长效胸腺素Α1的聚乙二醇化修饰物.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102757500 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102757500 A *CN102757500A* (21)申请号 201210273263.0 (22)申请日 2005.11.10 200510117752.7 2005.11.10 C07K 17/08(2006.01) A61K 38/22(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61P 31/20(2006.01) A61P 31/14(2006.01) A61P 31/18(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军军。

2、事医学科学院毒 物药物研究所 地址 100850 北京市海淀区太平路 27 号 (72)发明人 刘克良 郄建坤 马金波 郑建全 董泗建 周文霞 齐春会 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商标事务所 11038 代理人 唐伟杰 (54) 发明名称 长效胸腺素 1 的聚乙二醇化修饰物 (57) 摘要 本发明涉及胸腺素 1 聚乙二醇化修饰物 （T1 PEGs） ， T1 PEG s 的制备方法， 含它 们的药物组合物， 及其在治疗或预防免疫缺陷、 免 疫功能低下等相关疾病的药物中的用途， 包括在 乙型肝炎、 丙型肝炎、 肝癌、 恶性黑色素瘤、 非小细 胞性肺癌、 冠状病毒引起的 SA。

3、RS、 艾滋病等相关 疾病的治疗或预防中的应用。 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 14 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 14 页 附图 4 页 1/2 页 2 1. 式 （I） 化合物及其 PEG 修饰物 ： Z-Cysx(PEG-M)-（Aa） n T (I) 其中 ： Z 为 H、 甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 丁基、 戊基、 异戊基、 甲酰基、 乙酰基、 丙酰 基、 氨甲酰基、 苄氧羰基、 芴甲酰基， 优选为乙酰基、 氨甲酰基， M （MAL） ， 或 或PEG 为 。

4、RO(CH2CH2O)m-CH2CH2， R H 或 CH3， m 5 2000 ； Cys 为半胱氨酸， 它通过侧链硫醚原子与 M 基团共价相连， Cys 还以其羧基与 T 的 N 端氨基形成酰胺键相连， 或以其氨基与T的C端羧基形成酰胺键相连 ； T表示天然T1全 序列或其任意位点被至少一个 cys 取代的类似物， T 或其所述类似物 N 端乙酰化 ； x 表示 Cys 在 T 中的位置， x 1 30 ； Aa 表示 20 种天然氨基酸的任一种或几种氨基酸的组合， n 0 10。 2.权利要求1的化合物或其PEG修饰物， 其中含T1及其半胱氨酸衍生物的序列以下 式表示 ： Z-Cysx-。

5、(Aa)n-T 或 Z-T (Aa)n-Cys NH2 即 ： 当 n 0 时， Cys 可在 T 的 N 末端、 C 末端以及其它 （1 29） 中的任一位置 ； 当 n 1 10 时， Aa 可为天然 20 种氨基酸中的任一种或几种氨基酸的组合， 其中包括 Ala， Arg， Asn， Asp， Cys， Gln， Glu， Gly， His， Ile， Leu， Lys， Met， Phe， Pro， Ser， Thr， Trp， Tyr， Val 等， Aa 优选 Gly、 Ala、 Val、 Leu。 3. 权利要求 1 的化合物或其 PEG 修饰物， 其中所述 PEG 修饰物为 ：。

6、 Ac Cys5（mPEG5000 MAL） T1（BTJB005） ； Ac Cys8（mPEG5000 MAL） T1（BMJB008） ； Ac Cys11（mPEG5000 MAL） T1（BMJB011） ； Ac Cys16（mPEG5000 MAL） T1（BMJB016） ； Ac Cys17（mPEG5000 MAL） T1（BMJB017） ； Ac Cys21（mPEG5000 MAL） T1（BMJB021） ； 或 Ac Cys24（mPEG5000 MAL） T1（BMJB024） 。 4. 以下符号表示的化合物 ： BMJB012 ； BMJB013 ； BMJB。

