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1、10申请公布号CN104173325A43申请公布日20141203CN104173325A21申请号201310647579622申请日20131204A61K31/20200601A61P35/00200601A61P35/0420060171申请人复旦大学地址200433上海市杨浦区邯郸路220号72发明人申华莉林灵丁颖杨芃原74专利代理机构上海元一成知识产权代理事务所普通合伙31268代理人吴桂琴54发明名称棕榈酸在制备治疗肝癌和抗肝癌转移药物中的应用57摘要本发明属药物技术领域，涉及化合物棕榈酸（PALMITICACID）新的药用用途，具体涉及棕榈酸在制备治疗肝癌和抗肝癌转移药物中的。
2、应用。本发明通过体外CCK8抗肿瘤活性评价，结果显示，棕榈酸对人肝癌细胞株HEP3B，LM3的生长具有显著的抑制作用；尤其对具有高转移潜能的LM3的运动和迁移能力均有显著的抑制作用；所述棕榈酸（PALMITICACID）能用于制备抗肝癌和抗肝癌转移药物，具有良好的开发应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图2页10申请公布号CN104173325ACN104173325A1/1页21式（I）的棕榈酸在制备治疗肝癌药物中的应用；所述化合物棕榈酸（PALMITICACID）CAS号57103，分子式C16H。
3、32O2，结构如式I2式（I）的棕榈酸在制备抗肝癌转移药物中的应用。3按权利要求1或2的用途，其特征在于，所述的棕榈酸抑制肝癌细胞的增殖能力。4按权利要求1或2的用途，其特征在于，所述的棕榈酸抑制高转移潜能肝癌细胞的迁移能力。5按权利要求1或2的用途，其特征在于，所述的棕榈酸抑制高转移潜能肝癌细胞的侵袭能力。权利要求书CN104173325A1/4页3棕榈酸在制备治疗肝癌和抗肝癌转移药物中的应用技术领域0001本发明属药物技术领域，涉及化合物棕榈酸（PALMITICACID）新的药用用途，具体涉及棕榈酸在制备治疗肝癌和抗肝癌转移药物中的应用。背景技术0002据报道，世界上每年有超过50万肝癌病。
4、例被发现，其致死率在所有癌症中排名第三。肝癌死亡率与发病率之比高达096，居所有癌症之首，故号称“癌中之王”。目前，业内攻克癌症有两大目标一是“不生癌”，即研究正常细胞变成癌细胞的原因和机制，并加以预防；二是“让癌不转移”，转移是影响病人生存期的首要因素，约60以上的恶性肿瘤患者初次诊断时已有转移。如能解决这一问题，癌症即与良性肿瘤一样，可得到治愈。有人将“癌转移”列为本世纪生命科学迫切要解决的重大问题之一。转移是肝癌低治愈高死亡的主要原因然而对肝癌转移过程中磷脂代谢的变化及作用研究鲜有报道。0003研究显示，脂肪酸具有广泛的代谢功能，不仅可以以自由脂肪酸的形式存在，还可以构成多种复杂的脂类化。
5、合物。在人体中，脂肪酸可以构成三酰甘油储存能量，或构成磷脂成为细胞膜的磷脂双分子层，或作为第二信使（DAG、PIP2、LPA等）参与信号传导，或作为核受体的配体影响基因的表达，等等。据报道，很多疾病都与脂代谢紊乱有关，如糖尿病、肥胖病、老年痴呆症、癌症等。因此，脂肪酸含量的变化对人体健康具有重要的影响，生命体中脂类物质及其代谢过程的研究已渐成为疾病发病机理和诊断治疗以及医药研发过程的重要关注点。0004本申请的发明人拟提供化合物棕榈酸（PALMITICACID）新的药用用途，尤其是通过外加棕榈酸（PALMITICACID）杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤侵袭转移，进一步制备治疗肝癌和抗肝癌转移药物的应用。
6、。0005与本发明相关的现有技术有00061JEMALA,BRAYF,CENTERMM,ETALGLOBALCANCERSTATISTICSCAACANCERJOURNALFORCLINICIANS2011612699000072ELSERAGHB,MASONACRISINGINCIDENCEOFHEPATOCELLULARCARCINOMAINTHEUNITEDSTATESNEWENGLANDJOURNALOFMEDICINE19993401074575000083HANAZAKIK,KAJIKAWAS,SHIMOZAWAN,ETALSURVIVALANDRECURRENCEAFTERHEP。
7、ATICRESECTIONOF386CONSECUTIVEPATIENTSWITHHEPATOCELLULARCARCINOMAJOURNALOFTHEAMERICANCOLLEGEOFSURGEONS2000191438138800094HIRSCHHA,ILIOPOULOSD,JOSHIA,ETALATRANSCRIPTIONALSIGNATUREANDCOMMONGENENETWORKSLINKCANCERWITHLIPIDMETABOLISMANDDIVERSEHUMANDISEASESCANCERCELL201017434836100105NGUYENHP,SCHUGKATHEADV。
