表达人血清白蛋白的慢病毒载体及其构建方法.pdf

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1、10申请公布号CN104212837A43申请公布日20141217CN104212837A21申请号201410173937922申请日20140428C12N15/867200601C12N15/66200601C07K14/765200601A01K67/02720060171申请人山东大学地址250061山东省济南市历下区文化西路44号72发明人王向东高鹏魏光伟李相芝74专利代理机构济南圣达知识产权代理有限公司37221代理人彭成54发明名称表达人血清白蛋白的慢病毒载体及其构建方法57摘要本发明公开了一种表达人血清白蛋白的慢病毒载体包含有人血清白蛋白基因，以及进行人血清白蛋白表达调控的。

2、鸡源的鸡卵清蛋白的启动子区序列，如SEQIDNO3所示，人血清白蛋白基因的5端连接有KOZAK序列；同时，上游还包含有进行药物筛选的NEO基因，下游包含有报告基因ZSGREEN。本发明的表达人血清白蛋白的慢病毒载体可用于制备转基因鸡，该转基因鸡繁殖后，其产生的卵鸡蛋中将会特异性地表达人血清白蛋白，而转基因鸡的其它细胞并不会表达人血清白蛋白，分离纯化方便，且由转基因鸡生产出来的人血清白蛋白在经过修饰之后更近似于人类体内正常的血清白蛋白，更有利于其发挥生物学功能。51INTCL权利要求书2页说明书10页序列表9页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书10页序列。

3、表9页附图1页10申请公布号CN104212837ACN104212837A1/2页21一种表达人血清白蛋白的慢病毒载体，其特征在于包含有人血清白蛋白基因，以及进行人血清白蛋白表达调控的鸡源的鸡卵清蛋白的启动子区序列，如SEQIDNO3所示，人血清白蛋白基因的5端连接有KOZAK序列；同时，上游还包含有进行药物筛选的NEO基因，下游包含有报告基因ZSGREEN。2权利要求1所述的表达人血清白蛋白的慢病毒载体的构建方法，其特征在于设计特异性引物，进行鸡卵清蛋白的启动子区序列和人血清白蛋白基因的扩增；然后，用PBLUESCRIPTIISK载体构建鸡卵清蛋白的启动子区序列与人血清白蛋白基因融合，然后。

4、将融合基因经过PCR扩增后连接到修饰的PLVXNEOIRESZSGREEN慢病毒载体上，即得表达人血清白蛋白的慢病毒载体；所述修饰的PLVXNEOIRESZSGREEN慢病毒载体是通过以下方法得到的通过限制性核酸内切酶NSIL和BAMHI对载体进行酶切，酶切后的载体经过T4DNA连接酶补平末端后连接成环状，即得。3根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述用PBLUESCRIPTIISK载体构建鸡卵清蛋白的启动子区序列与人血清白蛋白基因融合的具体方式为鸡卵清蛋白的启动子区序列重组到PBLUESCRIPTIISK载体上，再将人血清白蛋白基因重组到PBLUESCRIPTIISK载体上，利用特异性。

5、引物将鸡卵清蛋白的启动子区序列与人血清白蛋白基因的融合基因克隆下来。4根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于所述特异性引物如下用于扩增鸡卵清蛋白的启动子区序列的引物为F1、F2F15CCGCGGCCGCTCTATGGCGTCAAAGGTCA3；如SEQIDNO4所示；F25CCCCCCGGGGAAAATGTAAGGATGG3；如SEQIDNO5所示；用于扩增人血清白蛋白基因的引物为F3、F4F35CCCGGGGCCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTAT3；如SEQIDNO6所示；F45CCATCGATTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC3；如SEQIDNO7所示；引物F。

6、5，F6用于将连接到PBLUESCRIPTIISK载体上的鸡卵清蛋白的启动子区序列人血清白蛋白基因克隆并重组到PLVXNEOIRESZSGREENF55CCGCTCGAGGCTCTATGGCGTCAAAGGTC3；如SEQIDNO8所示；F65CCGGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTT3；如SEQIDNO9所示。5权利要求1所述的表达人血清白蛋白的慢病毒载体在制备转基因鸡中的应用。6根据权利要求5所述的应用，其特征在于具体应用时，将权利要求1的表达人血清白蛋白的慢病毒载体转化293T细胞制备慢病毒，经过鉴定能够表达人血清白蛋白之后，扩大培养，收集纯化慢病毒，利用显微注射技术。

