抑制上皮和内 皮细胞增殖，促进平滑肌增殖，诱导III型胶原表达，诱导TGF-β、纤连蛋白、VEGF和IL-11表达，结合潜在性相关肽(Latency Associated Peptide)，肿瘤诱导的免疫抑制，促进血管发生，激活肌成纤维细胞，促进转移和抑制NK细胞活性。
本发明的特异性结合成员还可用于治疗由TGFβ活性直接或间接引起的疾病和病状。因为本发明的特异性结合成员是泛特异性的，即它们结合并抑制所有3种TGFβ同种型的活性，所以它们对于治疗涉及两种或更多种TGFβ同种型的病状和疾病(例如感染和肿瘤)以及其中希望抑制多重靶的严重病状来说是特别有利的。
特异性结合成员可用于治疗下列疾病和病状，所述疾病和病状包括，但不限于，纤维化疾病(例如肾小球肾炎、神经瘢痕化、皮肤瘢痕化、肺纤维化、肺部纤维化、辐射诱导的纤维化、肝纤维化、骨髓纤维化)、烧伤、免疫介导型疾病、炎性疾病(包括类风湿性关节炎)、移植排斥、癌症、杜普伊特伦挛缩和胃溃疡。它们还可用于治疗、预防和减少肾机能不全发生的风险，所述肾机能不全包括，但不限于：糖尿病性(I型和II型)肾病、辐射性肾病、梗阻性肾病、全身性硬皮病、肺纤维化、同种异体移植物排斥、遗传性肾脏病(例如多囊性肾病、髓质海绵肾、马蹄肾)、肾小球肾炎、肾硬化、肾钙质沉着、全身性红斑狼疮、斯耶格伦综合征、贝格尔病、系统性或肾小球性高血压、肾小管间质性肾病、肾小管性酸中毒、肾结核和肾梗死。特别地，当与肾素-血管紧张素-醛固酮系统的拮抗剂相组合时它们是有用的，所述拮抗剂包括但不限于：肾素抑制剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、Ang II受体拮抗剂(也称为“Ang II受体阻滞剂”)和醛固酮拮抗剂。使用与此类拮抗剂相组合的本发明的特异性结合成员的方法在PCT/US04/13677中阐述，其内容引入本文作为参考。
本发明的特异性结合成员还可用于治疗与ECM沉积相关的疾病和病状，所述疾病和病状包括全身性硬皮病、手术后粘连、瘢痕瘤和肥厚性瘢痕化、增生性玻璃体视网膜病变、青光眼引流手术、角膜损伤、白内障、佩罗尼病、成人呼吸窘迫综合征、肝硬化、心肌梗死后的瘢 痕化、血管成形术后的再狭窄、蛛网膜下出血后的瘢痕化、多发性硬化症、椎板切除术后的纤维化、腱及其他修复后的纤维化、由于纹身去除引起的瘢痕化、胆汁性肝硬化(包括硬化性胆管炎)、心包炎、胸膜炎、气管造口术、穿透性CNS损伤、嗜曙红性肌痛综合征、血管再狭窄、静脉闭塞性病、胰腺炎和牛皮癣性关节病。
本发明的特异性结合成员进一步可用于其中促进上皮重新形成是有益的病状。此类病状包括但不限于皮肤疾病，例如静脉曲张性溃疡，缺血性溃疡(褥疮)，糖尿病性溃疡，移植物部位，移植物供体部位，擦伤和烧伤，支气管上皮的疾病例如哮喘、ARDS，肠上皮的疾病例如与细胞毒素治疗相关的粘膜炎、食管溃疡(反流疾病(reflex disease))、胃溃疡、小肠和大肠损伤(炎性肠病)。
本发明的特异性结合成员的再进一步用途是用于其中希望内皮细胞增殖的病状中，例如在稳定动脉粥样硬化斑块、促进血管吻合愈合中，或者用于其中希望抑制平滑肌细胞增殖的病状中，例如在动脉疾病、再狭窄和哮喘中。
本发明的特异性结合成员还可用于增强针对巨噬细胞介导的感染的免疫应答，例如由利什曼虫属物种(Leishmania spp.)、克鲁兹锥虫(Trypanosorna cruzi)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)，以及原生动物鼠弓浆体(Toxoplasma gondii)，真菌荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、白色念珠菌(Candida albicans)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)和新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)，和立克次氏体(Rickettsia)例如普氏立克次氏体(R.prowazekii)、康氏立克次氏体(R.coronii)和恙虫病立克次氏体(R.tsutsugamushi)引起的那些。它们还可用于减少例如由肿瘤、AIDS或肉芽肿疾病引起的免疫抑制。
本发明的特异性结合成员进一步可用于治疗过度增生性疾病，例如癌症，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌、皮肤癌、肺癌、子宫颈癌和膀胱癌，神经胶质瘤， 间皮瘤，以及各种白血病和肉瘤，例如卡波西肉瘤，并且特别可用于治疗或预防此类肿瘤复发或转移。特别地，本发明的拮抗剂特异性结合成员可用于抑制环孢菌素介导的转移。
当然，应当意识到，在癌症治疗的情况下，“治疗”包括导致减缓肿瘤生长或减少肿瘤转移以及癌症部分缓解的任何医学干预，以便延长患者的预期寿命。
本发明的一个进一步方面提供了核酸，其一般是分离的，并且编码本文公开的抗体VH可变结构域和/或VL可变结构域。
本发明的另一方面提供了核酸，其一般是分离的，并且编码本文公开的HCDR或LCDR序列，尤其是选自SEQ ID NO：3、4、5、13、14、15、23、24和25的HCDR，或选自SEQ ID NO：8、9、10、18、19、20、28、29、30的VL CDR，最优选PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10HCDR3(分别为SEQ ID NO：5、15或25)。本文还提供了编码PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的CDRs组的核酸，编码PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的HCDRs组的核酸，以及编码PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的LCDRs组的核酸，正如提供了编码单个的CDRs、HCDRs、LCDRs，以及PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10CDRs、HCDRs、LCDRs组的核酸。
一个进一步的方面提供了用本发明的核酸转化的宿主细胞。
一个再进一步的方面提供了生产抗体VH可变结构域的方法，该方法包括导致从编码核酸进行表达。此类方法可以包括在用于生产所述抗体VH可变结构域或引起所述抗体VH结构域在体内表达的条件下培养宿主细胞。
用于生产VL可变结构域以及包括VH和/或VL结构域的特异性结合成员的类似方法作为本发明的进一步方面提供。
生产方法可以包括产物的分离和/或纯化的步骤。
生产方法可以包括将产物配制到包含至少一种另外组分例如药学上可接受的赋形剂的组合物中。
本发明的这些及其他方面在下文中进一步详细描述。
发明详述
术语
特异性结合成员
这描述了具有对于彼此的结合特异性的分子对的成员。特异性结合对的成员可以是天然衍生的或者完全或部分合成产生的。分子对的一个成员在其表面上具有区域或腔，所述区域或腔特异地结合在该分子对的另一成员表面上的区域或在其中的腔。因此，所述对的成员具有互相特异地结合的特性。本发明与结合靶抗原的特异性结合成员有关。
特异性的
这可以用于指这样的情况，即特异性结合成员将不显示任何显著的与来自给定动物的除了其特异性结合配偶体之外的其他分子的结合。例如，对人TGFβ特异的特异性结合成员与其他非TGF-β人分子将不具有显著结合，然而它可以与来自其他物种的TGF-β交叉反应。
抗原结合性特异性结合成员包括抗原结合位点。例如，特异性结合成员可以是抗体分子。抗原结合位点还可以通过将CDRs排列在非抗体蛋白质支架例如纤连蛋白或细胞色素B等上来提供(Koide等人，(1998)Journal of Molecular Biology，284：1141-1151；Nygren等人(1997)Current Opinion in Structural Biology，第7卷：463-469)。用于改造蛋白质中的新型结合位点的支架已由Nygren等人(同上)详细进行了综述。用于抗体模拟物的蛋白质支架在WO00/34784中公开，其描述了包括具有至少一个随机化环的III型纤连蛋白结构域(fibronectin type III domain)的蛋白质(抗体模拟物)。其中接枝一个或多个CDRs例如HCDRs组的合适支架可以由免疫球蛋白基因超家族的任何结构域成员提供。支架可以是人或非人蛋白质。
非抗体蛋白质支架的优点是，它可以提供在保守框架区中的抗原 结合位点，其比至少某些抗体分子更小和/或更容易制备。特异性结合成员的小尺寸可以赋予有用的生理学特性，例如进入细胞、渗透到组织深处或到达在其他结构中的靶的能力，或者在靶抗原的蛋白质腔内进行结合的能力。
非抗体蛋白质支架中的抗原结合位点的用途在Wess，2004中进行了综述。通常的是具有稳定的主链以及一个或多个可变环的蛋白质，其中环的氨基酸序列特异地或随机地突变以产生具有对于结合靶抗原而言的特异性的抗原结合位点。此类蛋白质包括来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的A蛋白、转铁蛋白、四连蛋白、纤连蛋白(例如第10个III型纤连蛋白结构域)和脂笼蛋白的IgG结合结构域。其他方法包括合成的“微体(Microbodies)”(Selecore GmbH)，其基于大环寡肽(cyclotides)，所述大环寡肽是具有分子内二硫键的小蛋白质。
除了抗体序列和/或抗原结合位点外，根据本发明的特异性结合成员可以包括其他氨基酸，所述其他氨基酸例如形成肽或多肽，例如折叠的结构域，或者赋予该分子除了结合抗原的能力以外的另一种功能特征。本发明的特异性结合成员可以携带可检测的标记，或可以缀合至毒素或靶向性部分或酶(例如，经由肽基键或连接体)。例如，特异性结合成员可以包括催化位点(例如在酶结构域中)以及抗原结合位点，其中所述抗原结合位点结合抗原并因此将所述催化位点靶向抗原。所述催化位点可以抑制该抗原的生物学功能，例如通过切割。
尽管如所注明的，CDRs可以由支架例如纤连蛋白或细胞色素B携带(Haan&Maggos，2004BioCentury，12(5)：A1-A6；Koide等人，同上；Nygren等人，同上)，但用于携带本发明的CDR或CDRs组的结构一般将具有抗体重链或轻链序列或其基本部分，在所述基本部分中所述CDR或CDRs组位于相应于由经重排的免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDRs组的位置处。免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可以通过参考Kabat,等人，1987及其最新资料来确定，所述资料现在在因特网(http： //immuno.bme.nwu.edu或使用任何搜索引擎查找“Kabat”)上可获得。
抗体分子
