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1、(10)申请公布号 CN 102277350 A (43)申请公布日 2011.12.14 CN 102277350 A *CN102277350A* (21)申请号 201110224836.6 (22)申请日 2011.08.06 C12N 11/14(2006.01) A62D 3/02(2007.01) B09C 1/10(2006.01) C12R 1/32(2006.01) A62D 101/20(2007.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 徐建明 何艳 徐民民 王娇娇 马斌 (74)专利代理机构 杭州中成专利。
2、事务所有限公 司 33212 代理人 金祺 (54) 发明名称 单载体的多环芳烃降解菌剂及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种单载体的多环芳烃降解 菌 剂， 其 由 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液和作为载体的黑炭组成， Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液与黑炭的体积 / 质 量比为 ： 每 20 50ml 的菌悬液中加入 15g 的黑 炭 ； 每 ml 的菌悬液中含有 5.0 6.0*108CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌体。本发 明还同时公开了上述单载体的多环芳烃。
3、降解菌剂 的制备方法。本发明的多环芳烃降解菌剂用于降 解多环芳烃。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 CN 102277353 A1/1 页 2 1. 单载体的多环芳烃降解菌剂， 其特征是 ： 由 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌 悬液和作为载体的黑炭组成， 所述 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液与黑炭的体 积 / 质量比为 ： 每 20 50ml 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液中。
4、加入 15g 的 黑炭 ； 所述每 ml 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液中含有 5.0 6.0*108CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌体。 2. 如权利要求 1 所述的单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法， 其特征是包括如下步 骤 ： 1)、 菌悬液的制备 ： 利用Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1的单菌落制备Mycobacterium vanbaalenii. PYR-1 菌悬液， 所述每 ml 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液中含有 。
5、5.0 6.0*108CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌体 ； 2)、 载体原料的准备 ： 黑炭用 0.005 0.015mol/L 的 HCL 调至中性， 干燥 ； 3)、 先将步骤 2) 所得的黑炭进行灭菌， 然后加入步骤 1) 所得的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌 悬 液， 所 述 每 15g 的 黑 炭 中 加 入 20 50ml 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液 ； 再加入 30 50ml 的无菌水 ； 均匀混合后冷冻干燥， 得单载体 的多环芳烃降解菌剂。 3.。
6、 根据权利要求 2 所述的单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法， 其特征是 ： 所述步 骤 1) 为 ： 挑取 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 的单菌落接种于装有 LB 培养基的三角瓶 中， 于 30， 120rpm 避光水浴振荡培养 46 50 小时 ； 然后调节至每 ml 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液中含有 5.0 6.0*108CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-1 菌体。 4. 根据权利要求 3 所述的单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法， 其特征是 ： 所述步 骤 3) 中。