7、，将慢病毒注射入鸡胚胎中，培育出转基因鸡。7一种获得表达人血清白蛋白的转基因鸡的方法，其特征在于利用慢病毒感染的方法将权利要求1的表达人血清白蛋白的慢病毒载体转化293T细胞制备慢病毒，收集并纯化能够表达人血清白蛋白的慢病毒，然后将慢病毒注射入鸡胚胎中，培育出转基因鸡。8一种制备生物反应器的方法，其特征在于所述生物反应器由转基因鸡输卵管组成，方法包括用权利要求1所述的表达人血清白蛋白的慢病毒载体制备转基因鸡。9一种从转基因鸡输卵管产生人血清白蛋白的方法，其特征在于利用慢病毒感染的方法将权利要求1的表达人血清白蛋白的慢病毒载体转化293T细胞制备慢病毒，收集并纯权利要求书CN104212837A。

8、2/2页3化能够表达人血清白蛋白的慢病毒，然后将慢病毒注射入鸡胚胎中，培育出转基因鸡，培育转基因鸡雌雄性个体至性成熟并传代，然后从转基因鸡雌性个体所产的鸡蛋中分离纯化人血清白蛋白。10根据权利要求9所述的从转基因鸡输卵管产生人血清白蛋白的方法，其特征在于培育转基因鸡雌雄性个体至性成熟后，分析F0或F1代雌性转基因鸡个体所产的鸡蛋蛋清组分中人血清白蛋白的含量，选择高产个体作为生物反应器的宿主动物或作为生物反应器种鸡。权利要求书CN104212837A1/10页4表达人血清白蛋白的慢病毒载体及其构建方法技术领域0001本发明涉及一种表达人血清白蛋白的慢病毒载体，尤其涉及构建带有鸡卵清白蛋白启动子区。

9、和人血清白蛋白基因的慢病毒表达载体PLVXNEOPOVAHALBIRESZSGREEN，属于基因工程技术和生物制药领域。背景技术0002人血清白蛋白是由585个氨基酸组成的单链蛋白质，分子量为67KDA，白蛋白是血浆中含量最高的蛋白质。白蛋白具有维持血液渗透压、抗休克、运输与解毒、促进肝细胞修复与再生等作用，是国际上使用最多的血液制品。临床上主要用于烧伤、失血性休克、水肿、低蛋白血症等的治疗。0003医用血清白蛋白的传统获得方法是从健康人血浆中提取，但由于血浆制品具有污染人原病毒的可能以及目前血液源的枯竭，使该方法受到很大限制，难以得到足够的血液制品。目前我们国家每年需要白蛋白120吨，而通过。

10、献血能制备的白蛋白仅为所需求量的1/3，因此，白蛋白供应严重紧缺。0004目前重组生物制药中普遍采用酵母、大肠杆菌发酵制备，但此方法存在诸多的缺点，例如微生物与人体环境差异大，表达产品生物活性低、掺杂的微生物毒素难以彻底去除，生产工艺复杂，很难形成规模化生产，因此，迄今为止，还没有相关产品上市。最近也有国际公司利用转基因技术制备转基因动物来制备人重组蛋白产品，与传统的微生物表达系统相比，动物生物反应器具有以下特点1生产的蛋白质生物活性高，能够对重组蛋白质进行多种翻译后加工，非常接近天然产品；2表达量大、成本低；3产品易提纯、质量高，避免了其他生产方式的化学及生物毒素的污染，安全可靠；4易产业化。

11、转移的目的基因能够遗传，使某一群体都具有同一特性，可通过动物繁殖扩群，进行规模化生产。0005最早的进行转基因鸡的方法是通过逆转录病毒LENTIVIRALVECTOR来进行的，这些病毒能够感染处在分裂期的细胞，在其宿主的正常生命周期中专一性的将基因整合到宿主的染色体中。但是由于逆转录病毒在干细胞中表达效率低，要得到转基因动物是比较困难的。目前ALV载体已经用于产生转基因禽类，但是转化的效率不是很高，只有10，而且在56只小公鸡中只有一只能够产生携带转基因精子。而且这只小公鸡产生的转基因精子的比率也十分的低，只有07，效率很低。0006相比之下，慢病毒载体较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，容纳外。