这描述了无论是天然的还是部分或全部合成产生的免疫球蛋白。该术语还涵盖了包括抗体的抗原结合结构域的任何多肽或蛋白质。包括抗原结合结构域的抗体片段是诸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd和双抗体的分子。
在人种系细胞的基因组中，抗体多肽链的遗传信息包含于在沿着不同染色体分散的基因座内的多个基因区段中。人重链(VH)在第14号染色体上编码，κ轻链(Vκ)在第2号染色体上编码，并且λ轻链(Vλ)在第22号染色体上编码。在B-淋巴细胞(抗体生成细胞)的发育过程中，在这些基因座中的基因区段通过重组进行装配，导致形成完整的抗体重链或轻链基因(Tonegawa S.Nature，302，575-81，1983)。抗体恒定区(VH，Vκ和Vλ)在整个人群中大部分是相同的，但在可变结构域内存在相当大的多样性。这样的多样性使得能够形成数十亿种不同的抗体，每种抗体具有对于不同靶抗原的特异性。
在抗体可变区内的多样性是以几种方式产生的。首先，在基因水平上，在抗体可变种系基因序列中存在相当大的多样性。已描述了大约50种不同的VH种系(Tomlinson I.M.等人，J.Mol.Biol.，227，776-798，1992)，35种不同的Vκ种系(Tomlinson I.M.等人，EMBO J,14,4628-38，1995)和30种不同的Vλ种系(Williams S.C.&Winter G.Eur.J.Immunol，23，1456-61，1993；Kawasaki K.等人，Genome Res，7，250-61，1997)。抗体由这些种系基因序列的不同组合产生。然后，通过诸如体细胞重组和超变的过程将进一步的多样性引入抗体可变结构域中(Tonegawa S.Nature，302，575-81，1983)。
尽管在抗体可变种系基因序列中存在相当大的多样性，但基于序列同源性可以将这些序列分组为家族。50种不同的VH基因序列可以分组为7个家族，35种Vκ序列可以分组为6个家族，和30种Vλ序列可以分组为10个家族。这些组在大小上从1个成员(VH6和Vκ4) 到至多21个成员(VH3)不等，并且每个组的成员共享高度的序列同源性。
可以将抗体与VH和VL种系序列数据库比对，以确定其最接近的种系匹配并鉴定由体细胞超变引入的任何氨基酸改变。研究已显示，人免疫系统在免疫应答过程中优先于其他种系(例如VH2)而采用某些种系(例如VH3DP47)(Knappik A.等人，J.Mol.Biol，296，57-86，2000)。然而，通过噬菌体展示分离的抗体群通常采用广泛范围的种系基因，即使当针对单一抗原进行分离时(Edwards B.等人，J.Mol Biol，334，103-118，2003)。
可以采取单克隆和其他抗体并使用重组DNA技术来产生保留原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子。此类技术可以涉及将编码免疫球蛋白可变区的DNA与恒定区连接，或将抗体的互补性决定区(CDRs)引入不同免疫球蛋白的恒定区加框架区内。参见，例如EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400，和大量后续文献。可以对杂交瘤或产生抗体的其他细胞实施基因突变或其他改变，其可以改变或不可以改变所产生的抗体的结合特异性。
因为抗体可以以多种方式进行修饰，所以术语“抗体分子”应当被解释为涵盖任何特异性结合成员或物质，所述特异性结合成员或物质具有有着所需特异性的抗体的抗原结合位点。因此，这个术语涵盖了抗体片段和衍生物，包括包含抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是完全或部分合成的。因此包括了嵌合分子，其包含与另一种多肽融合的抗体的抗原结合结构域或等价物。嵌合抗体的克隆和表达在EP-A-0120694和EP-A-0125023以及大量后续文献中描述。
在抗体改造领域中可用的进一步技术已使得能够分离人和人源化的抗体。例如，人杂交瘤可以如Kontermann等人(Kontermann R和Dubel Stefan；Antibody Engineering，Springer-Verlag New York，LLC；2001，ISBN：3540413545)所述进行制备。噬菌体展示这一用于产生特异性结合成员的另一种已建立的技术已在许多出版物例如Kontermann等人(同上)和W092/01047(下文进一步讨论)中进行 了详细描述。转基因小鼠(其中小鼠抗体基因是失活的并用人抗体基因功能性地替代，同时保持小鼠免疫系统的其他组分完整)可以用于分离针对人抗原的人抗体(Mendez等人，1997)。单克隆或多克隆的人抗体，还可在其他转基因动物例如山羊、牛、绵羊、兔等中制备。
合成的抗体分子可以通过从基因进行表达而制备，所述基因借助于合成的并在合适的表达载体内装配的寡核苷酸而产生，例如如Knappik等人(同上)或Krebs等人，Journal of Immunological Methods254200167-84所描述的。
已显示，完整抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的例子是(i)由VL、CL、VH和CHI结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CHI结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward，E.S.等人，Nature341，544-546(1989)，McCafferty等人(1990)Nature，348，552-554)；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，其是包括两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽连接体连接，所述肽连接体允许这两个结构域联合以形成抗原结合位点(Bird等人，Science，242，423-426，1988；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA85，5879-5883；1998)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09665)；和(ix)“双抗体”，其是通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO/13804；F.Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448，1993)。Fv、scFv或双抗体分子可以通过引入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定(Y.Reiter等人，Nature Biotech，14，1239-1245，1996)。还可制备包括与CH3结构域连接的scFv的小抗体(minibodies)(S.Hu等人，Cancer Res.，56，3055-3061，1996)。
dAb(结构域抗体)是抗体的小单体型抗原结合性片段，即抗体重链或轻链的可变区(Holt等人，2003)。VH dAbs在骆驼科动物(camelids)(例如骆驼，美洲驼)中天然存在，并且可以通过用靶 抗原免疫骆驼科动物、分离抗原特异性B细胞并从单个B细胞中直接克隆dAb基因来产生。dAbs还可在细胞培养中产生。其小尺寸、良好的溶解性和温度稳定性使得它们在生理学上特别有用，并适合于选择和亲和力成熟。本发明的特异性结合成员可以是dAb，其包括基本上如本文列出的VH或VL结构域，或含有基本上如本文列出的CDRs组的VH或VL结构域。
当使用双特异性抗体时，这些可以是常规的双特异性抗体，其可以以各种方式进行制备(Holliger，P.和Winter G.Current Opinion Biotechnol.4，446-449(1993))，例如采用化学方法或由杂种杂交瘤制备，或者可以是上文提及的双特异性抗体片段中的任何一种。双特异性抗体的例子包括BiTE^TM技术的那些，其中可以使用具有不同特异性的两种抗体的结合结构域，并将它们经由柔性短肽直接连接。这将两种抗体组合在短的单个多肽链上。只使用可变结构域可以构建不含Fc区的双抗体和scFv，这有效地减少了抗独特型反应的影响。
双特异性双抗体，与双特异性完整抗体不同，也可以是特别有用的，因为它们可以容易地在大肠杆菌(E.coli)中构建并表达。使用噬菌体展示(W094/13804)从文库中可以容易地选择出具有合适的结合特异性的双抗体(以及许多其他多肽例如抗体片段)。如果双抗体的一个臂保持恒定，例如，具有针对TGFβ的特异性，那么就可以制备文库，其中另一个臂是可变的，并且可以选择出具有合适的特异性的抗体。双特异性完整抗体可以通过knobs-into-holes改造进行制备(C.E.B.Ridgeway等人，Protein Eng.，9，616-621，1996)。
抗原结合位点
这描述了特异性结合成员例如抗体分子的一部分，其接触并与结合对中的另一个成员即抗原的部分或全部互补。在抗体分子中，抗原结合位点可以称为抗体抗原-结合位点，并包括特异地结合并与靶抗原全部或部分互补的抗体的一部分。当抗原很大时，抗体可以只结合抗原的特定部分，这个部分称为表位。
抗原结合结构域
抗原结合结构域是特异性结合成员的一部分，其包括抗原结合位点并结合靶抗原。在某些实施方案中，抗原结合结构域可以由一个或多个抗体可变结构域(例如，由VH结构域组成的所谓的Fd抗体片段)或其抗原结合部分提供。在某些实施方案中，抗原结合结构域包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
特异性结合成员可以是天然地或通过各种真核细胞系统(例如，CHO或NS0(ECACC85110503)细胞)糖基化的，或它们可以是(例如，如果通过在原核细胞中表达而产生)未糖基化的。还可以有意地改变糖基化，例如通过抑制岩藻糖基化，以便增加所得抗体的ADCC活性。因此，本发明的特异性结合成员中的任何一个可以如此表达以便最小化或消除岩藻糖基化。
在某些实施方案中，本发明的CDR或VH或VL结构域将会与其序列被在本文中列出的指定区域等同或高度类似。预期可以在CDR和/或VH或VL结构域中进行1－5，优选1－4或1或2，或3或4个氨基酸置换。高度类似于其序列被在本文中给出的那些的VH或VL结构域以及CDRs和CDRs组由本发明的方面所涵盖，正如其序列基本上如本文列出的那些一样。
用于携带本发明的CDR或CDRs组的结构一般将具有抗体重链或轻链序列或其基本部分，在所述基本部分中所述CDR或CDRs组位于相应于由经重排的免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDRs组的位置处。免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可以通过参考Kabat，E.A.等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest.第四版.US Department of Health and Human Services.1987)及其最新资料来确定，所述资料现在在因特网(http：//immuno.bme.nwu.edu或使用任何搜索引擎查找“Kabat”)上可获得。CDRs根据Kabat等人进行定义。