7、的冷冻干燥为 ： 于 -56 -50干燥 22 26h。 5. 根据权利要求 4 所述的单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法， 其特征是 ： 所述 LB 培养液的制备方法如下 ： 在每升水中加入酵母提取物 5g、 蛋白胨 10g 和 Nacl 5g， 然后用 NaOH 调 PH 7.4 7.6。 权 利 要 求 书 CN 102277350 A CN 102277353 A1/4 页 3 单载体的多环芳烃降解菌剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于微生物菌剂领域， 具体地， 涉及一种含有分支杆菌的多环芳烃降解微 生物菌剂。 背景技术 0002 多环芳烃(Polycyclic aromat。
8、ic hydrocarbons， 简称PAHs)是环境中普遍存在的 一类有机污染物， 它通常是指一类含有两个或两个以上的苯环， 以线性、 角状或簇状排列的 稠环型化合物， 具有熔点和沸点较高、 疏水性强、 蒸汽压小、 正辛醇 - 水分配系数高等特性。 0003 多环芳烃最突出的特性是具有强致癌性、 致畸性及致突变性， 并且它具有较高的 亲脂性， 可通过食物链进入人体， 对人类健康和生态环境具有很大的潜在危害。随着煤、 石 油等在工农业生产、 交通运输及生活中的广泛应用， 由此而产生的多环芳烃已引起各国环 境科学家极大的重视， 是美国环保局制定的 129 种优先污染物的一类。 0004 由于多环。
9、芳烃本身的性质， 常规方法难以将其从环境中去除， 微生物修复技术由 于其成本低， 无二次污染， 被认为是修复多环芳烃环境污染的重要手段之一。可以降解多 环芳烃的微生物被不断报道， 从上个世纪 80 年代开始， 随着分子生化分析水平的提高， 各国的科学家就陆续分离得到了各种具有降解多环芳烃能力的微生物， 常见微生物有红 球菌属 (Rhodococcus)、 假单胞菌属 (Pseudomonas)、 分枝杆菌 (Mycobacterium)、 芽抱杆 菌属 (Bacillus)、 海杆菌属 (marinobacter)、 鞘氨醇单胞菌属 (Sphingomonas)、 新鞘氨 醇杆菌属 (Novo。
10、sphingomonas)、 气单胞菌属 (Aeromonas)、 弧菌属 (Vibrio)、 拜叶林克氏 菌属 (Beijernckia)、 棒状杆菌属 (Corynebacterium)、 微球菌属 (Micrococcus)、 蓝细菌 (Cyanobacteria)、 诺卡氏菌属(Nocardioides)、 解环菌属(Cycloclastieus)和Stappia属 等。其中分支杆菌是一类非常重要的降解细菌。 0005 黑碳 (BC) 是化石燃料和生物质不完全燃烧生成的具有高度芳香化结构的含碳颗 粒物， 元素组成以 C 为主 ( 占 60以上 )， 其次为 H、 O、 N、 S， 它在。
11、环境大气圈、 水圈、 生物圈、 土壤和岩石中无处不在， 全球每年产生的 BC 主要源于生物质燃烧。 0006 黑碳表面具有不均匀性， 大部分碳原子所形成的石墨状微晶是无规则排列， 为典 型的非石墨化碳结构。 发明内容 0007 本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、 降解效果好、 无二次污染的单载体 的多环芳烃降解菌剂及其制备方法。 0008 为了解决上述技术问题， 本发明提供一种单载体的多环芳烃降解菌剂， 其由 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌 悬 液 和 作 为 载 体 的 黑 炭 组 成， Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1。
12、 菌悬液与黑炭的体积 / 质量比为 ： 每 20 50ml 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液中加入 15g 的黑炭 ； 0009 每 ml 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液中含有 5.0 6.0*108CFU 的 说 明 书 CN 102277350 A CN 102277353 A2/4 页 4 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌体。 0010 本发明还同时提供了上述单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法， 包括如下步 骤 ： 0011 1)、 菌悬液的制备 ： 0012 利 用 。
13、Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 的 单 菌 落 制 备 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液， 每 ml 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液中含有 5.0 6.0*108CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌体 ； 0013 2)、 载体原料的准备 ： 0014 黑炭用 0.005 0.015mol/L 的 HCL 调至中性 ( 即 pH 值 7)， 干燥至恒重后待用 ； 0015 3)、 先将步骤 2) 所得的黑炭进行灭菌 ( 为常规的高压蒸汽灭菌。