12、源性基因片段大，可以长期表达等显著优点。慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因的转导效率，且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。此外慢病毒不产生任何有效的细胞免疫应答，可作为一种转基因的工具。慢病毒载体介导的转基因表达能持续数月，且无可观察到的病理学现象。说明书CN104212837A2/10页50007近年来转基因鸡的技术已经十分成熟并且成为了新的研究热。

13、点，全世界有多种抗体以及医疗用蛋白通过转基因鸡生产，无论是实验技术、实际效果还是经济效益上，利用鸡输卵管作为生物反应器生产有药用价值重组蛋白质的前景都十分光明。发明内容0008针对上述现有技术，本发明提供了一种表达人血清白蛋白的慢病毒载体，以及进一步培育出鸡蛋中能够表达人血清白蛋白的转基因鸡的方法。0009本发明旨在通过转染效率高的慢病毒对鸡胚胎进行遗传修饰，将外源的人血清白蛋白基因随机插入到鸡胚的细胞中，改变这些细胞基因组的组成，一旦被感染的胚胎细胞中包括了生殖细胞，那么将会在其子代中出现可遗传的带有人血清白蛋白的转基因鸡，由于通过基因工程的方法将慢病毒载体中的CMV启动子换成了鸡卵清白蛋白。

14、的启动子，从而将非特异性的表达变成了组织特异性的表达，即目的基因的表达会与卵清蛋白的表达位置相同。这样通过杂交筛选能够培育出在鸡卵鸡蛋中表达人类血清白蛋白的转基因鸡，并且确保这种遗传修饰的改变能够被子代继承，长久的传递下去。0010本发明是通过以下技术方案实现的0011本发明将适合人血清白蛋白在鸡蛋蛋清中表达的调控反应元件以及人血清白蛋白的基因重组于鸡卵清白蛋白序列的元件，并进行基因工程克隆，构成人血清白蛋白在鸡输卵管组织特异性表达的慢病毒载体PLVXNEOPOVAHALBIRESZSGREEN，具体技术方案如下0012一种表达人血清白蛋白的慢病毒载体，结构为包含有人血清白蛋白基因序列如SEQ。

15、IDNO2所示，所表达的蛋白序列如SEQIDNO1所示，以及进行人血清白蛋白表达调控的鸡源的鸡卵清蛋白的启动子区序列，其大小为17KBSEQIDNO3所示，人血清白蛋白基因的5端连接有KOZAK序列，KOZAK序列为GCCACC；同时，上游还包含有进行药物筛选的NEO基因，下游包含有报告基因ZSGREEN。0013所述表达人血清白蛋白的慢病毒载体的构建方法，该方法的关键在于构建一种可以将人血清白蛋白插入到鸡胚细胞的基因组中并能够成功表达人血清白蛋白的慢病毒，经过扩增和纯化后，将这种慢病毒显微注射到STAGE1315期的胚胎中，鸡胚孵化后经过培养杂交，能够获得转基因鸡。该转基因鸡在形成卵的过程中。

16、表达产生人血清白蛋白，并且在其后代中稳定的传递转基因修饰，产生子代转基因鸡。构建方法具体如下0014通过NCBI进行检索，得到目的基因人血清白蛋白的基因后，设计特异性引物，进行鸡卵清蛋白的启动子区序列和人血清白蛋白基因的扩增人血清白蛋白基因扩增后，在5端增加了一个KOZAK序列；然后，以PLVXNEOIRESZSGREEN慢病毒载体该慢病毒载体为商品化载体，可常规市场购买得到为基础，用于构建产生慢病毒用PBLUESCRIPTIISK载体商品化的载体构建鸡卵清蛋白的启动子区序列与人血清白蛋白基因融合鸡卵清蛋白的启动子区序列重组到PBLUESCRIPTIISK载体上，再将人血清白蛋白基因重组到PB。