CDRs还可由其他支架例如纤连蛋白或细胞色素B携带。
优选地，携带基本上如本文列出的CDR氨基酸序列作为在人可变结构域或其基本部分中的CDR。基本上如本文列出的HCDR3序列代表 了本发明的优选实施方案，并且优选地，携带这些中的每一个作为在人重链可变结构域或其基本部分中的HCDR3。
本发明中采用的可变结构域可以由任何种系或重排人可变结构域获得或衍生，或者可以是基于已知人可变结构域的共有或实际序列的合成的可变结构域。可以使用重组DNA技术将本发明的CDR序列(例如CDR3)引入缺乏CDR(例如CDR3)的可变结构域储库中。优选的种系框架已在本文中进行了鉴定。
例如，Marks等人(Bio/Technology，1992，10：779-783)描述了产生抗体可变结构域储库的方法，其中指向或邻近可变结构域区域5'端的共有引物(consensus primers)与针对人VH基因的第3个框架区的共有引物结合使用，以提供缺乏CDR2的VK可变结构域储库。Marks等人进一步描述了这个储库如何可以与特定抗体的CDR2相组合。使用类似技术，本发明的CDR3-衍生的序列可以与缺乏CDR3的VH或VL结构域储库进行改组，并且经改组的完整VH或VL结构域与同族(cognate)VL或VH结构域相组合以提供本发明的特异性结合成员。然后，储库可以在合适的宿主系统中展示，例如WO92/01047的噬菌体展示系统，或大量后续文献中的任何一个，包括Kay，B.K.，Winter，J.和McCafferty，J.(1996)Phage Display of Peptides andProteins：A Laboratory Manual，San Diego：Academic Press，从而使得可以选择合适的特异性结合成员。储库可以由10⁴个单个成员以上组成，例如10⁶至10⁸或10¹⁰个成员。其他合适的宿主系统包括酵母展示、细菌展示、T7展示、核糖体展示、共价展示等等。
类似的改组或组合技术还由Stemmer(Nature，1994，370：389-391)公开，他描述了与β-内酰胺酶基因有关的技术，但评述到该方法可以用于产生抗体。
进一步的备选方案是产生携带本发明的CDR-衍生的序列的新型VH或VL区，其中使用一个或多个所选择的VH和/或VL基因的随机诱变以产生在完整的可变结构域内的突变。此类技术由Gram等人(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89：3576-3580)描述，他们使用易 错PCR。在优选实施方案中，在HCDRs和/或LCDRs组中进行1个或2个氨基酸置换。
可以使用的另一种方法是将诱变导向VH或VL基因的CDR区。此类技术由Barbas等人(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：3809-3813)和Schier等人(1996，J.Mol.Biol.263：551-567)公开。
所有上述技术是在本领域中本身已知的，并且其自身不构成本发明的一部分。在已知本文提供的公开内容的情况下，技术人员将能够使用此类技术来通过使用本领域的常规方法提供本发明的特异性结合成员。
本发明的一个进一步方面提供了用于获得对TGFβ抗原特异的抗体的抗原结合位点的方法，该方法包括通过在本文列出的VH结构域的氨基酸序列中添加、删除、置换或插入一个或多个氨基酸来提供作为所述VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，任选地将如此提供的VH结构域与一个或多个VL结构域相组合，并测试VH结构域或VH/VL组合以鉴定对TGFβ特异并任选地具有一个或多个优选特性的特异性结合成员或抗原结合结构域，所述一个或多个优选特性优选为中和TGFβ活性的能力。所述VL结构域可以具有基本上如本文列出的氨基酸序列。
可以采用类似方法，其中本文公开的VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域相组合。
在一个优选实施方案中，可以对PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH结构域实施突变以提供一个或多个VH结构域氨基酸序列变体，其可以与一个或多个VL结构域相组合。
本发明的一个进一步方面提供了用于制备对所有3种人TGFβ同种型特异的特异性结合成员，所述方法包括：
(a)提供编码VH结构域的核酸的起始储库，所述VH结构域包括待被替代的CDR3或缺乏CDR3编码区；
(b)将所述储库与编码基本上如本文对于HCDR3而列出的氨基酸 序列的供体核酸组合，从而使得所述供体核酸插入储库的CDR3区内，以便提供编码VH结构域的核酸的产物储库；
(c)表达所述产物储库的核酸；
(d)选择对至少一种TGFβ同种型特异的特异性结合成员；和
(e)回收所述特异性结合成员或编码其的核酸。
该方法可以进一步包括下述步骤：用3种TGFβ同种型中的每一种进行结合测定法和中和测定法，以鉴定结合并中和所有3种同种型的特异性结合成员。
此外，可以采用类似方法，其中本发明的LCDR3与编码VL结构域的核酸的储库相组合，所述VL结构域包括待被替代的CDR3或缺乏CDR3编码区。
类似地，一个或多个，或所有3个CDRs可以接枝到VH或VL结构域的储库中，随后对它们进行筛选以获得对所有人TGFβ同种型特异的特异性结合成员。
VH结构域可以具有种系序列，并且在一个优选实施方案中是DP-10或DP-88。VL结构域序列可以具有种系序列，并且在一个优选实施方案中是DPK-22。
在一个优选实施方案中，可以采用PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一个或多个，或PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的HCDRs组，和/或PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一个或多个，或PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的LCDRs组。
免疫球蛋白可变结构域的基本部分将包括至少所述3个CDR区，连同它们的间插框架区。优选地，该部分将还包括第1个和第4个框架区中任一个或两个的至少约50％，该50％是第1个框架区的C-末端50％和第4个框架区的N-末端50％。在可变结构域的基本部分的N-末端或C-末端的另外残基可以是通常不与天然存在的可变结构域区域相关联的那些。例如，通过重组DNA技术进行的本发明特异性结合成员的构建可以导致引入由被导入以促进克隆或其他操作步骤的连 接体编码的N-或C-末端残基。其他操作步骤包括导入连接体以将本发明的可变结构域连接至包括免疫球蛋白重链的进一步的蛋白质序列、其他可变结构域(例如在双抗体的产生中)或蛋白质标记，如本文其他地方更详细地讨论的。
尽管在本发明的优选方面，包括VH和VL结构域对的特异性结合成员是优选的，但基于VH或VL结构域序列的单一结合结构域构成了本发明的进一步方面。已知单一免疫球蛋白结构域，尤其是VH结构域，能够以特异的方式结合靶抗原。
在任一种单个特异性结合成员的情况下，这些结构域可以用于筛选能够形成二结构域特异性结合成员的互补结构域，所述二结构域特异性成员能够结合3种人TGFβ同种型。
这可以通过噬菌体展示筛选方法，使用如WO92/01047中公开的所谓的梯级双重组合方法(hierarchical dual combinatorial approach)来完成，其中包含H或L链克隆的单个集落用于感染编码另一链(L或H)的完整克隆文库，并且根据噬菌体展示技术例如在那个参考文献中所描述的那些来选择所得的二链特异性结合成员。这项技术还在Marks等人(同前)中公开。
本发明的特异性结合成员可以进一步包括抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可以以其C-末端附着至抗体轻链恒定结构域，包括人C_κ或C_λ链，优选C_κ链。类似地，基于VH结构域的特异性结合成员可以以其C-末端附着至免疫球蛋白重链的所有或部分(例如CH1结构域)，所述免疫球蛋白重链源自任何抗体同种型，例如IgG、IgA、IgE和IgM，以及同种型亚类中的任何一种，优选IgG1和IgG4。IgG4是优选的。IgG4对于某些应用是优选的，因为它不结合补体并且不产生效应子功能。当效应子功能是希望的时，IgG1是优选的。效应子功能还可通过采用本领域已知的方法，经由操控抗体的糖基化状态例如通过减少岩藻糖含量而增加。重链可以具有或不具有C-末端赖氨酸残基。具有这些特性并稳定可变区的任何合成或其他恒定区变体对于在本发明的实施方案中使用来说也是优选的。
也在本发明内的是本文公开的特异性结合成员或其抗原结合片段的异质性制备物。例如，此类制备物可以是抗体的混合物，所述抗体具有全长重链和缺乏C-末端赖氨酸的重链，具有各种程度的糖基化，具有衍生的氨基酸(例如N-末端谷氨酸环化以形成焦谷氨酸残基)和/或具有脱酰胺形式的重链和/或轻链。
本发明的特异性结合成员可以用可检测的或功能性的标记进行标记。可检测的标记包括放射性标记，例如¹³¹I或⁹⁹TC，其可以使用抗体成像领域中已知的常规化学附着至本发明的抗体。标记还包括酶标记例如辣根过氧化物酶。标记进一步包括化学部分，例如生物素，其可以经由与特异性同族可检测部分例如经标记的抗生物素蛋白结合而进行检测。
本发明的特异性结合成员被设计成在人或动物受试者(优选人)的诊断或治疗方法中使用。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合成员抑制TGFβ1、2和/或3与细胞表面TGFβ受体或受体复合物(包括，但不限于，包括受体丝氨酸/苏氨酸激酶I型或II型和蛋白聚糖β-聚糖(TGFβIII型受体)的复合物)的结合。因此，本发明包括用于抑制TGFβ与细胞表面TGFβ受体或受体复合物的结合的方法，包括使TGFβ与本发明的特异性结合成员接触并检测与所述受体或受体复合物结合的抑制的步骤。在各种实施方案中，TGFβ与其受体结合的抑制可以通过下列表明：TGFβI型受体的磷酸化减少、TGFβI型受体的激活减少、R-SMAD蛋白特别是SMAD2和SMAD3的磷酸化和/或激活减少、所述SMAD蛋白至细胞核的移位减少、SMAD蛋白与DNA的结合减少和/或基因表达的调节，所述基因在所述细胞或细胞类型中的表达已知通过TGFβ信号传导进行调节。进一步的测定法在实施例中阐述。
因此，本发明的进一步方面提供了包括施用所提供的特异性结合成员的治疗方法，包含此类特异性结合成员的药物组合物，以及此类特异性结合成员在制备用于施用的药物中的用途，例如在制备药物或药物组合物的方法中，该方法包括用药学上可接受的赋形剂配制所述 特异性结合成员。