7、014 ； BMJB015 ； BMJB016 ； BMJB017 ； BMJB018 ； BMJB019 ； BMJB020。 权 利 要 求 书 CN 102757500 A 2 2/2 页 3 5. 药物组合物， 其含有至少一种权利要求 1-4 任一项的化合物或其 PEG 修饰物及药物 载体或赋形剂。 6.权利要求14中任一项的化合物或其PEG修饰物在制备用于预防或治疗与免疫缺 陷或免疫功能低下相关疾病的单独用药或联合用药中的用途， 包括在乙型肝炎， 丙型肝炎， 肝癌， 恶性黑色素瘤， 非小细胞性肺癌， 冠状病毒引起的 SARS， 艾滋病等相关疾病的治疗或 预防中的应用。 权 利 要 求。

8、 书 CN 102757500 A 3 1/14 页 4 长效胸腺素 1 的聚乙二醇化修饰物 0001 本申请是基于申请号为 200910207003.1， 申请日为 2005 年 11 月 10 日， 发明名称 为 “长效胸腺素 1 的聚乙二醇化修饰物” 的中国专利申请的分案申请。 发明领域 0002 本发明涉及胸腺素1聚乙二醇化修饰物 （T1PEGs） ， T1PEG s的制备方 法， 含它们的药物组合物， 及其在治疗或预防与免疫缺陷、 免疫功能低下相关疾病的单独用 药或联合用药中的用途， 包括在乙型肝炎， 丙型肝炎， 肝癌， 恶性黑色素瘤， 非小细胞肺癌， 冠状病毒引起的 SARS（严重。

9、的急性呼吸综合症） ， 艾滋病等相关疾病的治疗或预防中的应 用。 背景技术 0003 胸腺素 1（Thymosin alpha1， T1） 是由胸腺分泌的活性多肽之一， 具有很高的 序列保守性， 不同种属来源的T1具有相同的化学结构。 T1由28个氨基酸残基组成， 分 子量为 3108， 等电点为 4.2， N 端为乙酰化结构。T1 的一级结构如下 ： 0004 1 10 0005 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys- 0006 20 28 0007 Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val。

10、-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0008 T1是针对T淋巴细胞的免疫增强剂， 能促进T细胞的成熟和分化， 并促使成熟的 T 细胞分泌多种淋巴因子 （如白介素 2 和 干扰素等） ， 还能促进白介素 2 受体的生 成 ； 另外， 对一些病毒感染细胞和某些肿瘤细胞的生长有直接地抑制或杀伤作用。 作为免疫 增强剂， 对免疫缺陷和免疫功能低下的疾病均有较好的疗效， 其临床治疗研究始于 20 世纪 80 年代。当单独使用或与干扰素联合使用治疗慢性乙型肝炎时， 是一种安全有效的药物。 对于许多其它疾病， 如丙型肝炎、 肝癌、 恶性黑色素瘤、 非小细胞肺癌和艾滋病等， T1 都有 一。

11、定的疗效。此外， 也可作为疫苗辅助用药， 来加强流感疫苗和乙型肝炎疫苗的效果。 0009 目前临床使用的 T1 为化学合成品， 消毒干粉制剂， 治疗慢性乙型肝炎的临床给 药剂量1.6mg/次， 注射2次/周， 6个月/疗程， 具有给药剂量大、 注射次数频繁及价格昂贵 等不足之处。因此， 改善 T1 的体内代谢行为， 提高生物利用度， 延长作用时间， 得到长效 T1 类似物具有重要意义。 发明内容 0010 本发明人经研究已发现 T1 经聚乙二醇 （PEG） 共价修饰后的修饰产物， 其体内生 物利用度得到显著改善， 体内作用时间被显著延长， 并保持良好的免疫增强活性。 0011 本发明涉及式 （。