8、ANTAGESOFESIMSDETECTIONINCONJUNCTIONWITHHILICMODESEPARATIONSFUNDAMENTALSANDAPPLICATIONSJOURNALOFSEPARATIONSCIENCE200831914651480说明书CN104173325A2/4页400116FALCONERJ,ROSSJ,FEARONK,ETALEFFECTOFEICOSAPENTAENOICACIDANDOTHERFATTYACIDSONTHEGROWTHINVITROOFHUMANPANCREATICCANCERCELLLINESBRITISHJOURNALOFCANCER1。
9、99469582683200127ANNEKENDJ,BOTHS,CHRISTOPHR,ETALFATTYACIDSULLMANNSENCYCLOPEDIAOFINDUSTRIALCHEMISTRY2006PUBLISHEDONLINE,DOI101002/14356007A10_245PUB2发明内容0013本发明的目的是提供化合物棕榈酸（PALMITICACID）新的药用用途，具体涉及棕榈酸在制备治疗肝癌和抗肝癌转移药物中的应用。0014本发明依据细胞膜的脂质组成和流动性对维持细胞拓扑结构、运动能力、膜联蛋白活性以及保持细胞正常的生理功能具有影响的理论基础，将高通量、高分辨率、高精度的脂质。
10、分离鉴定技术与生物信息学工具结合，全景式地展现肝癌转移潜能递增的情况下脂质表达谱差异；通过对肝癌转移细胞系进行的脂组学筛选实验，证实了含棕榈酸（PALMITICACID）的磷脂在肝癌细胞和转移性肝癌细胞中的表达降低，进一步显示了通过外加棕榈酸（PALMITICACID）杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤侵袭转移的新用途。0015本发明所述化合物棕榈酸（PALMITICACID）CAS号57103，分子式C16H32O2，结构如式I所示00160017本发明所涉及的化合物棕榈酸（PALMITICACID）的制备方法可参见文献ANNEKENDJ,BOTHS,CHRISTOPHR,ETALFATTYACIDSU。
11、LLMANNSENCYCLOPEDIAOFINDUSTRIALCHEMISTRY2006PUBLISHEDONLINE,DOI101002/14356007A10_245PUB20018本发明中，采用SHOTGUN技术对三种不同转移潜能的人肝癌细胞系HEP3B（不转移）、97L（低转移潜能）、LM3（高转移潜能）进行脂质组成分析，结果显示含棕榈酸（PALMITICACID）的磷脂在转移细胞系中含量降低，表明棕榈酸与肝癌细胞转移能力相关；0019本发明通过体外CCK8抗肿瘤活性评价，结果显示，棕榈酸（PALMITICACID）对人肝癌细胞株HEP3B，LM3的生长具有显著的抑制作用；进一步划痕实。
12、验显示，棕榈酸（PALMITICACID）尤其对具有高转移潜能的LM3的运动和迁移能力均有显著的抑制作用；实验表明，棕榈酸（PALMITICACID）能用于制备抗肝癌和抗肝癌转移药物。0020鉴于目前已有的针对肝癌的研究均未发现棕榈酸（PALMITICACID）具有抗肝癌和说明书CN104173325A3/4页5抗肝癌转移的活性，尤其是本发明来自于对肝癌细胞系进行的LIPIDOMICS筛选，不存在由其它化合物给出任何提示的可能。本发明的棕榈酸（PALMITICACID）能用于制备抗肝癌和抗肝癌转移药物，具有良好的开发应用前景。0021以下通过实施例和附图对本发明做进一步详细说明，但本发明的保护。
13、范围不受具体实施例的任何限制。附图说明0022图1HEP3B和LM3细胞在含不同浓度棕榈酸（PALMITICACID）的培养基培养下的增殖曲线。0023图2补充棕榈酸对HEP3B和LM3细胞迁移能力的影响比较。0024图3补充棕榈酸对LM3细胞侵袭能力的影响（P0001）。具体实施方式0025以下通过实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。0026本发明所涉及的化合物棕榈酸（PALMITICACID）的制备方法参见文献ANNEKENDJ,BOTHS,CHRISTOPHR,ETALFATTYACIDSULLMANNSENCYCLOPED。
14、IAOFINDUSTRIALCHEMISTRY2006PUBLISHEDONLINE,DOI101002/14356007A10_245PUB20027实施例1制备化合物棕榈酸片剂0028取20克化合物棕榈酸（PALMITICACID），加入制备片剂的常规辅料180克，混匀，常规压片机制成1000片。0029实施例2制备化合物棕榈酸胶囊剂0030取20克化合物棕榈酸（PALMITICACID），加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉180克，混匀，装胶囊制成1000粒。0031实施例3药效学实验0032采用CCK8法评价棕榈酸（PALMITICACID）对人肝癌细胞株的生长抑制作用0033取对数生长期。