本发明的特异性结合成员可以通过注射(例如皮下、静脉内、腔内(例如肿瘤切除术后)、损伤内、腹膜内或肌内)，通过吸入，或局部(例如眼内、鼻内、直肠、伤口内、皮肤上)或口服施用。施用途径可以通过产品的物理化学特征，通过疾病的特别考虑，通过剂量或给药间隔，或者通过对于优化功效或最小化副作用的要求来确定。
设想抗TGFβ治疗将不限于由卫生保健专业人士施用。因此，皮下注射，尤其是使用不含针头的装置，可以是适当的。
根据本发明，所提供的组合物可以施用给有此需要的个体。施用优选以“治疗有效量”，这足以显示对患者的利益。此类利益可以是至少改善特定疾病或病症的至少一种症状。所施用的实际量，以及施用率和时间过程，将取决于被治疗的疾病的性质和严重度。治疗处方，例如关于剂量等的决定，可以基于临床前和临床研究来确定，所述研究的设计完全在本领域技术人员的水平内。
精确剂量将取决于许多因素，包括所述抗体是用于诊断还是用于治疗，待治疗区域的大小和位置，抗体的精确性质(例如，完整抗体、片段或双抗体)，以及附着至所述抗体的任何可检测标记或其他分子的性质。一般的抗体剂量对于全身应用来说将是100μg－1mg，并且对于局部应用来说将是1μg－1mg。一般地，抗体将是完整的抗体，优选IgG4同种型。这是对于成人患者的单一治疗的剂量，对于儿童和婴儿它可以按比例调整，并且还可以对于其他抗体形式按分子量和活性而成比例地调整。根据医师的判断，治疗可以按每天一次、每周二次、每周一次、每月一次或其他时间间隔重复。在本发明的优选实施方案中，治疗是周期性的，并且施用之间的时期是约2周或更多，优选约3周或更多，更优选约4周或更多，或约一月一次。
本发明的特异性结合成员将通常以药物组合物的形式施用，其可以包含除特异性结合成员以外的至少一种组分。
因此，除活性成分以外，根据本发明的并依据本发明进行使用的药物组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲质、稳定剂 或本领域技术人员众所周知的其他材料。此类材料应当是非毒性的并且不应干扰活性成分的功效。此类材料可以包括，例如任何一种和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂以及生理学相容的物质等。药学上可接受的载体的一些例子是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及其组合。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钠将是优选的。药学上可接受的物质的另外例子是湿润剂或少量辅助物质例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲质，其增强抗体的保存期或效用。载体或其他材料的精确性质将取决于施用途径，所述施用途径可以是口服、局部、通过吸入或通过注射，例如静脉内。在一个优选实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射进行施用。在另一优选实施方案中，抗体通过肌内或皮下注射进行施用。
用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂或液体形式，例如含有惰性稀释剂或可同化的可食用载体。片剂可以包含固体载体例如明胶或佐剂。液体药物组合物一般包含液体载体例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖类溶液或者二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。特异性结合成员(需要时，以及其他成分)还可包封在硬或软壳明胶胶囊内，压缩成片剂，或直接掺入受试者饮食中。对于口服治疗施用，活性成分可以与赋形剂相掺合，并以可吸收的片剂(ingestible tablets)、颊含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式进行使用。为了通过除肠胃外施用以外的其他方式施用本发明的化合物，可能必需用防止其失活的材料包被所述化合物或将所述化合物与所述材料共施用。
对于静脉内注射，或在痛苦部位注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液的形式，其是无热原的并且具有合适的pK、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员将十分能够例如使用等渗媒介物例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸盐林格注射液来制备合适的溶液。需要时，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲质、抗氧化剂和/或其他添加剂。
组合物可以单独或与其他治疗相组合地同时或顺次施用，这取决于被治疗的病状。
本发明的特异性结合成员可以以液体、半固体或固体形式进行配制，例如液体溶液(例如，可注射的和可输注的溶液)、分散系或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于所希望的施用形式、治疗应用、所述分子的物理化学特性和递送途径。制剂可以包含赋形剂、或赋形剂的组合，例如：糖、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可以包含广泛范围的抗体浓度和pH。固体制剂可以通过例如冻干、喷雾干燥、或经超临界流体技术进行干燥来生产。
通常，治疗组合物在制造和贮存条件下必须是无菌的和稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳液、分散系、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可以通过下列方式制备：在需要时将在合适溶剂中的所需量的特异性结合成员与上文列举的一种成分或成分组合相掺合，随后过滤灭菌。一般地，分散系通过将活性化合物整合入无菌媒介物中进行制备，所述无菌媒介物包含基础分散介质和来自上文列举的那些中的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这种干燥方式从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。溶液的合适流动性可以通过下列方式来维持：例如，通过使用包衣例如卵磷脂，在分散系的情况下通过维持所需颗粒大小，和通过使用表面活性剂。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶可以导致可注射组合物的吸收延长。
在某些实施方案中，抗体组合物活性化合物可以用保护抗体不被快速释放的载体进行制备，例如受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊化的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法是被授予专利权的，或者一般是本领域技术人员已知的。参见，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(J.R.Robinson，ed.，Marcel  Dekker，Inc.，New York，1978)。
本发明提供了包括引起或允许本文提供的特异性结合成员结合TGFβ的方法。如所注明的，此类结合可以在体内发生，例如在给患者施用特异性结合成员或编码特异性结合成员的核酸后，或者它可以在体外发生，例如在ELISA、蛋白质印迹法、免疫细胞化学、免疫沉淀、亲和层析、或基于细胞的测定法中，或者在基于离体的治疗方法(例如，其中将细胞或体液离体与根据本发明的特异性结合成员接触并随后施用给患者的方法)中。
可以测定与TGFβ结合的特异性结合成员的量。定量结果可以与测试样品中的抗原量相关，这可能具有诊断意义。
还提供了包括根据本发明任何方面或实施方案的特异性结合成员或抗体分子的试剂盒，作为本发明的一个方面。在本发明的试剂盒中，特异性结合成员或抗体分子可以进行标记以允许测定其在样品中的反应性，例如，如下文进一步描述的。试剂盒的组分一般是无菌的并且在密封的小瓶或其他容器中。试剂盒可以在诊断分析或其中抗体分子是有用的其他方法中采用。试剂盒可以包含关于在方法例如根据本发明的方法中使用所述组分的说明书。帮助或使得能够执行此类方法的辅助材料可以包括在本发明的试剂盒内。
样品中抗体的反应性可以通过任何合适的方法进行测定。放射免疫测定法(RIA)是一种可能性。将放射性标记的抗原与未标记的抗原(测试样品)混合并允许其结合抗体。将结合的抗原与未结合的抗原在物理上分离，并且测定与抗体结合的放射性抗原的量。测试样品中的抗原越多，与抗体结合的放射性抗原就越少。竞争结合测定法还可与非放射性抗原一起使用，使用与报告分子连接的抗原或类似物。报告分子可以是具有光谱学上分开的吸收或发射特征的荧光染料、磷光体或激光染料。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白或德克萨斯红。合适的生色染料包括二氨基联苯胺。
其他报告物包括大分子胶粒或颗粒材料例如胶乳珠，它们是有色、磁性或顺磁性的，以及可以直接或间接引起可被肉眼观察、被在电子 学上检测或记录的可检测信号的生物学或化学活性剂。这些分子可以是例如催化反应的酶，所述反应产生或改变颜色或者引起电特性的改变。它们可以是可分子激发的(molecularly excitable)，从而使得能态之间的电子跃迁导致特征性的光谱吸收或发射。它们可以包括与生物传感器结合使用的化学实体。可以采用生物素/抗生物素蛋白或生物素/链霉抗生物素蛋白和碱性磷酸酶检测系统。通过单个抗体-报告物缀合物产生的信号可以用于衍生在样品(正常和测试)中相关抗体结合的可定量的绝对或相对数据。
本发明还提供了如上的特异性结合成员用于测量竞争测定法中的抗原水平的用途，也就是说通过在竞争测定法中采用本发明所提供的特异性结合成员来测量样品中抗原水平的方法。这可以是结合的与未结合的抗原的物理分离不是必需的情况。将报告分子与特异性结合成员连接，从而在结合后发生物理或光学改变，是一种可能性。报告分子可以直接或间接产生可检测的并优选可测量的信号。报告分子的连接可以是直接或间接的、共价的(例如经由肽键)或非共价的。经由肽键的连接可能是编码抗体和报告分子的基因融合物的重组表达的结果。
本发明还提供了，例如在生物传感器系统中通过采用根据本发明的特异性结合成员来直接测量抗原水平。
测定结合的方式不是本发明的特征，并且本领域技术人员能够根据其偏好和一般知识选择合适的方式。
如所注明的，在各个方面和实施方案中，本发明扩展至人、人源化、嵌合或合成的特异性结合成员，其与本文定义的任何特异性结合成员例如PET1037GR、PET1074B9或ET1287A10IgG4竞争结合TGFβ(TGFβ1、2和/或3)。结合成员之间的竞争或交叉竞争可以在体外容易地进行测定，例如通过将特异性报告分子标记至一个结合成员，其可以在其他未标记的结合成员存在下进行检测，从而使得能够鉴定结合相同表位或重叠表位的特异性结合成员。
