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1、10申请公布号CN104212736A43申请公布日20141217CN104212736A21申请号201310462857022申请日20130930CGMCCNO721120120723C12N1/20200601A61K39/102200601A61P31/04200601C12R1/2120060171申请人郑州后羿制药有限公司地址451162河南省郑州市郑州航空港区新港大道东侧72发明人王卫芳徐进陈建晖74专利代理机构郑州睿信知识产权代理有限公司41119代理人牛爱周54发明名称一种副鸡嗜血杆菌、灭活疫苗及其制备方法57摘要本发明公开了一种副鸡嗜血杆菌、灭活疫苗及其制备方法，所述副。
2、鸡嗜血杆菌为副鸡嗜血杆菌（HAEMOPHILUSPARAGALLINARUM）HNVA株，已于2012年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCCNO7211。本发明首次采用副鸡嗜血杆菌HNVA株制备针对鸡传染性鼻炎的灭活疫苗，该疫苗的研究和制备有效解决了当前我国鸡传染性鼻炎难以有效预防，发病率高、死亡率高的问题，且不会对鸡产生任何不良反应，实验安全性高，接种后可在鸡体内产生高效价的中和抗体，免疫效果较好。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书4页序列表2页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利。
3、申请权利要求书1页说明书4页序列表2页附图1页10申请公布号CN104212736ACN104212736A1/1页21一种副鸡嗜血杆菌，其特征在于，所述副鸡嗜血杆菌为副鸡嗜血杆菌（HAEMOPHILUSPARAGALLINARUM）HNVA株，已于2012年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCCNO7211。2根据权利要求1所述的副鸡嗜血杆菌，其特征在于，所述副鸡嗜血杆菌HNVA株的分离方法如下（1）病料的处理从发病雏鸡鼻窦内深部取分泌物作为病料，将病料接种于鸡血清琼脂肉汤培养基培养，进行分离纯化；（2）病原禽胚分。
4、离培养将步骤（1）纯化的病原菌接种于SPF鸡胚，收集死亡鸡胚的卵黄液，即得副鸡嗜血杆菌HNVA株。3一种权利要求1所述的副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗，其特征在于，其活性成分为灭活的副鸡嗜血杆菌HNVA株。4一种如权利要求3所述的副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤（1）将副鸡嗜血杆菌HNVA株接种于SPF鸡胚，收集接种后死亡的SPF鸡胚卵黄液，得到生产用种子；（2）将生产用种子扩大培养，加入灭活剂灭活，然后加入防腐剂和矿物油佐剂进行乳化，制得副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗。5根据权利要求4所述的一种副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述灭活剂为甲醛。6根据权利要求5所述的一种副。
5、鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述甲醛终体积浓度02。7根据权利要求4所述的一种副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述防腐剂为硫柳汞。8根据权利要求7所述的一种副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述硫柳汞的用量为终质量浓度001。9根据权利要求4所述的一种副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述矿物油佐剂为白油佐剂。权利要求书CN104212736A1/4页3一种副鸡嗜血杆菌、灭活疫苗及其制备方法技术领域0001本发明涉及一种副鸡嗜血杆菌，同时该副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗及其制备方法，属于微生物制剂领域。背景技术0002副鸡嗜血杆菌（HAEMOPHILUSP。
