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本发明提供了一种胞苷(脱氧)及其衍生物的纯化方法，所述的方法包括步骤：(1)将含有式I化合物的水溶液上样到碱性树脂；和(2)用水洗脱，得到高纯度的式I化合物；式中，R1表示氢，卤素，烷基，烷氧基；R2表示氢，羟基，卤素；R3表示氢，羟基，卤素，烷氧基，叠氮；R4表示羟基，卤素，烷氧基，叠氮。

1.  一种如式I的化合物的纯化方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)将含有式I化合物的水溶液上样到碱性树脂；和
(2)用水洗脱，得到高纯度的式I化合物；

式中，R1表示氢，卤素，烷基，烷氧基；
R2表示氢，羟基，卤素；
R3表示氢，羟基，卤素，烷氧基，叠氮；
R4表示羟基，卤素，烷氧基，叠氮。

2.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有式I化合物的水溶液中杂质含量以溶质的总重量计为3-10w/w％。

3.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有式I化合物的水溶液中式I化合物的含量以溶质的总重量计为90-97w/w％。

4.  如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述杂质选自下述的一种或多种：如式II所示的化合物、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶；

式中，R1表示氢，卤素，烷基，烷氧基；
R2表示氢，羟基，卤素；
R3表示氢，羟基，卤素，烷氧基，叠氮；
R4表示羟基，卤素，烷氧基，叠氮。
胞嘧啶
尿嘧啶
胸腺嘧啶。

5.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的碱性树脂是强碱性树脂；优选自醋酸型碱性树脂、甲酸型碱性树脂、氯型碱性树脂、或氢氧型碱性树脂。

6.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的含有式I化合物的水溶液的pH5.5-14。

7.  如权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述的含有式I化合物的水溶液的pH8.0-14。

8.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述碱性树脂的体积(L)是含有式I化合物的水溶液中的式I化合物的重量(Kg)的10-50倍。

9.  如权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，所述碱性树脂的体积(L)是含有式I化合物的水溶液中的式I化合物的重量(Kg)的20-40倍。

10.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中的洗脱用水的温度为10-20℃。

一种胞苷(脱氧)及其衍生物的纯化方法
技术领域
本发明涉及脱氧核苷的精制，尤其由尿苷(脱氧)及其衍生物转化的胞苷(脱氧)及其衍生物的纯化方法。
背景技术
近年，随着基因组创药的发展，反义DNA医药等被急速开发。随之，构成原料的DNA低聚物以及构成低聚物原料的核苷及其衍生物的需要日趋增大。另一方面，在医药品的用途中，为了极力抑制由含有的杂质生成的副生成物，有必要使用非常高纯度的核苷及其衍生物。
迄今为止由尿苷(脱氧)及其衍生物转化的胞苷(脱氧)及其衍生物的精制方法有以下几种：
1.EP0204264中公开了将得到的胞苷(脱氧)及其衍生物的反应液浓缩后，通过结晶得到产物。该方法中不能有效地去除尿苷(脱氧)及其衍生物。例如，胞苷(脱氧)及其衍生物反应液中含有的未反应完全的尿苷(脱氧)及其衍生物和反应过程生成的副产物(尿嘧啶及其衍生物，胞嘧啶及其衍生物等)，特别难以通过结晶方法去除，另外这些杂质在医药品制造上会对下步工序产生很大影响。
2.FRG Patent NO.2122991公开了将得到的胞苷(脱氧)及其衍生物的反应液浓缩后，通过硅胶柱色谱层析法精制胞苷(脱氧)及其衍生物。EP0204264和CAN.J.CHEM.VOL.68，1990中也有关于类似方法的描述。该方法在工业化中需要庞大的精制设备，而且从需要大量溶剂出发，对于将来的大量生产，大量供给以及生产安全，环境保护等来说是存在很大问题的。
3.EP0204264公开了通过酸性离子交换树脂精制，先将胞苷反应物的水溶液通过不同型号的酸性离子交换树脂。这样胞苷被吸附，尿苷流出，然后用氨水将胞苷洗下从而达到精制的目的。但是这个方法会有以下问题：在所有的由尿苷(脱氧)及其衍生物转化的胞苷(脱氧)及其衍生物的反应过程中都不可避免地会产生胞嘧啶及其衍生物，而这些物质也会被酸性离子交换树脂吸附并被氨水洗下并存在于产品中。
因此，本领域迫切需要提供一种有效且无需特别设备的可得到高纯度的胞苷(脱氧)及其衍生物的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种胞苷(脱氧)及其衍生物的纯化方法。
在本发明中，提供了一种如式I的化合物的纯化方法，所述的方法包括步骤：
(1)将含有式I化合物的水溶液上样到碱性树脂；和
(2)用水洗脱，得到高纯度的式I化合物；