可以使用例如ELISA来测定竞争，其中TGFβ被固定至平板，并 且将第一种经标记的结合成员(参照结合成员)连同一种或多种其他未标记的结合成员一起加入平板中。通过由经标记的结合成员发出的信号减少而观察到与经标记的结合成员进行竞争的未标记的结合成员的存在。
在竞争测试中，可以采用抗原的肽片段，特别是包括目的表位的肽。可以使用具有表位序列加上在任何一个末端的一个或多个氨基酸的肽。此类肽可以说“基本上由指定序列组成”。根据本发明的特异性结合成员可以是这样的，即它们与抗原的结合被具有或包括给定序列的肽所抑制。在为此的测试中，可以使用具有任一序列加上一个或多个氨基酸的肽。
结合特定肽的特异性结合成员可以例如通过用所述肽进行淘选而从噬菌体展示文库中分离。
本发明进一步提供了编码本发明的特异性结合成员的分离的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。在一个优选方面，本发明提供了这样的核酸，其编码如上定义的本发明的CDR或CDRs组，或抗体抗原-结合位点，或VH结构域或VL结构域，或抗体分子，例如scFv或IgG4。
本发明还提供了质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，其包括至少一个如上的多核苷酸。
本发明还提供了重组宿主细胞，其包含一种或多种如上的构建体。编码所提供的任何CDR或CDRs组或VH结构域或VL结构域或抗原结合位点或抗体分子例如scFv或IgG4的核酸，其自身形成本发明的一个方面，正如生产所编码的产物的方法一样，所述方法包括从编码其的核酸进行表达。表达可以方便地通过在适当条件下培养包含所述核酸的重组宿主细胞来实现。在通过表达而产生后，VH或VL结构域，或特异性结合成员，可以使用任何合适的技术进行分离和/或纯化，随后在适当时进行使用。
根据本发明的特异性结合成员、VH和/或VL结构域以及编码性核酸分子和载体可以以基本上纯或同质的形式被提供为分离和/或纯化的形式(例如从其天然环境中)，或在核酸的情况下，不含或基本上 不含除编码具有所需功能的多肽的序列以外的其他核酸或基因来源。根据本发明的核酸可以包括DNA和RNA，或可以是完全或部分合成的。当提及本文列出的核苷酸序列时，涵盖了具有指定序列的DNA分子，并涵盖了具有其中U代替T的指定序列的RNA分子，除非上下文在其他方面要求。
用于在各种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌、酵母和转基因植物和动物。本领域可用的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚肾细胞、人胚视网膜细胞以及许多其他细胞。常用的、优选的细菌宿主是大肠杆菌。
抗体和抗体片段在原核细胞例如大肠杆菌中的表达是本领域中良好建立的。关于综述，参见例如Plückthun，A.Bio/Technology9：545-551(1991)。在培养的真核细胞中的表达对于本领域技术人员也是可用的，这可作为用于生产特异性结合成员的一个选择，例如Chadd HE和Chamow SM(2001)110Current Opinion in Biotechnology12：188-194；Andersen DC和Krummen L(2002)Current Opinion in Biotechnology13：117；Larrick JW和Thomas DW(2001)Current Opinion in Biotechnology12：411-418。
可以选择或构建合适的载体，其包含合适的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因以及其他合适序列。适当地，载体可以是质粒，病毒例如噬菌体或噬菌粒、或腺病毒、AAV、慢病毒等。关于进一步的细节，参见例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Sambrook和Russell，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press。用于操作核酸的许多已知技术和规程，例如核酸构建体的制备、诱变、测序、将DNA导入细胞和基因表达，以及蛋白质分析在Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等人(编者)，John Wiley&Sons，1986；Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人(编者)，John Wiley&Sons，第四版，1999中详细描述。Sambrook等人和Ausubel等人(两者)的公开内容引入本文作为参考。
因此，本发明的一个进一步的方面提供了包含本文所公开的核酸的宿主细胞。此类宿主细胞可以处于体外或者可以是培养的。此类宿主细胞可以处于体内。所述宿主细胞的体内存在可以允许本发明的特异性结合成员作为“胞内抗体”或细胞内抗体进行胞内表达。胞内抗体可以用于基因治疗(Marasco WA(1997)Gene Therapy，4(1)：11)。
一个再进一步的方面提供了包括将此类核酸导入宿主细胞的方法。所述导入可以采用任何可用的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran、电穿孔、脂质体介导的转染、和使用逆转录病毒或其他病毒(例如牛痘，或对于昆虫细胞来说是杆状病毒)的转导。将核酸导入宿主细胞中，特别是真核细胞中，可以使用病毒系统或基于质粒的系统。质粒系统可以保持游离状态或可以引入宿主细胞中或人工染色体中(Csonka E等人(2000)Journal of Cell Science，113：3207-3216；Vanderbyl S等人(2002)Molecular Therapy，5(5)：10。所述引入可以是将一个或多个拷贝随机地或靶向整合在单个或多个基因座上。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。
导入之后可以是引起或允许从所述核酸的表达，例如通过在用于表达该基因的条件下培养宿主细胞。
在一个实施方案中，将本发明的核酸整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)中。可以依据标准技术通过包含促进与基因组重组的序列来促进整合。
本发明还提供了方法，其包括在表达系统中使用如上所述的构建体，以便表达如上的特异性结合成员或多肽。
本发明的核酸分子可以经由基因疗法施用给有此需要的患者。该 疗法可以是体内的或离体的。在一个优选的实施方案中，将编码重链和轻链的核酸分子施用给患者。在一个更优选的实施方案中，核酸分子是这样施用的，即使得它们稳定整合到B细胞的染色体中，因为这些细胞专门用于产生抗体。在一个优选的实施方案中，前体B细胞是离体转染或感染的，并再移植到有此需要的患者中。在另一实施方案中，前体B细胞或其他细胞使用已知感染目的细胞类型的病毒进行体内感染。用于基因疗法的通常载体包括脂质体、质粒和病毒载体。示例性病毒载体是逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒。体内或离体感染后，抗体表达的水平可以通过从接受治疗的患者获取样品并使用本领域已知或本文讨论的任何免疫测定法进行监控。在基因治疗中使用抗-TGFβ抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利5,824,655(Border)，其整体引入本文作为参考。
在一个优选实施方案中，基因治疗方法包括施用分离的核酸分子并表达所述核酸分子的步骤，所述核酸分子编码抗-TGFβ抗体的重链或其抗原结合部分。在另一实施方案中，基因治疗方法包括施用分离的核酸分子和表达所述核酸分子的步骤，所述核酸分子编码抗-TGFβ抗体的轻链或其抗原结合部分。在一个更优选的方法中，基因治疗方法包括下列步骤：施用编码抗-TGFβ抗体的重链或其抗原结合部分的分离的核酸分子和编码抗-TGFβ抗体的轻链或其抗原结合部分的分离的核酸分子，以及表达所述核酸分子。
物种与物种之间的剂量校正一般只需要对于体重进行调整，如果活性剂是在血管系统中或附近起作用的抗体。在急性情况下，本发明抗体的有效剂量在大鼠和小鼠中为0.5－5mg/kg。因此，对于长期按剂量给药，可能考虑以半衰期(预期在人中为21天)施用0.3－10mg/kg。优选的剂量对于功效是足够的，但对于促进最佳施用来说足够低。例如，少于50mg的剂量有利于皮下施用。静脉内施用在早期临床试验中是优选的，并且可以用作严重疾病的递送途径，如果剂量高并且给药间隔长。皮下注射一般比静脉内递送更方便，因为它允许自我施用。然而，皮下注射有可能增加针对产物的任何免疫应答。对于 局限性疾病，局部施用可以最小化所需产物的量并最大化作用位点的浓度。通过局部施用可以赋予显著的安全性(治疗窗口)优点，避免可能由长期全身施用发展出的任何潜在的副作用。
根据本公开内容(包括下列实验性例证)，本发明的进一步的方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本说明书任何地方提及的所有文件引入作为参考。
实施例1
抗-TGFβScFvs的产生
ScFv幼稚(naive)抗体文库
将从20个供体的脾脏淋巴细胞获得并克隆到噬菌粒载体中的大单链Fv(scFv)人抗体文库(Hutchings等人，2001)用于选择。
ScFv指导的选择文库
构建1D11.16VH-人VL文库并用于选择具有所需结合特性的小鼠-人嵌合抗体。然后，将来自这些嵌合抗体的人轻链克隆到人VH-VL和人VH(1D11CDR3)－VL受者文库中。在这些文库中筛选具有所需结合特性的人抗体。
ScFv噬菌体文库的选择
重组人TGFβ1和TGFβ2由Genzyme Corp.(Framingham，MA)供应，并且TGFβ3购自R&D Systems。
从scFv指导的选择文库中分离出识别TGFβ的ScFvs，随后基本上如Vaughan等人(1996)中描述的在重组人TGFβ上进行一系列反复选择循环。简言之，在与文库孵育后，已预偶联至顺磁性珠且结合噬菌体的固定化抗原通过磁性分离进行回收，同时洗掉未结合的噬菌体。然后，结合的噬菌体如Vaughan等人(1996)所述进行营救，并且重复选择过程。
根据制造商的建议使用与Dynabeads M-270胺(Dynal)偶联的TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3进行选择。备选地，选择使用生物素化的 TGFβ1或TGFβ2，其根据制造商的说明书(EZ link NHS LC Biotin，Pierce)使用伯胺特异性试剂琥珀酰亚胺基-6-(biotinannido)己酸酯来制备。