15、的待测细胞HEP3B和LM3（细胞来源于复旦大学附属中山医院肝癌研究所），接种于96孔板中，接种细胞浓度为2000个细胞/孔，处理组加入不同体积棕榈酸（PALMITICACID）稀释液，使终浓度分别为0M，50M，100M，200M和250M。CCK8法分析不同时间点（1D、3D、5D、7D）的细胞活力，每个时间点分别检测6个复孔，每孔待测样品中加入10LCCK8细胞增殖与活性检测试剂（日本同仁化学公司产品），CCK8试剂与待测细胞在培养箱内共孵育2H，然后用酶标仪（THERMO公司产品）进行检测，激发光波长为450NM，发射光波长为630NM，96孔板读板，记录A450吸光值，A630为校正。
16、值。吸光值测定后绘制细胞增殖曲线，比较不同实验组增殖曲线的变化；0034结果显示随着培养基中棕榈酸（PALMITICACID）浓度的依次增加，HEP3B和LM3的生长速度逐渐减慢，抑制效应在LM3细胞系中更为强烈，结果表明，补充棕榈酸（PALMITICACID）能抑制肝癌细胞的增殖能力（如图1所示）。0035实施例3采用划痕愈合实验评价棕榈酸（PALMITICACID）对人肝癌细胞株迁移能力的抑制作用说明书CN104173325A4/4页60036用6孔板培养细胞，接种细胞浓度为2105个细胞/孔，以细胞数量过夜能铺满为原则。铺板后1416H（不超过24H），取对数生长期的待测细胞HEP3B和。
17、LM3，分别加入不同体积棕榈酸（PALMITICACID）稀释液，使终浓度分别为0M，50M，100M和200M，每个细胞系铺3块板，即棕榈酸（PALMITICACID）每个浓度设3个复孔。用10ULTIP头在6孔板中心划十字，以保证前后观察时位置固定，枪头要尽量垂直于培养皿。再用PBS洗细胞3次，以去除划下的细胞，加入2低血清浓度培养基，以忽略细胞增殖效应。将6孔板置于37、5CO2培养箱内培养，细胞呈现单层贴壁生长状态。分别于划痕后0H、12H、24H、36H每个孔取4个视野拍照，观察细胞划痕愈合能力。0037结果显示在无转移潜能的肝癌细胞系HEP3B中，随着棕榈酸（PALMITICACI。
18、D）浓度的增加，迁移能力基本不变，而在转移潜能较高的LM3细胞系中，随着棕榈酸（PALMITICACID）浓度的增加，迁移能力逐渐减弱，在终浓度为200M棕榈酸（PALMITICACID）条件下，LM3细胞已基本不具备迁移能力，结果表明，棕榈酸（PALMITICACID）能抑制高转移潜能肝癌细胞的迁移能力（如图2所示）。0038实施例4采用细胞侵袭实验评价棕榈酸（PALMITICACID）对人肝癌细胞株侵袭能力的抑制作用0039A侵袭小室的制备将MATRIGEL原液置于4冰浴过夜融化，冻融后，为保证其稳定性，用预冷的移液枪头混匀MATRIGEL基质成匀浆状。操作务必在无菌环境中进行。B采用预冷。
19、的无血清培养液稀释MATRIGEL基质，配制TRANSWELL小室（其滤膜孔径为8M）上室凝胶液（0125G/L），以每孔100L包被TRANSWELL的上室，从边缘轻轻加入，避免出现气泡，轻轻摇晃铺平MATRIGEL胶。室温孵育1H风干。C取对数生长期的HEP3B和LM3细胞，用无血清培养基培养过夜；0040D消化细胞，用无血清培养基调节细胞浓度至1106CELLS/ML，每孔TRANSWELL上室加入100L细胞悬液，并分别加入不同体积棕榈酸（PALMITICACID）稀释液，使终浓度分别为0M，50M，100M和200M；下室加入600L含有20FBS的新鲜培养基，每组设4个孔，TRAN。
20、SWELL小室置于BDFALCONTM24孔板中，于5CO2培养箱培养48H。E从双室培养板中取出TRANSWELL小室，吸弃液体，用棉签擦去膜上室面的MATRIGEL胶和细胞，PBS漂洗后立即4多聚甲醛固定膜下室面的细胞15MIN，1PBS漂洗3MIN，结晶紫染液染色30MIN，去离子水漂洗2次，而后显微镜镜下观察，在100高倍镜下，每张膜选取上、下、左、右、中5个视野拍照并计数；0041结果显示在无转移潜能的肝癌细胞系HEP3B中，随着棕榈酸（PALMITICACID）浓度的增加，侵袭能力的改变无统计学差异；而在转移潜能较高的LM3细胞系中，随着棕榈酸（PALMITICACID）浓度的增加。
21、，侵袭能力逐渐减弱，在终浓度为200M棕榈酸（PALMITICACID）条件下，LM3细胞侵袭能力与其他各组相比均有显著的统计学差异（P0001）；结果表明，棕榈酸（PALMITICACID）能抑制高转移潜能肝癌细胞的侵袭能力（如图3所示）。0042由上述实验结果表明，棕榈酸（PALMITICACID）对人肝癌细胞株HEP3B，LM3的生长具有显著的抑制作用，尤其是对于高转移潜能的LM3的运动和迁移能力都具有显著的抑制作用；因此，本发明的棕榈酸（PALMITICACID）能用于制备抗肝癌和抗肝癌转移药物，具有良好的开发应用前景。说明书CN104173325A1/2页7图1图2说明书附图CN104173325A2/2页8图3说明书附图CN104173325A。