式中，R1表示氢，卤素，烷基，烷氧基；
R2表示氢，羟基，卤素；
R3表示氢，羟基，卤素，烷氧基，叠氮；
R4表示羟基，卤素，烷氧基，叠氮。
在另一优选例中，所述含有式I化合物的水溶液中杂质含量以溶质的总重量计为3-10w/w％。
在另一优选例中，所述含有式I化合物的水溶液中式I化合物的含量以溶质的总重量计为90-97w/w％。
在另一优选例中，所述杂质选自下述的一种或多种：如式II所示的化合物、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶；

式中，R1表示氢，卤素，烷基，烷氧基；
R2表示氢，羟基，卤素；
R3表示氢，羟基，卤素，烷氧基，叠氮；
R4表示羟基，卤素，烷氧基，叠氮。
胞嘧啶
尿嘧啶
胸腺嘧啶。
在另一优选例中，所述的碱性树脂是强碱性树脂；更佳地，选自醋酸型碱性树脂、甲酸型碱性树脂、氯型碱性树脂、或氢氧型碱性树脂。
在另一优选例中，所述的含有式I化合物的水溶液的pH5.5-14。
在另一优选例中，所述的含有式I化合物的水溶液的pH8.0-14。
在另一优选例中，所述碱性树脂的体积(L)是含有式I化合物的水溶液中的式I化合物的重量(Kg)的10-50倍。
在另一优选例中，所述碱性树脂的体积(L)是含有式I化合物的水溶液中的式I化合物的重量(Kg)的20-40倍。
在另一优选例中，步骤(2)中的洗脱用水的温度为10-20℃。
据此，本发明提供了一种有效且无需特别设备的可得到高纯度的胞苷(脱氧)及其衍生物的方法。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，发现可以通过碱性树脂的层析纯化胞苷(脱氧)及其衍生物，尤其是针对由尿苷(脱氧)及其衍生物转化得到的胞苷(脱氧)及其衍生物的纯化，可以获得非常高纯度的胞苷(脱氧)及其衍生物，从而完成了本发明。
定义
如本文所用“碱性树脂”和“阴离子交换树脂”可以互换使用，都是指带正电(如具有附着于其上的一个或多个带正电的配体，例如季铵基团)的固相。商业上可购得的阴离子交换树脂包含DEAE-纤维素、QAE SEPHADEX^TM和FAST Q SEPHAROSE^TM(Pharmacia)。
“固相”指一个或多个带电配体能粘附的非水基质。固相可以是纯化柱、一种分散微粒的不连续相、膜或滤膜等。能形成固相的材料的例子包括多糖(如琼脂糖和纤维素)；和硅(如可控孔径玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷颗粒和上述任一衍生物等其它机械上稳定的基质。
“含有式I化合物的水溶液”是指用来将含有感兴趣的式I化合物和一种或多种杂质的组合物加到离子交换树脂上的溶液。它具有的pH，能使感兴趣的式I化合物(和通常一种或多种杂质)与离子交换树脂结合。
从含有式I化合物和一种或多种杂质的组合物中“纯化”式I化合物，指通过从组合物中(完全或部分的)除去至少一种杂质来提高组合物中式I化合物的纯度。“纯化步骤”可以是得到“均一”组合物(在本文中“均一”指含感兴趣式I化合物的重量相对于组合物的总重量至少约90％，优选重量至少约95％的组合物)的总纯化过程中的一部分。
将某分子“结合”到离子交换材料上，指在合适的条件下(pH)使该分子和离子交换材料接触，在该条件下该分子通过分子和离子交换材料上一个或多个带电基团之间的离子相互作用可逆的固定在离子交换材料中或材料上。
将分子从离子交换材料上“洗脱”下来，指通过改变离子交换材料周围的液体离子强度从离子交换材料上除下该分子，该离子强度能使溶液与分子竞争离子交换材料上的带电位点。
“溶质”是指含有式I化合物的水溶液中分散于水中的物质，包括式I化合物和一种或多种杂质。所述的杂质来自于式I化合物的合成步骤，例如但不限于，如式II所示的化合物、胞嘧啶及其衍生物、尿嘧啶及其衍生物、胸腺嘧啶及其衍生物。
本发明提供一种如式I的化合物的纯化方法，所述的方法包括步骤：
(1)将含有式I化合物的水溶液上样到碱性树脂；和
(2)用水洗脱，得到高纯度的式I化合物；