来自选择过程的输出作为周质制备物在基于竞争测定法的高通量筛选中进行测试，所述竞争测定法测量所述周质制备物中存在的scFvs与1D11.16或重组人TGFβ可溶性受体II-Fc嵌合体(sRII,R&D Systems)竞争结合TGFβ的能力。
如Vaughan等人(1996)和Osbourn等人(1996)中所述，对在高通量筛选中与1D11.16或sRII竞争的样品实施DNA测序。克隆被表达并纯化为scFvs或IgGs，并且分别如实施例4和5中所述评估其在MLEC和/或NHLF测定法中中和TGFβs的能力。如WO01/66754的实施例3中所述制备纯化的scFv制备物。使用BCA法(Pierce)测定纯化的scFv制备物的蛋白质浓度。如下文实施例3中所述，制备纯化的IgG制备物。
实施例2
抗-TGFβscFvs的优化
如实施例1中所述产生出结合并中和TGFβ的ScFvs。使用DNA诱变和/或组合技术来增加这些抗体对TGFβ1和/或TGFβ2和/或TGFβ3的中和效力。基本上如实施例1中所述，通过选择和筛选噬菌体抗体文库产生出对TGFβ1和/或TGFβ2和/或TGFβ3的效力明显改善的抗体。产生的scFvs在MLEC增殖测定法中与1D11.16进行比较。
发现特定种系在高效力的TGFβ中和性scFvs群体中具有高度代表性。这些对于重链来说为DP-10/1-69和DP-88/1-e(两者都是VH1种系家族的成员)，和对于轻链来说为DPK22/A27(V_κ3家族)。这些种系似乎提供了特别适合于高效力的TGFβ泛中和性抗体的结构框架。这是不可预测的，因为1D11.16VH基因区段最接近人种系DP-7，并且1D11.16VL基因区段最接近人种系L16。
在MLEC增殖测定法中，PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10scFvs显示的效力接近或超过1D11.16对所有3种TGFβ同种型的效力。
将PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10VH和VL基因区段的衍生氨基酸序列与VBASE数据库(Tomlinson等人，1997)中已知的人种系序列进行比对，并且通过序列相似性鉴定出了最接近的人种系。对于PET1073G12和PET1074B9的VH基因区段来说最接近的人种系基因被鉴定为DP-10/1-69(VH1种系家族)，和对于PET1287A10的VH基因区段来说最接近的人种系基因被鉴定为DP-88/1-e(VH1种系家族)。对于PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10的VL基因区段来说最接近的人种系基因被鉴定为DPK22/A27(V_κ3种系家族)。使用定点诱变来将不同于种系的框架残基改变为种系残基，条件是此类改变不引起所得到的抗体在MLEC增殖测定法中对任何TGFβ同种型的效力丧失超过3倍。如果观察到此类效力丧失，那么将非种系框架氨基酸保留在最终抗体中。
在种系化的PET1073G12和种系化的PET1074B9中，所有框架残基是种系，除了VH中的两个残基和VL中的一个残基外。对于种系化的PET1073G12的氨基酸序列，关于VH在SEQ ID NO：2中描述，和关于VL在SEQ ID NO：7中描述。对于种系化的PET1074B9的氨基酸序列，关于VH在SEQ ID NO：12中描述，和关于VL在SEQ ID NO：17中描述。
在种系化的PET1287A10中，所有VH和VL框架残基是种系。对于种系化的PET1287A10的氨基酸序列，关于VH在SEQ ID NO：22中描述，和关于VL在SEQ ID NO：27中描述。
实施例3
IgG4s的产生
通过将它们的VH和VL结构域分别亚克隆到表达完整抗体重链和 轻链的载体中，而将种系化的scFvs PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10从scFv形式转化为IgG4形式。从pCantab6这一表达scFv的载体扩增出VH基因区段，并克隆到包含人γ4重链恒定结构域和调节元件的pEU8.1(+)载体中，以在哺乳动物细胞中表达完整的重链。类似地，从pCantab6这一表达scFv的载体扩增出VL基因区段，并克隆到包含人κ轻链恒定结构域和调节元件的pEU3.1(-)载体中，以在哺乳动物细胞中表达完整的轻链。pEU3.l(-)和pEU8.1(+)载体基于Persic等人(1987)描述的载体，并进行修饰以导入oriP序列以增加产生的抗体的产量(Shen.等人，1995；Langle-Rouault等人，1998)。克隆后，所有3种抗体的VH和VL结构域进行测序以证实在克隆过程中没有导入突变。
将用于表达PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10重链和轻链的载体转染到EBNA-293细胞(Invitrogen)中。在细胞上清液中基因表达和分泌后，PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10IgG4通过A蛋白亲和层析(Amersham)进行纯化。将纯化的抗体制备物无菌过滤，并在评估前于4℃贮存于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。使用基于如Mach等人(1992)中描述的IgG氨基酸序列的消光系数，采用分光光度测定法来测定IgG浓度。使用Biosep-SEC-S2000柱(Phenomenex)通过SEC-HPLC来分析纯化的IgG以检查蛋白质的聚集或降解。分别如实施例4和5中所述，将重定格式的人IgG4完整抗体在基于MLEC和NHLF细胞的测定法中与1D11.16抗体进行比较。
实施例4
在TGFβ依赖性MLEC增殖测定法中抗-TGFβ抗体的中和效力
使用貂肺上皮细胞(MLEC)增殖测定法来评估纯化的抗体制备物针对人TGFβ生物活性的中和效力。
MLEC增殖测定法基于Danielpour等人(1989a)描述的测定法。该测定法根据下述原理工作：当将TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3加入貂 肺上皮细胞中时，这引起血清诱导的细胞增殖的抑制。测试抗体中和TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3从而致使细胞增殖恢复。通过[³H]-胸苷的摄入来测量增殖。抗体的效力定义为以50％(IC₅₀)的水平中和单一浓度的TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3的抗体浓度，单位为nM。
MLEC增殖测定法规程
MLEC铺板
MLEC系从美国典型培养物保藏中心(Cat.#CCL-64)获得。细胞在包含10％FBS(Gibco)、1％青霉素/链霉素(Gibco)和1％MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)的极限必需培养基(MEM，Gibco)中生长。将来自T-175烧瓶的汇合细胞从烧瓶上脱离，旋转下来，洗涤，并重悬浮于MLEC测定法培养基中，所述MLEC测定法培养基由包含1％FBS、1％青霉素/链霉素和1％MEM非必需氨基酸溶液的MEM制成。然后，将细胞的等分试样用台盼蓝标记，在血细胞计数器上计数，并使用测定法培养基将细胞储液稀释至1.75×10⁵细胞/ml。将100μl这种悬浮液加到组织培养平底96孔板的每个孔中，并孵育3－5小时。
TGFβ/抗体溶液的制备
在MLEC测定法培养基中制备6ng/ml(最终测定法浓度的6倍)的TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3的工作溶液，以及为最终最大测定法浓度的3倍的抗体(包括对照例如1D11.16)的工作溶液。测定法中TGFβ的终浓度(1ng/ml或40pM)相应于与没有TGFβ的对照相比诱导大约80％细胞增殖抑制的浓度(即EC₈₀值)。
稀释板的建立
将测试和对照抗体的样品在MLEC测定法培养基中以3倍稀释梯级进行滴定，并在TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3存在或不存在下孵育。在每次实验中包括所有相关对照：测试1D11.16和/或合适的参照抗体，并进行TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3滴定。完成的平板在湿润的组织培养孵育箱中放置1小时±15分钟。
向铺板的细胞中加入TGFβ/抗体溶液
在适当的孵育时间后，将来自稀释板每个孔的100μl转移至铺 板的MLEC，并将平板放回孵育箱44±2小时。
添加[³H]-胸苷
向每个孔中加入25μl的10μCi/ml[³H]-胸苷(在PBS中稀释)(0.25μCi/细胞)。然后将平板放回孵育箱4小时±30分钟。
细胞收获
向每个孔中加入100μL胰蛋白酶-EDTA(0.25％，Gibco)，将平板在孵育箱中孵育10分钟，并且使用Tomtec或Packard96孔细胞收获器来收获细胞。
数据积累和分析
使用β-平板阅读器(TopCount，Packard)阅读来自收获的细胞的数据。分析数据以获得IC₅₀和标准差值。使用Prism2.0(GraphPad)软件获得IC₅₀值。
结果
将纯化的PET1073G12、PET1074B9和FET1287A10种系化的IgG4s在MLEC增殖测定法中与1D11.16一起进行测试。如实施例3中所述产生IgG4s。IC₅₀算术平均值±标准差(其中IC₅₀是中和50％40pM TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3所需的抗体浓度)显示于表1中。
关于PET1073G12和PET1287A10IgG4s的IC₅₀平均值数据显示，这些抗体具有的效力类似或接近1D11.16对TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3的那些。
IC₅₀平均值数据暗示，PET1074B9IgG4明显对于TGFβ1更有效(尽管在MLEC测定法中没有获得完全剂量应答曲线)。作为用于比较的手段，1D11.16在91pM的浓度上显示出对TGFβ1的12％中和，并且PET1074B9在92pM的类似浓度上显示出78％中和。此外，PET1074B9还在正常人肺成纤维细胞(NHLF)纤连蛋白产生测定法中与1D11.16一起进行测试(实施例5)。NHLF测定法中获得的结果证实了在MLEC测定法中获得的那些结果：PET1074B9具有的效力类似于1D11.16对TGFβ2和TGFβ3的效力，并且PET1074B9比1D11.16对于TGFβ1更具效力。
实施例5
在TGFβ3依赖性NHLF细胞测定法中抗-TGFβ抗体的中和效力
使用正常人肺成纤维细胞(NHLF)纤连蛋白产生测定法来评估纯化的抗体制备物针对人TGFβ生物活性的中和效力。该测定法测量抗体中和细胞外基质(ECM)糖蛋白(纤连蛋白)的产生的能力。TGFβs是培养的成纤维细胞中纤连蛋白产生的有效刺激物(Ignotz和Massaoue，1986)，经由激活c-Jun N-末端激酶途径发挥其效应(Hocevar等人，1999)。