17、LUESCRIPTIISK载体上，利用特异性引物将鸡卵清蛋白的启动子区序列与人血清白蛋白基因的融合基因克隆下来，然后将融合基因经过PCR扩增后连接到修饰的PLVXNEOIRESZSGREEN慢病毒载体上，即得表达人血清白蛋白的慢病毒载体；所有序列经过PCR获得。说明书CN104212837A3/10页60015所述修饰的PLVXNEOIRESZSGREEN慢病毒载体是通过以下方法得到的通过限制性核酸内切酶NSIL和BAMHI对载体进行酶切，目的在于将载体本身的CMV启动子破坏掉，便于以后引入鸡卵清蛋白的启动子区序列发挥作用；酶切后的载体经过T4DNA连接酶补平末端后连接成环状，即得，修饰的PL。

18、VXNEOIRESZSGREEN慢病毒载体用于载体构建。0016所述特异性引物如下0017用于扩增鸡卵清蛋白的启动子区序列的引物为F1、F20018F15CCGCGGCCGCTCTATGGCGTCAAAGGTCA3；如SEQIDNO4所示；0019F25CCCCCCGGGGAAAATGTAAGGATGG3；如SEQIDNO5所示；0020用于扩增人血清白蛋白基因的引物为F3、F40021F35CCCGGGGCCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTAT3；如SEQIDNO6所示；0022F45CCATCGATTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC3；如SEQIDNO7所示；0023。

19、引物F5，F6用于将连接到PBLUESCRIPTIISK载体上的鸡卵清蛋白的启动子区序列人血清白蛋白基因克隆并重组到PLVXNEOIRESZSGREEN0024F55CCGCTCGAGGCTCTATGGCGTCAAAGGTC3；如SEQIDNO8所示；0025F65CCGGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTT3；如SEQIDNO9所示。0026上述方法中0027鸡卵清蛋白的启动子区序列与人血清白蛋白融合基因上包含53顺序5同源臂17KB，为鸡卵清蛋白基因上游序列，包含有卵清蛋白启动子，5同源臂两端引入两个酶切位点5NOTI/3XMAI；0028KOZAK9BP人血清白蛋白CD。

20、NA序列18KB含有终止密码子，KOZAK序列存在于真核生物MRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用能够增强基因表达，酶切位点引入5XMAI/3CLAI；0029鸡卵清蛋白的启动子区序列，KOZAK9BP人血清白蛋白CDNA序列均为PCR扩展产物，将KOZAK序列设计到引物中连接到人血清白蛋白CDNA序列的5端；鸡卵清蛋白的启动子区序列、KOZAK9BP人血清白蛋白CDNA序列先连接到PBLUESCRIPTIISK之后通过PCR扩增后引入酶切位点5XHOI/3NOTI再连接到PLVXNEOIRESZSGREEN载体上。0030所述表达人血清白蛋白的靶向载体在制备转基因鸡中的应用将上述的表。

21、达人血清白蛋白的慢病毒载体转化293T细胞制备慢病毒，经过鉴定能够表达人血清白蛋白之后，扩大培养，收集纯化慢病毒，利用显微注射技术，将纯化的慢病毒注射入鸡胚胎中，培育出转基因鸡，该转基因鸡繁殖后，其产生的卵鸡蛋中将会特异性地表达人血清白蛋白，而转基因鸡的其它细胞并不会表达人血清白蛋白。0031一种获得表达人血清白蛋白的转基因鸡的方法，步骤为利用慢病毒感染的方法将上述表达人血清白蛋白的慢病毒载体转化293T细胞制备慢病毒，收集并纯化能够表达人血清白蛋白的慢病毒，然后将慢病毒注射入鸡胚胎中，从而将鸡卵清蛋白的启动子区序列、KOZAK9BP人血清白蛋白CDNA序列整合到鸡胚的胚胎细胞中，培育出转基因。

22、鸡，该转基因鸡繁殖后，其产生的卵鸡蛋中将会特异性地表达人血清白蛋白以鸡输卵管为生物反应发生器，而转基因鸡的其它细胞并不会表达人血清白蛋白。0032一种制备生物反应器的方法，所述生物反应器由转基因鸡输卵管组成，方法包括用上述构建的表达人血清白蛋白的慢病毒载体制备转基因鸡。说明书CN104212837A4/10页70033一种从转基因鸡输卵管产生人血清白蛋白的方法，步骤为利用慢病毒感染的方法将上述表达人血清白蛋白的慢病毒载体转化293T细胞制备慢病毒，收集并纯化能够表达人血清白蛋白的慢病毒，然后将慢病毒注射入鸡胚胎中，从而将表达人血清白蛋白的慢病毒随机插入到鸡胚细胞的基因组中，培育出转基因鸡，培育。