式中，R1表示氢，卤素，烷基，烷氧基；
R2表示氢，羟基，卤素；
R3表示氢，羟基，卤素，烷氧基，叠氮；
R4表示羟基，卤素，烷氧基，叠氮。
较佳地，将通过层析后的水溶液减压去除水分后得到或减压去除水分后用含醇溶剂悬浮得到，然后在大气压以下的压力下干燥。
本发明的碱性树脂的层析温度在10-30℃，较佳地为10-20℃，更佳地为12-17℃。
本发明的式I化合物和杂质的含量(纯度)测定方法使用高效液相测定(HPLC)，它们的含量以其峰面积和各成分峰面积之和的百分比表示。
本发明式I化合物可以通过本领域熟知的方法获得，较佳地是通过如式II的化合物生物转化获得的。所述的生物转化方法是本领域熟知的，例如但不限于，包括步骤：将式II化合物、乙腈、三乙醇胺和三氮杂茂等混合、反应后，和氨水混合，得到式I化合物。
本发明中作为提供的纯化方法的原料的式I化合物中含有一种或多种杂质，所述杂质的含量为3-10w/w％，较佳地为5-7w/w％。
本发明使用的碱性树脂是强碱性阴离子交换树脂，带有一价的正电荷，包括但不限于，氯型碱性树脂、醋酸型碱性树脂、甲酸型碱性树脂、氢氧型碱性树脂。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、提供的纯化方法简便，无需特殊设备，成本低廉。
2、提供的纯化方法效果显著，尿苷(脱氧)及其衍生物胞嘧啶及其衍生物等杂质的含量均检测不到。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明下述实施例中的HPLC(高效液相色谱)条件(2’-dCR，5-Me-dCR，2’-OMe-CR的分析条件)
柱：YMC-AQ 250*4.6mm
流速：0.8ml/min
柱温：25℃
检测波长：260nm
移动相：梯度条件
时间(min)     A液(％)    B液(％)
0             100        0
2             100        0
12            70         30
42            70         30
48            100        0
58            100        0
A液：将Na₂HPO₄(1.323g)，NaH₂PO₄(0.0938g)溶解于双蒸水中并定容至1L，然后用0.22um水膜过滤。
B液：色谱级甲醇
分析过程中A液，B液在线脱气，氦气流速50ml/min.
参考例1
2’-脱氧胞苷(2’-dCR)的制备
3’，5’-di-O-acetyl-2’-dUR 50g加入到800ml乙腈、220ml TEA、106g1，2，4-Triazole和120ml POCl₃的混合液中，控制温度8-15℃，反应过夜后减压浓缩至干，得到一种淡黄色的油状物为4-Triazine-1-(3’，5’-di-O-acetyl-2’-Deoxy-β-D-ribofuranosyl)uracil。
在此油状物中加入氨水2000ml控温40℃剧烈搅拌5小时后减压浓缩至干，加水500ml溶解后HPLC分析：2’-dUR及作为副产物的胞嘧啶，尿嘧啶分别含2.3％，1.2％，2.1％.
参考例2
5-甲基-2’-脱氧胞苷(5-Me-dCR)的制备