NHLF细胞测定法规程
NHLF细胞从Clonetics^TM获得，并于37℃在包含5％C0₂的湿润气氛中维持在完全成纤维细胞生长培养基-2(FGM-2)中。在90－100％汇合时，将成纤维细胞在1.5ml FGM-2培养基中铺板(1.5×10⁵/孔，24孔形式)，并允许于37℃贴壁24小时。细胞用无血清的成纤维细胞基础培养基(FBM)洗涤，和在补充有人胰岛素(100μg/ml)、庆大霉素/两性霉素(50μg/ml)和抗坏血酸(50μg/ml)的1.5ml FBM中血清饥饿过夜，并于37℃孵育24小时。所有实验对传代3－6次之间的细胞进行。
TGFβ和抗体溶液的制备
在测定法培养基中制备25ng/ml(1nM)的TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3的工作溶液，以及抗体(包括对照例如1D11.16)的工作溶液。测定法中TGFβ的终浓度(250pg/ml或10pM)相应于与没有TGFβ的对照相比诱导大约80％纤连蛋白产生刺激的浓度(即EC₈₀值)。
稀释板的建立
将测试和对照抗体的样品在测定法培养基中以10倍稀释梯级进行系列稀释，并在TGFβ1、TGFβ2或TGFβ332存在或不存在下预孵育30分钟。NHLF细胞在2ml/孔的测定法培养基中于37℃孵育48小时。48小时后，取0.5ml培养基上清液的等分试样用于通过ELISA 进行纤连蛋白分析。
人纤连蛋白ELISA
使用Technoclone^TM人纤连蛋白抗原ELISA试剂盒来分析新鲜或冷冻的(-20℃)NHLF上清液样品，所述试剂盒包括人抗纤连蛋白捕获单克隆抗体(克隆6FN)和缀合有HRP的单克隆抗纤连蛋白二抗。方法如下：
Nunc-Immuno^TM Maxisorp^TM96孔板用在包被缓冲液(在蒸馏水中的12mM Na₂CO₃、35mM NaHC0₃、0.01％(w/v)硫柳汞，pH9.6)中的抗纤连蛋白捕获抗体(1μg/孔)于4℃包被16小时。去除捕获抗体，并且每个孔用100μl稀释缓冲液(在PBS中的1％(w/v)BSA)于37℃封闭1小时。用洗涤缓冲液(250μg/孔在PBS中的0.5％(v/v)Tween20)洗涤3次后，将人血浆纤连蛋白标准和样品加入平板，并于37℃孵育1小时。然后，将平板洗涤3次，并与抗纤连蛋白HRP二抗(100μg/孔，在稀释缓冲液中)一起于37℃孵育30分钟。平板用洗涤缓冲液洗涤3次，并向平板中加入100μg/孔的四甲基联苯胺(TMB)底物。平板在室温下孵育20分钟后，用100μg/孔的2M硫酸中止反应。然后使用Dynex MRX平板阅读器测定450nm处的吸光度。
数据分析
将数据提供为在测试下对TGFβ同种型的对照应答的百分比(100％)。使用四参数逻辑曲线拟合(Prism2，GraphPad Software，San Diego，USA)来评估pIC50几何平均值和95％置信界限。当四参数拟合失败时，通过保持曲线顶端和/或底部值恒定来进行三或二参数拟合。
结果
将纯化的PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10种系化的IgG4s在NHLF纤连蛋白产生测定法中与1D11.16一起进行测试。如实施例3中所述生产IgG4s。IC₅₀算术平均值±标准差(其中IC₅₀是中和50％10pM TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3所需的抗体浓度)显示于表2中。
实施例6
在IL-11诱导测定法中的效力
我们使用A549细胞(人肺上皮癌细胞)IL-11诱导测定法来评估纯化的抗体制备物针对人TGFβ生物活性的中和效力。
我们在生长/测定法培养基(435mL DMEM，50mL胎牛血清(FBS)，5mL青霉素/链霉素，5mL改进的Eagle培养基非必需氨基酸，5mL100X L-谷氨酰胺；全部来自Gibco/Invitrogen)中维持A549细胞(ATCC，Part#：CCL-185)。在大约90％汇合时，我们将细胞在100μL生长/测定法培养基中铺板，并让细胞在37℃、5％CO₂下贴壁24小时。
TGFβ和抗体溶液的制备
我们在生长/测定法培养基中制备TGFβ1(1.8ng/ml)、TGFβ2(4.2ng/ml)或TGFβ3(4.2ng/ml)和抗体(包括对照)的工作溶液。
稀释板的建立
我们在生长/测定法培养基中以5倍(TGFβ2或TGFβ3)或10倍(TGFβ1)的稀释梯级对测试和对照抗体样品进行系列稀释，并在TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3存在或不存在下于37℃预孵育75分钟。我们在200μl/孔的测定法培养基中于37℃孵育A549细胞18－24小时。18－24小时后，取100μl培养基上清液的等分试样用于通过ELISA进行IL-11分析。
实施例7
为了测定人泛中和性(pan-neutralizing)TGF-β单克隆抗体用于治疗特征为致病性纤维化的慢性肾病及其他临床适应症的生物学功效，我们在大鼠单侧尿道阻塞(UUO)模型中研究所述抗体的效应。
重250－280克(约6周)的成年Sprague Dawley大鼠(Taconic Farms，Germantown，NY)在控制空气、温度和光照的环境中饲养。经 历UUO的大鼠接受小腹中线剖腹术以暴露左肾和上输尿管。我们用丝缝线在肾较低一端的位置处结扎输尿管，并且在第一个之下约0.2cm处进行第二次结扎。经假手术的大鼠接受相同的手术方案，但不进行输尿管结扎。
经阻塞的大鼠用PBS、鼠类泛中和性单克隆抗体(1D11)、同种型匹配的对照抗体(13C4)或本发明的人泛中和性TGF-β单克隆抗体如下进行处理。我们从输尿管结扎当天开始给大鼠腹膜内施用所述抗体，疗程为3周。13C4和1D11以5mg/kg施用(3次/周)，并且将人泛中和性抗体以5mg/kg给予大鼠(每5天)。在3周结束时，我们处死大鼠，用PBS灌注肾3分钟，并收获经灌注的肾用于分析mRNA、测定胶原含量和组织学检查。
为了评估组织纤维化的程度，我们根据Kivirikko等人所述通过在水解提取物中羟脯氨酸的生物化学分析来测定组织胶原的总含量。该测定法基于动物组织中基本上所有的羟脯氨酸均在胶原中发现这一观察。
对于总胶原含量我们还进行了Sircol胶原测定法。Sircol胶原测定法基于Sirius red染料与组织胶原侧链的特异性结合来测量全部的酸/胃蛋白酶可溶性胶原的量。
当与经PBS处理的组(3.5±0.3μg/mg干组织，p<0.05)比较时，用人泛中和性单克隆抗体处理的UUO大鼠显示出羟脯氨酸含量减少43.4％(1.98±0.26μg/mg干组织)。如通过基于Sirius red染料的测定法所测定的，在受影响的肾中总溶解胶原的减少进一步支持了肾纤维化的减轻(假的：18.5±2.6，PBS：69.3±3.8，和人泛中和性单克隆抗体：35.6±5.2μg/100mg组织，p<0.05对PBS)。
我们还通过免疫组织化学检查评估了人泛中和性抗TGF-β单克隆抗体减少组织纤维化的能力。
在对照动物中，尿道阻塞3周导致肾脏管状结构的广泛破坏，伴随着显著的膨胀、细胞萎缩和坏死/凋亡、组织炎症和肾小管间质扩张(伴随明显纤维化)。关于肾小球损害的证据很少。另一方面，如通 过减弱的肾小管扩大和解体、减少的炎性浸润物(细胞构成)和减少的肾小管间质扩张和纤维化所判断的，用1D11或人泛中和性单克隆抗体处理的大鼠显示出肾结构的保存。
我们还测量了用人泛中和性抗TGF-β单克隆抗体进行处理对于受TGF-β调节的基因表达的影响。
与经PBS处理或经13C4对照抗体处理的动物相比，在经人泛中和性单克隆抗体处理的UUO动物中TGF-β1mRNA显著减少。与用PBS或13C4处理的那些相比，在用人和鼠类抗TGF-β抗体处理的阻塞的肾中还可见III型胶原的mRNA水平显著减少，这表明胶原合成减少。
我们通过测量总肾TGF-β1蛋白进一步证实了人泛中和性抗TGF-β单克隆抗体减少自诱导的TGF-β合成的功效。
与进行假手术的动物相比，阻塞的肾显示出总组织TGF-β1明显增加。然而用人泛中和性单克隆抗体进行给药的阻塞的大鼠显示出组织TGF-β1水平减少75％，明显低于关于两个对照组所记录的水平。通过比较，与对照组相比，鼠类1D11抗体使组织TGF-β1水平减少45％。
上述结果证实，用人泛中和性抗TGF-β单克隆抗体中和TGF-β有效地中断了TGF-β自分泌-调节环，并伴随着防止TGF-β1产生和胶原III mRNA表达。
我们进一步测定了人泛中和性抗TGF-β单克隆抗体对于作为TGF-β抑制的间接指示物的平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响。平滑肌肌动蛋白表达是激活的肌成纤维细胞的指示物，所述激活的肌成纤维细胞与组织纤维化相关并产生纤维结缔组织。TGF-β是基质成纤维细胞和定居上皮细胞的活化以及至肌成纤维细胞的表型转变的重要诱导剂。
我们通过标准蛋白质印迹分析检测了α-SMA蛋白。
如通过组织匀浆物的蛋白质印迹法所测量的，当与进行假手术的动物相比较时，具有阻塞的肾的大鼠显示出α-SMA蛋白显著上调(数据未显示)。用人泛中和性抗TGF-β单克隆抗体进行给药的阻塞的大 鼠显示出在可测量的α-SMA表达方面的显著减少(75％，与PBS对照相比)。
这些结果证实，人泛中和性抗TGF-β单克隆抗体在纤维化肾中减少胶原沉积的功效，这清楚地表明，在这种严重肾损伤和肾小管间质性纤维化模型中所述抗体是肾胶原产生和沉积的有效抑制剂。因为器官例如肺、肝或肾中的组织纤维化过程具有共同的机制或途径，所以技术人员将理解，所述抗体可用于治疗特征为致病性纤维化的慢性肾病以及其他临床适应症。
本发明的某些优选权利要求的描述如下。
SEQ ID NO1
编码PET1073G12VH的核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAG
GTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCAGTAGCAATGTTATCAGCTGGGTGCGC
CAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGGGGGGTCATCCCTATTGTTGATATT
GCGAACTACGCACAGAGATTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACT
AGTACAACTTACATGGAGTTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACGGCCGTGTATTAC
TGTGCGAGCACACTTGGTCTCGTCCTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACG
TTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO2
PET1073G12VH的氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDI
ANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGT
LVTVSSSEQ ID NO3
PET1073G12HCDR1的氨基酸序列
SNVIS
SEQ ID NO4
PET1073G12HCDR2的氨基酸序列
GVIPIVDIANYAQRFKG
SEQ ID NO5
PET1073G12HCDR3的氨基酸序列
TLGLVLDAMDY
SEQ ID NO6
编码PET1073G12VL的核苷酸序列
GAAACGGTACTCACGCAGTCTCCAGGTACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCC
ACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTCTTGGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTATCAG
CAGAAACCTGGTCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCACCT
GGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGTACCGACTTCACTCTCACCATC
AGCCGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATGCTGACTCA
CCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
SEQ ID NO7
PET1073G12VL的氨基酸序列
ETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAP
GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO8
PET1073G12LCDR1的氨基酸序列
RASQSLGSSYLA
SEQ ID NO9
PET1073G12LCDR2的氨基酸序列
GASSRAP
SEQ ID NO10
PET1073G12LCDR3的氨基酸序列
QQYADSPIT
SEQ ID NO11
编码PET1074B9VH的核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAG
GTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCAGTAGCAATGTTATCAGCTGGGTGCGC
CAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGGGGGGTCATCCCTATTGTTGATATT
GCGAACTACGCACAGAGATTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACT
AGTACAACTTACATGGAGTTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACGGCCGTGTATTAC
TGTGCGCTGCCACGCGCTTTCGTCCTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACG
TTGGTGACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO12
PET1074B9VH的氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDI
ANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCALPRAFVLDAMDYWGQGT
LVTVSS
SEQ ID NO13
PET1074B9HCDR1的氨基酸序列
SNVIS
SEQ ID NO14
PET1074B9HCDR2的氨基酸序列
GVIPIVDIANYAQRFKG
SEQ ID NO15
PET1074B9HCDR3的氨基酸序列
PRAFVLDAMDY
SEQ ID NO16
编码PET1074B9VL的核苷酸序列
GAAACGGTACTCACGCAGTCTCCAGGTACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCC
ACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTCTTGGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTATCAG
CAGAAACCTGGTCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCACCT
GGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGTACCGACTTCACTCTCACCATC
AGCCGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATGCTGACTCA
CCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
SEQ ID NO17
PET1074B9VL的氨基酸序列
ETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAP
GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO18
PET1074B9LCDR1的氨基酸序列
RASQSLGSSYLA
SEQ ID NO19
PET1074B9LCDR2的氨基酸序列
GASSRAP
SEQ ID NO20
PET1074B9LCDR3的氨基酸序列
QQYADSPIT
SEQ ID NO21
编码PET1287A10VH的核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAA
GTGTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCACCTCTTTCATCAATTGGGTGCGA
CAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGATATA
ACAAACTACGCACAGAAATTTCAGAGCAGAGTCACTATTACCCCGGACAAATCCACG
AGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACGGCTGTGTATTAC
TGCGCACGCGGAAATGGTAACTACGCCCTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGT
ACGTTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO22
PET1287A10VH的氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTSFINWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDI
TNYAQKFQSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNGNYALDAMDYWGQG
TLVTVSS
SEQ ID NO23
PET1287A10HCDR1的氨基酸序列
TSFIN
SEQ ID NO24
PET1287A10HCDR2的氨基酸序列
GIIPIFDITNYAQKFQS
SEQ ID NO25
PET1287A10HCDR3的氨基酸序列
GNGNYALDAMDY
SEQ ID NO26
编码PET1287A10VL的核苷酸序列
GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCC
ACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTTGCCTGGTACCAG
CAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACT
GGCATCCCTGACAGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC
AGCCGCCTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATGATAGT
CCCATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
SEQ ID NO27
PET1287A10VL的氨基酸序列
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYFAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAT
GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYYDSPITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO28
PET1287A10LCDR1的氨基酸序列
RASQSVSSSYFA
SEQ ID NO29
PET1287A10LCDR2的氨基酸序列
GASSRAT
SEQ ID NO30
PET1287A10LCDR3的氨基酸序列
QQYYDSPIT
SEQ ID NO31
WGQGTLVTVSS
注：CDRs根据Kabat等人(1991)进行定义
表1

使用PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10种系化的IgG4s或1D11.16来中和TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3对于MLEC的抗增殖效应。对于每个平均值的数据点总数由n的数目所指明，并且代表了每种抗体的独立滴定。#IC₅₀值不能测定，因为该抗体在所测试的浓度范围内太过有效，并且没有获得完全剂量应答曲线。
表2

在NHLF测定法中PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10种系化的IgG4s或1D11.16的效力。对于每个平均值的数据点总数由n的数目所指明，并且代表了每种抗体的独立滴定。