14、 )， 然后加入步骤 1) 所得的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液， 每 15g 步骤 2) 所得的黑炭中加入 20 50ml 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液 ； 再加入 30 50ml 的无菌水 ； 均 匀混合后冷冻干燥， 得单载体的多环芳烃降解菌剂。 0016 加入无菌水的目的是使载体 ( 即黑炭 ) 处于悬浮状态， 从而方便菌悬液与载体的 充分混匀。 0017 作为本发明的单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法的改进， 步骤 1) 为 ： 0018 挑取 Mycobacterium vanbaalenii.P。
15、YR-1 的单菌落接种于装有 LB 培养基的三角 瓶中， 于30， 120rpm避光水浴振荡培养4650小时 ； 然后调节至每ml的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液中含有 5.0 6.0*108CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-1 菌体。 0019 作为本发明的单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法的进一步改进 ： 步骤 3) 中 的冷冻干燥为 ： 于 -56 -50干燥 22 26h。 0020 作为本发明的单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法的进一步改进 ： LB 培养液 的制备方法如下 ： 在每升水中加入酵母提取物(。
16、酵母膏)5g、 蛋白胨10g和Nacl 5g， 然后用 NaOH 调 PH 7.4 7.6。 0021 本发明是以菌株 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 的富集液为有效成份， 将其 有效的吸附于黑炭颗粒载体上， 冷冻干燥后制成固体颗粒状的多环芳烃降解菌剂。 0022 在本发明中， 菌Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1， 即为分支杆菌PYR-1， 分类命 名为 Mycobacterium vanbaalenii， 菌株编号为 PYR-1， 可购于德国的微生物菌种保藏中心 公司 ( 详见 www.dsmz.de)。黑炭， 购买自海诺炭业， 。
17、为 100 目干粉。 0023 在本发明中， 多环芳烃是指辛醇水分配系数较高的四环的芘。 0024 在本发明中， 可利用控制 OD600 值来调节每 ml 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-1 菌悬液中含有的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌体的量。例如 ： 当调节 OD600 0.6 左右， 该菌悬液含有约为 5.3*108CFU 的菌体。 0025 本发明所得的单载体的多环芳烃降解菌剂无菌装袋封口， 常温干燥保存， 保存期 一般为 1 3 年。 0026 研究表明 BC 具有多孔性和高比表面积以及丰富的表面官能团， 对有机化。
18、合物有 较高的亲和力从而对 PAHs 有很强的吸附作用。基于黑炭的此种性质， 微生物可以以黑炭为 存在介质， 保持生命活力。因此， 以黑炭为载体的 PAHs 降解菌剂有广阔的发展应用前景。 说 明 书 CN 102277350 A CN 102277353 A3/4 页 5 0027 本发明具有如下优点 ： 0028 1. 成本低。黑碳 (BC) 是化石燃料和生物质不完全燃烧生成的具有高度芳香化结 构的含碳颗粒物， 在环境大气圈、 水圈、 生物圈、 土壤和岩石中无处不在， 全球每年产生的 BC 主要源于生物质燃烧。 由于黑炭来源广泛， 成本低廉， 产量巨大， 因此可大量应用于实际。 黑 炭成本。
19、较低， 无毒性， 同时可以改良土壤结构， 为微生物提供养分和生存空间， 是作为载体 很好的选择。 0029 2. 本发明的使用的多环芳烃降解菌 PYR-1， 对环境条件要求不苛刻。对温度、 氧气 量也没用特别严格的要求， 同时使用方法简单， 易于操作。 0030 3.应用效果好， 降解效率高。 本发明利用成本较低的黑炭为菌剂载体， 黑炭本身也 具有很强的吸附能力， 可以吸附环境中的 PAHs ； 同时， 分支杆菌 PYR-1， 是多环芳烃的高效 降解菌株， 二者结合， 能有效的降解吸附环境中的多环芳烃污染。并且， 实施于环境中不会 造成二次污染， 可大面积推广使用。 0031 本发明的实际用法。
20、和用量如下 ： 0032 在水中加入多环芳烃降解菌剂制成悬浊液， 每 L 悬浊液中含有 0.5 10g 多环芳 烃菌剂， 然后喷洒于土壤上， 按土壤中多环芳烃浓度 10ppm 计， 每亩土壤中多环芳烃降解菌 剂的用量为 2 5kg。 附图说明 0033 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 0034 图 1 为本发明的单载体的多环芳烃降解菌剂的吸附降解效果图。 具体实施方式 0035 下面通过实施例对本实验作进一步详细说明。 0036 实施例 1、 一种单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法， 依次进行如下步骤 ： 0037 1)、 菌悬液的制备 ： 0038 将 Mycobact。