6、ARAGALLINARUM）是一种引起鸡急性上呼吸道疾病的致病菌。该病首先发现于波兰和美国，以后在其它各国经常发生。1980年以来，我国也屡有本病的报道。该呼吸道疾病俗称鸡传染性鼻炎，临床上以面部水肿、鼻窦炎、流泪为主要特征，可引起产蛋鸡的产蛋量下降，育成鸡的生长受阻、开产期推迟，肉鸡增重下降，给养禽业造成巨大的经济损失。目前对副鸡嗜血杆菌的治疗主要以抗生素为主，但是采用抗生素常会造成耐药菌株的出现，导致副鸡嗜血杆菌在同一鸡群中复发。因此副鸡嗜血杆菌疫苗的研究成为热点，但是目前副鸡嗜血杆菌疫苗对部分患病鸡预防效果较差。发明内容0003本发明的目的是提供一种副鸡嗜血杆菌。0004本发明的目的还在。
7、于提供一种副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗。0005本发明的目的还在于提供一种副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗的制备方法。0006为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种副鸡嗜血杆菌，所述副鸡嗜血杆菌为副鸡嗜血杆菌（HAEMOPHILUSPARAGALLINARUM）HNVA株，已于2012年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCCNO7211。0007所述副鸡嗜血杆菌HNVA株的分离方法如下0008（1）病料的处理从发病雏鸡鼻窦内深部取分泌物作为病料，将病料接种于鸡血清琼脂肉汤培养基培养，进行分离纯化；0009（2）病原禽胚分。
8、离培养将步骤（1）纯化的病原菌接种于SPF鸡胚，收集死亡鸡胚的卵黄液，即得副鸡嗜血杆菌HNVA株。0010本发明所采用的技术方案还在于提供一种副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗，其活性成分为灭活的副鸡嗜血杆菌HNVA株。0011本发明所采用的技术方案还在于提供一种副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤0012（1）将副鸡嗜血杆菌HNVA株接种于SPF鸡胚，收集接种后死亡的SPF鸡胚卵黄液，得到生产用种子；0013（2）将生产用种子扩大培养，加入灭活剂灭活，然后加入防腐剂和矿物油佐剂进行乳化，制得副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗。0014所述灭活剂为甲醛。0015所述甲醛终体积浓度02。说明书CN1042127。
9、36A2/4页40016所述防腐剂为硫柳汞。0017所述硫柳汞的用量为终质量浓度001。0018所述矿物油佐剂为白油佐剂。0019本发明首次采用副鸡嗜血杆菌HNVA株制备针对鸡传染性鼻炎的灭活疫苗，该疫苗的研究和制备有效解决了当前我国鸡传染性鼻炎难以有效预防，发病率高、死亡率高的问题，且不会对鸡产生任何不良反应，实验安全性高，接种后可在鸡体内产生高效价的中和抗体，免疫效果较好。0020本发明用HNVA株制备灭活疫苗工艺简单、操作方便、制备的疫苗抗原性好、安全性高，对外界环境无任何不良影响，安全评估系数高。附图说明0021图1为副鸡嗜血杆菌HNVA株的PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方。
10、式0022实施例10023本发明的副鸡嗜血杆菌HNVA株，是通过以下方式获得的00242012年6月，郑州尉氏某鸡厂大批7周龄以上雏鸡发生多起以打喷嚏，流鼻液，颜面浮肿，眼睑和肉髯水肿为主要特征的传染病，造成鸡只死亡和产蛋率下降。因此针对该批发病雏鸡，分离纯化得到病原菌，命名为HNVA株。通过对HNVA株各项观察，特异性PCR鉴定和测序分析表明，HNVA株属于副鸡嗜血杆菌。0025（1）病料的处理用无菌拭子插入发病雏鸡鼻窦内深部取分泌物做病料，然后划线培养于鸡血清琼脂肉汤培养基中，37培养48H，再挑取单个菌落接种于鸡血清肉汤培养基上中培养1620H。0026（2）病原禽胚分离培养将纯化的病原。
11、菌接种于鸡血清肉汤液体培养基中培养16H，然后将菌液接种于6日龄SPF鸡胚3枚，每枚01ML。观察接种24H后的鸡胚死亡情况，收集30H内死亡的鸡胚的卵黄液，获得的菌株命名为HNVA株。将等量的卵黄液分装于灭菌瓶内，每瓶2ML，检验合格后作为一级种子。也可用鸡胚复壮，但不应超过6代。检验方法取1瓶卵黄液，接种于含有鸡肉汤培养基的三角瓶内，培养1620小时后，观察三角瓶，若液体菌种均匀一致浑浊生长，则检验菌液合格。0027（3）HNVA株的鉴定0028（A）染色镜检挑取单个菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌的形态特征。镜下可见大量的单个、成对或短琏的两极浓染的革兰氏阴性细小杆菌。0029。