23、转基因鸡雌雄性个体至性成熟并传代为增加产量，可分析F0或F1代雌性转基因鸡个体所产的鸡蛋蛋清组分中人血清白蛋白的含量，选择高产个体作为生物反应器的宿主动物或作为生物反应器种鸡，然后从转基因鸡雌性个体所产的鸡蛋中分离纯化人血清白蛋白。0034本发明构建慢病毒表达载体，通过慢病毒将人血清白蛋白基因整合到鸡的基因组中，通过特异性的启动子序列以鸡的输卵管作为生物反应器来表达的目的蛋白，制备出转基因鸡。本发明通过基因工程的方法选择性的将鸡卵清蛋白的启动子区插入到PLVXNEOIRESZSGREEN中，称为PLVXNEOPOVAHALBIRESZSGREEN，鸡的卵清白蛋白只在输卵管中表达，即便慢病毒将基。

24、因整合到其他位置，这样的操作也会使得只有在输卵管的位置才能够表达人血清白蛋白，本发明引入的基因不会在鸡体内其他的部位表达。相对于其他方法，利用转基因鸡产生人血清白蛋白有着极为明显的优势1鸡具有世代间隔短、生产性能高、易于饲养和管理、成本低。2通过转入功能蛋白基因在鸡输卵管表达，将鸡输卵管作为生物反应器，能够使鸡蛋中含有人血清白蛋白，由于组成鸡蛋蛋清的蛋白质只有8种，转基因蛋白质容易从鸡蛋的成分中分离和收集。3鸡蛋具有天然的无菌环境，表达的人血清白蛋白不容易受到污染。4与其他的转基因方式产生的白蛋白相比以鸡输卵管作为生物反应器制备的蛋白不仅可正确糖基化，在鸡体内附着在新生多肽上的寡聚糖类比哺乳动。

25、物的更近似人类，所以有转基因鸡生产出来的人血清白蛋白在经过修饰之后更近似于人类体内正常的血清白蛋白，更有利于其发挥生物学功能5利用慢病毒制备转基因鸡的技术相对成熟，国内国际上已经有较多的成功案例，而且慢病毒的转染效率极高，能够达到50左右的成功效率。附图说明0035图1慢病毒载体构建示意图。具体实施方式0036下面结合实施例对本发明作进一步的说明。0037实施例中所涉及的试剂、方法，若无特别说明，均为本领域的常规试剂、常规方法。0038实施例一构建表达人血清白蛋白的慢病毒载体构建原理示意图如图1所示0039一鸡基因组DNA提取00401、取第10期鸡胚200MG剪碎，加SENT包含有蛋白酶K5。

26、0G/ML和10SDS05ML，转移到匀浆器中匀浆。00412、将匀浆液转移到15ML离心管中。00423、60C水浴3小时。00434、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3MIN。00445、离心5000G10MIN，取上层水相到另一15ML离心管中。00456、加等体积饱和酚，混匀，离心5000G10MIN，取上层水相到另一管中。说明书CN104212837A5/10页800467、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000G10MIN，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。00478、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000G10MIN，取上层水相到另一管中。0。

27、0489、加1/10体积的3M醋酸钠PH52和25倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。004910、待絮状物出现后，离心5000G5MIN，弃上清液。005011、沉淀用75乙醇洗涤，离心5000G3MIN，弃上清液。005112、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50灭菌纯水溶解。0052二人血液中RNA提取00531、严格无菌操作，采新鲜血液2ML于38柠檬酸钠抗凝管。00542、1,500RPM离心5MIN。00553、在超净台内小心将上层血浆吸出，同时用等量的HANKS液补足2ML全血体积，轻柔混匀。00564、取4ML淋巴细胞分离液于15ML灭菌透明塑料离心管中，将2ML补足体积的抗凝血。