21、erium vanbaalenii.PYR-1 的单菌落接种于装有 LB 培养基的三角 瓶中， 于 30， 120rpm 避光水浴振荡培养 48h。得菌悬液。将上述菌悬液调至 OD600 0.6 左右， 即每 ml 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液中含有 5.3*108CFU 的 Mycobacteriumvanbaalenii.PYR-1 菌体。 0039 LB 培养液的制备方法如下 ： 在每升水中加入酵母提取物 ( 酵母膏 )5g、 蛋白胨 10g 和 Nacl 5g， 用 NaOH 调 PH 7.4 7.6， 然后经常规的高压灭菌而得。 0040。
22、 2)、 载体原料的准备 ： 0041 将黑炭 ( 为 100 目 ) 用 0.01mol/L 的 HCL 洗涤至中性 ( 即 pH 7)， 自然风干至恒 重后待用。 0042 3)、 称取 15g 步骤 2) 所得的黑炭进行常规的高压蒸汽灭菌 3 次， 每次 30 分钟 ； 然 后加入 30ml 步骤 1) 所得的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌悬液， 再加入 40ml 无菌 水 ； 均匀混合后于 -53干燥 24h， 得约 15g 的单载体的多环芳烃降解菌剂。 0043 所得的单载体的多环芳烃降解菌剂装袋封口， 常温干燥保存， 保存期一般为 1 3 年。。
23、 说 明 书 CN 102277350 A CN 102277353 A4/4 页 6 0044 实例 1、 0045 将0.05克芘(辛醇水分配系数较高的四环的芘)溶于100ml丙酮， 配制成500ppm 芘的母液， 将芘的母液 1ml 添加到 10ml 矿质培养液中， 使芘的最终浓度 50ppm。静置过夜， 待丙酮完全挥发后， 称取 0.1g 菌剂 ( 即实施例 1 所得的单载体的多环芳烃降解菌剂 ) 加 入， 于 30， 120rpm， 避光培养 6 天， 分别在第 0、 3、 6 天测定芘的残留量， 以不加菌剂的矿质 培养液为空白对照， 设三个重复。 0046 该矿质培养液的配方为 (。
24、 每升 ) ： K2HPO4 4g， Na2HPO4 4g， (NH4)2SO4 2g， MgSO4 7H2O 0.2g， CaCL2 1mg， FeSO47H2O 1mg， 其余为水 ； 用 NaOH 调 PH 7 ； 然后经常规的高压灭菌而 得。 0047 芘的残留量测定 ： 用 20ml 正己烷分四次将所述培养液洗至 50ml 离心管， 斡旋， 过 0.22m 滤膜， 用 GC-MASS 测定其芘含量。 0048 经过6天的降解实验， 芘的浓度从最初添加的50ppm， 经由第0天的直接吸附， 降至 14.7ppm， 在第 3 天基本吸附降解完全， 芘的浓度减少至 0.828ppm， 降解。
25、效率可达 98。至 第 6 天时， 芘的浓度为 0.914ppm， 与第三天芘的浓度基本没差异， 说明被吸附在黑炭上的芘 并没有释放出来。 0049 而空白对照的结果为 ： 在同样的时间内， CK 中芘的浓度保持在 50mg/kg 左右， 未见 明显的下降趋势。 0050 通过上述实验， 我们能得到以下结论 ： 实验结果说明本发明的菌剂对液体环境下 高环多环芳烃的修复效果非常好， 且修复速度快。 0051 对比例 1、 0052 将 上 述 实 例 1 中 的 0.1g 菌 剂 改 成 0.2ml 的 实 施 例 1 的 步 骤 1) 所 得 的 Mycobacterium vanbaalen。
26、ii.PYR-1 菌 悬 液 ( 即 每 ml 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-1 菌悬液中含有 5.3*108CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌体 )， 即， 保证 Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1 菌体有效用量一致。其余均等同。 0053 结果为 ： 当液体环境下芘的浓度为50ppm时， 经过6d处理， 添加菌悬液的处理其浓 度降为 27.6ppm， 降解率为 44.8， 如图 1 所示。与实例 1 中使用本发明的单载体的多环芳 烃降解菌剂的降解效果相比， 本发明的效果明显高于单纯的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-1 菌悬液。 0054 说明 ： 本发明的单载体的多环芳烃降解菌剂更加具有降解多环芳烃的优势。 0055 最后， 还需要注意的是， 以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然， 本发明 不限于以上实施例， 还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直 接导出或联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。 说 明 书 CN 102277350 A CN 102277353 A1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 102277350 A 。