12、（B）卫星现象取2个副鸡嗜血杆菌培养基的平板，一个划线接种所分离纯化的细菌并点种金黄色葡萄球菌，另一个只划线接种分离菌作对照。于37培养箱中培养48H，发现其在葡萄球菌周围长出“卫星现象”。0030（C）挑取单个菌落用生理盐水稀释，震荡均匀后制成悬液。在载玻片的一端，滴加菌体悬液50L，另一端加入50L生理盐水，两端再各加入50L1鸡血红细胞，轻轻晃匀。温箱中反应3分钟左右观察。鸡血红细胞出现凝集现象，这说明HNVA株为A型副鸡嗜血杆菌。说明书CN104212736A3/4页50031（D）PCR鉴定根据副鸡嗜血杆菌的16SRRNA基因（GENBANK中登录号为AY4988701）的保守区设计。
13、引物，由INVITROGEN公司合成，引物序列如下0032上游引物HP16SF5CCAACCTTCCTCACCACC3（如SEQIDNO1所示），0033下游引物HP16SR5CCGCATAGAATCGGAAGA3（如SEQIDNO2所示）。0034按照精编分子生物学实验指南的方法提取菌体基因组DNA，进行PCR扩增。0035PCR反应体系为10PCRBUFFER2L，DNTP2L，MGCL21L，TAQ酶02L，上、下游引物各05L，模板05L，DDH2O135L。0036PCR反应条件为955MIN，941MIN，5650S，250S，35个循环；72延长5MIN。0037将PCR产物在2。
14、琼脂糖凝胶上电泳，结果如图1所示。图1中1、2分别为分离的2株菌株扩增出的特异条带，扩增片段大小为250350BP，条带位置与预期一致。经测序后与GENBANK中的登录号为AY4988701的序列进行比较，同源性高达98，扩增片段的核苷酸序列详见序列表SEQIDNO3所示。以上结果表明，分离于发病雏鸡中的HNVA株属于副鸡嗜血杆菌。0038实施例20039本发明副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗，制备方法如下0040（1）生产用种子检验将一级种子采用琼脂平板进行菌落计数。细菌计数按农业部颁发的兽医微生物制品规程进行，以101，102，103，1010稀释，然后取01ML稀释液均匀地涂抹在琼脂平板上，每个稀。
15、释度做2板，置于37培养箱中培养1620H，2板的平均数即为该稀释度的细菌数，用营养肉汤培养的菌液作为对照，每毫升菌落数不低于15亿方可用于生产。0041（2）灭活疫苗制备将生产用种子按万倍扩大培养，培养基用半合成肉汤培养基，调PH到72，115灭菌30分钟。在菌液中加入质量分数10的甲醛溶液，使甲醛溶液占菌液总体积的02，然后28灭活8天，灭活期间每天振摇5次。然后在灭活合格的菌液中加入硫柳汞，使硫柳汞终浓度为001（质量），和菌液2倍体积的白油佐剂进行乳化，制得副鸡嗜血杆菌灭活疫苗。0042灭活菌液检测方法取检品在无菌条件下接种沙氏培养基或不滴定PH普通琼脂斜面2支、血斜2支、02ML/支。
16、、置2030培养。同时接种装置不少于50ML的马丁肉液和厌气肝汤各2支，1ML/支，置37培养，3日后，自厌气肝汤管中吸取适量培养物，移植于鲜血琼脂斜面和厌气肝汤小管各1支，自马丁汤大管中吸取适量培养物移植于鲜血琼脂斜面和马丁肉汤小管各一支，连前继续培养5日，均应无菌生长。0043上述实施例中所采用的培养基均为半合成培养基，购自郑州博赛生物技术股份有限公司。0044试验例00451、安全检测0046用2月龄SPF鸡60只，随即分成4组，每组15只，3组实验组SPF鸡分别经颈背部皮下注射副鸡嗜血杆菌灭活疫苗，一次单剂量接种01ML/只，第4组为对照组，注射灭菌生理盐水。对实验组SPF鸡和对照组SPF鸡连续观察2周，观察有无发病、死亡和体重变化。结果3个实验组SPF鸡和对照组SPF鸡体重无差异，无发病、死亡，无局部和全身不良反应。说明书CN104212736A4/4页600472、效力检验0048用6周龄SPF鸡20只，10只各皮下注射疫苗025ML，另10只作对照。接种30日后，取免疫鸡和对照鸡，每只鸡各眶下鼻窦内注射副鸡嗜血杆菌HNV1株培养物02ML，观察2周。对照组发病5只，免疫组保护7只。说明书CN104212736A1/2页700010002序列表CN104212736A2/2页8序列表CN104212736A1/1页9图1说明书附图CN104212736A。