28、小心地加于淋巴细胞分离液液面上，3,000RPM室温离心10MIN。00575、小心收集界面上的细胞，加入到含4MLHANKS液的离心管中轻柔混匀，漂洗细胞。00586、1,500RPM离心5MIN，重复漂洗一次，沉淀即为所需的淋巴细胞。00597、处理好的淋巴细胞，加入TRIZOL，1ML，充分颠倒混匀直至完全溶解，室温放置5MIN。00608、加入氯仿200L，充分颠倒混匀1MIN，成均一的乳糜状，离心5MIN。00619、将上清液小心转移到RNASEFREE的15MLEPPENDORF里离心分层后，可以吸取上层无色液体约为350L，注意不要吸取任何中间层物质。006210、将上清层转移到。

29、一干净的离心管中,加入等体积冰浴的异丙醇,颠倒振荡混匀，将混合的样品在20条件下孵育20分钟以上，4，12,000G离心10分钟。RNA沉淀通常形成片状沉淀附着于管壁或管底。006311、弃去上清，用1ML冰浴的75的乙醇洗涤RNA沉淀一次，颠倒洗涤离心管管壁，并旋涡振荡样品，尽可能让沉淀悬浮，4，12,000G离心5分钟，再次去除上清，晾干沉淀。006412、加入20UL高压的DEPC水进行溶解。0065三人源CDNA的合成00661将提取的人MRNA热变性，65，5MIN后，立即置于冰上。00672反应液配置如下所示0068试剂及使用量0069RNA溶液2G；5RTBUFFER4L；DNT。

30、PMIXTURE各10MM2L；PRIMERMIX1L；REVERTRAACE1L；RNASEFREEH2OUPTO20L。00703反应条件0071655MIN；00723715MIN；0073985MIN；说明书CN104212837A6/10页90074冰上5MIN；0075四PCR对鸡卵清蛋白的启动子区序列和人血清白蛋白基因进行扩增PCR反应体系如表1所示0076表100770078PCR反应条件如表2所示0079表200800081“”为实验过程中采取的相同的条件。0082五载体构建00831、按照商品化试剂盒操作说明完成PCR产物的回收和纯化。进行下述的酶切和连接反应。00842、。

31、酶切反应如表3所示0085表30086说明书CN104212837A7/10页1000873、按照胶回收试剂盒操作进行酶切产物的回收。0088通过DNA连接酶在室温条件下进行连接反应，反应过夜后将DNA片段与载体连接如表4所示。0089表40090鸡卵清蛋白的启动子区序列7UL人血清白蛋白基因7ULPBLUESCRIPTIISK载体3UL连接缓冲液2ULT4DNA连接酶1UL反应条件室温过夜00914、将连接好的载体通过热激转化方法转化到感受态细胞中扩增重组载体。0092实验条件20UL连接产物加入到200UL感受态细胞中，冰上放置15分钟，42热激1分钟，冰上放置2分钟，将细菌平铺在带有氨苄。

32、抗性的琼脂糖LB固体培养基上。培养过夜。将长出的单一菌落选出，进行扩增后，提取质粒。提取方法参见康维公司质粒提取试剂盒。00935、PLVXNEOPOVAHALBIRESZSGREEN载体的构建009451对PLVXNEOIRESZSGREEN载体的修饰，酶切去除原有的CMV启动子，酶切反应具体如表5所示。0095表50096PLVXNEOIRESZSGREEN/2UG内切酶1NSIL/1UL内切酶2BAMHI/1UL缓冲液BUFFER31/2UL总体积20UL酶切条件37/4小时009752末端补平及连接实验0098将酶切去掉CMV启动子的载体纯化后进行末端补平反应体系如表6所示0099表6。

33、0100说明书CN104212837A108/10页11T4DNALIGASEREACTIONBUFFER2ULDNTP2MM1ULT4DNAPOLYMERASE1UL总体积20UL反应条件12/15分子0101加入10MM的EDTA在75作用20分子终止补平反应。之后按照之前所述的连接反应，将去除CMV启动子的PLVXNEOIRESZSGREEN连接成环状，转化入大肠杆菌进行扩增。010253目的片段与去掉CMV启动子的PLVXNEOIRESZSGREEN的连接0103目的片段通过引物F5，F6以连接了鸡卵清蛋白的启动子区序列人血清白蛋白基因的PBLUESCRIPTIISK载体为模板扩增获得。