3’，5’-di-O-acetyl-2’-dTR 10g加入到160ml乙腈、40ml TEA(三三乙醇胺)、20g 1，2，4-Triazole(三氮杂茂)和25ml POCl₃的混合液中，控制温度8--15℃，反应过夜后减压浓缩至干，得到一种淡黄色的油状物为4-Triazine-1-(3’，5’-di-O-acetyl-2’-Deoxy-β-D-ribofuranosyl)thymine。
在此油状物中加入氨水400ml控温40℃剧烈搅拌5小时后减压浓缩至干，加水100ml溶解后HPLC分析：2’-dTR及作为副产物的胸腺嘧啶，5-甲基胞嘧啶分别含1.8％，1.9％，2.1％.
参考例3
2’-甲氧基-胞苷(2’-OMe-CR)的制备
3’，5’-di-O-acetyl-2’-OMe-UR 10g加入到160ml乙腈、38ml TEA、17.5g 1，2，4-Triazole和23ml POCl₃的混合液中，控制温度8--15℃，反应过夜后减压浓缩至干，得到一种淡黄色的油状物为4-Triazine-1-(3’，5’-di-O-acetyl-2’-OMe-β-D-ribofuranosyl)cytosine。
在此油状物中加入氨水400ml控温40℃剧烈搅拌5小时后减压浓缩至干，加水100ml溶解后HPLC分析：2’-OMe-UR及作为副产物的尿嘧啶，胞嘧啶分别含1.3％，2.2％，2.5％.
实施例1
2’-脱氧胞苷的纯化
将参考例1中合成的2’-脱氧胞苷水溶液100ml用10N NaOH调PH至10.0，上样到200ml醋酸型碱性树脂上。然后用15℃的水洗并收集流出液，直至流出液无紫外吸收。合并收集液在55℃下减压浓缩去除水分，得到白色固体。此固体在60℃下减压干燥至恒重，得6.78g.
HPLC分析：含2’-dCR(99.99％)，2’-dUR及作为副产物的胞嘧啶，尿嘧啶未被检出。检测界限(0.01％)以下。
元素分析(C₉H₁₃N₃O₄)：样品检测C：47.51％；H：5.82％；N：18.43％。
(理论值：C：47.57％；H：5.77％；N：18.49％)
旋光分析：[α]_D²⁰+54°(C＝2，H₂O)
实施例2
5-Me-dCR的纯化
将参考例2中合成的5-Me-dCR水溶液100ml用10N NaOH调PH至9.0，上样到200ml甲酸型碱性树脂上。然后用15℃的水洗并收集流出液，直至流出液无紫外吸收。合并收集液在55℃下减压浓缩去除水分，得到白色固体。此固体在60℃下减压干燥至恒重，得6.22g.
HPLC分析：含5-Me-dCR(99.99％)，2’-dTR及作为副产物的胸腺嘧啶，5-甲基胞嘧啶未被检出。检测界限(0.01％)以下。
元素分析(C₁₀H₁₅N₃O₄)：样品检测C：49.72％；H：6.26％；N：17.38％。
(理论值：C：49.79％；H：6.27％；N：17.42％)
实施例3
2’-OMe-CR的纯化
将参考例3中合成的2’-OMe-CR水溶液100ml用10N NaOH调PH至13.5，上样到400ml氯型碱性树脂上。然后用2--5℃的水洗并收集流出液，直至流出液无紫外吸收。合并收集液在55℃下减压浓缩去除水分，得到白色固体。此固体在60℃下减压干燥至恒重，得6.6g.
HPLC分析：含5-Me-dCR(99.99％)，2’-OMe-UR及作为副产物的尿嘧啶，胞嘧啶未被检出。检测界限(0.01％)以下。
元素分析(C₁₀H₁₅N₃O₄)：样品检测C：46.62％；H：5.87％；N：16.25％。
(理论值：C：46.69％；H：5.88％；N：16.33％)
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。