34、，PCR反应体系如表7所示0104表7010501060107PCR反应条件如表8所示0108表801090110酶切实验，如表9所示说明书CN104212837A119/10页120111表901120113后续的连接与扩增与之前所述过程一样，最终得到含有鸡卵清蛋白的启动子区序列和人血清白蛋白的慢病毒表达载体。0114实施例二鉴定人血清白蛋白的表达0115将实施例一构建好的含有鸡卵清蛋白的启动子区序列和人血清白蛋白的慢病毒表达载体命名为PLVXNEOPOVAHALBIRESZSGREEN载体。将5106个DT40商业化细胞重悬于400UL电转缓冲液中，加入20UGPLVXNEOPOVAHAL。

35、BIRESZSGREEN载体，指数式衰减脉冲200V,WITH9001,100UF进行电转转化入DT40细胞，转染2448H之后再荧光显微镜先观察载体本身携带的发光蛋白ZSGREEN表达情况。WESTERN鉴定人血清白蛋白在DT40细胞中的表达情况。选取表达效率高的载体进行测序分析，将序列正确的载体大量扩增。0116实施例三0117慢病毒的制备将实施例二中的PLVXNEOPOVAHALBIRESZSGREEN质粒连同慢病毒包装质粒商业化质粒一同转染293T细胞，制备慢病毒。转染24小时前，在10CM培养瓶中接种45105个293T细胞，添加10ML的生长培养基。在37，5CO2条件下过夜。在进。

36、行转染前确保培养血有4050的覆盖率。0118转染293T细胞01191将400UL无血清的高糖培养基加入EP管中，加入60ULLIPOFECTAMINE2000，轻微震荡溶解脂状物。01202另取一个EP管，加入400UL无血清的高糖培养基，以及PLVXNEOPOVAHALBIRESZSGREEN质粒和包装质粒共24UG，轻微震荡混匀。01213将两个EP管中的液体混合，室温放置15分钟。01224加入混合液，将细胞放回培养箱中培养48小时。01235培养24小时后可观察荧光蛋白表达情况。0124病毒的扩增与收集0125经过转染后48小时的细胞培养液中会含有慢病毒。用细胞培养液继续感染培养说。

37、明书CN104212837A1210/10页13的293T细胞。扩大生产带有目的基因的慢病毒。0126将扩大感染的293T收集，可暂时保存于80冰箱，当收集足够多的细胞后快速反复冻融裂解细胞释放病毒。准备进行纯化。0127病毒的纯化使用GENECOPOEIA公司的LENTIPACTMLENTIVIRUSCONCENTRATIONSOLUTION试剂盒货号LPRLCS01，具体浓缩方法见说明书。0128实施例四慢病毒表达人血清白蛋白的鉴定0129慢病毒感染24小时前，在六孔板中接种45105个鸡成纤维细胞，每孔添加3ML的生长培养基。在37，5CO2条件下过夜。在进行感染前确保培养血有7080的。

38、覆盖率。0130感染前2小时更换培养基，加入1微升浓缩的慢病毒感染细胞，在37，5CO2条件下感染24小时后通过荧光观察和WESTERN鉴定慢病毒携带的基因表达情况。0131实施例五转基因鸡的制备0132将制备的慢病毒通过显微注射的方法注射入STAGEX的鸡胚中，将完成注射后的鸡胚放置于37旋转孵化箱，直至完成孵化。0133实施例六转基因鸡的鉴定0134选取完成孵化的转基因鸡，经过杂交后产生后代，在新个体中取血，分离出血细胞。通过PCR和SOUTHERNBLOT来检测是否有人血清白蛋白基因插入到基因组中，是否能够完成转录。饲养转基因鸡在其产卵后提取卵清蛋白进行WESTERNBLOT检测，测定人血清白蛋白表达情况。说明书CN104212837A131/9页1400010002序列表CN104212837A142/9页150003序列表CN104212837A153/9页160004序列表CN104212837A164/9页170005序列表CN104212837A175/9页180006序列表CN104212837A186/9页190007序列表CN104212837A197/9页200008序列表CN104212837A208/9页210009序列表CN104212837A219/9页22序列表CN104212837A221/1页23图1说明书附图CN104212837A23。