12、I） 所示的 T1 的 PEG 化修饰物 ： 0012 Z-Cysx(PEG-M)-（Aa） n T （I） 说 明 书 CN 102757500 A 4 2/14 页 5 0013 M（MAL） ， 或或-NHZH、 甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 丁基、 戊基、 异戊基、 甲酰基、 乙酰基、 丙酰基、 氨甲酰基、 苄氧羰基、 芴甲酰基等， 优 选为乙酰基、 氨甲酰基 ； 其中 ： PEG 为 RO(CH2CH2O)m-CH2CH2-， R H 或 CH3， m 5 2000 ； Cys 为半胱氨酸， 其通过侧链硫醚原子与 M 基团共价连接 ； 当 n 0 时， Cys 以其羧基与 T 的。

13、 N 端氨基酸形成酰胺键相连， 或以其氨基与 T 的 C 端羧基形成酰胺键相连， Cys 可位于 T 序列的两端、 任意两相邻氨基酸之间以及替代任意位置的氨基酸 ； 当 n 1 10 时， Cys 可通过 Aa 与 T 序列的 N 末端或 C 末端相连， Aa 为 20 种天然氨基酸中的任一种或几种 的任意组合， 其中包括 Ala， Arg， Asn， Asp， Cys， Gln， Glu， Gly， His， Ile， Leu， Lys， Met， Phe， Pro， Ser， Thr， Trp， Tyr， Val 等， Aa 优选 Gly、 Ala、 Val、 Leu ； 0014 T 表。

14、示天然 T1 全序列或其任意位点被至少一个 cys 取代的类似物。 0015 本发明另一方面涉及含至少一种式 （I） 化合物及药用载体或赋形剂的药物组合 物。 0016 本发明还涉及至少一种式 （I） 化合物在制备用于预防或治疗与免疫缺陷或免疫功 能低下相关疾病的药物中用途， 包括在乙型肝炎， 丙型肝炎， 恶性黑色素瘤， 非小细胞性肺 癌， 冠状病毒引起的 SARS， 艾滋病等相关疾病的治疗或预防中的应用。 0017 本发明中所有氨基酸的构型， 除注明为 D 型外， 均为 L 型。根据本发明， 所涉 及的平均分子量由几百到几万的 PEG 修饰剂可作为商品化试剂购买到。 0018 T1 全序列可。

15、用常规的固相或液相多肽合成法合成， 在合成过程中很容易在 N 端， C 端， 或 T1 中任意其它位置引入或替换为 Cys， 将含 Cys 的肽链溶于水中， 调 pH 近 中性， 加入 PEG 修饰剂， 以高效液相色谱纯化得到 PEG 修饰的 T1。 0019 本发明应用固相多肽合成法， 将 Cys 引入 T 的各个位点， 得到 T 的衍生物 Z Cysx-（Aa） n T， 经裂解、 纯化后， 与平均分子量为 750、 1100、 2000 及 5000 的 PEG 修饰 剂反应， 以 HPLC 纯化， 经冰冻干燥， 得到 Z Cysx(PEG-M)-（Aa） n T。产物经 HPLC 分 。

16、析为单一峰， 经生物质谱鉴定结构正确。 0020 根据本发明， 本发明的药物组合物制成适用于哺乳动物用的各种剂型， 例如用甘 露醇作赋形剂制成注射剂。 0021 根据本发明， 本发明中术语 “类似物” 是指天然 T1 全序列中的任意位点被至少 一个 cys 取代形成的 T1 序列。 0022 说明书中出现的 PEG5000表示平均分子量为 5000 的 PEG。 0023 根据本发明， 本发明中所涉及的 T1 序列及其半胱氨酸衍生物， 优选如下的序 列 ： 0024 BMJBT001: 0025 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Cys-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Th。

17、r-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0026 BMJBT002: 0027 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Cys-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 说 明 书 CN 102757500 A 5 3/14 页 6 0028 BMJBT003: 0029 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-。

18、Glu-Cys-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0030 BMJBT004: 0031 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Cys-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0032 BMJBT005: 0033 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-As。

19、p-Leu-Cy s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0034 BMJBT006: 0035 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Cys-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0036 BMJBT007: 0037 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys。

20、-Glu-Val-Val-Cys-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0038 BMJBT008: 0039 Ac-Cys-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Le u-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0040 BMJBT009: 0041 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-G。

21、lu-Ala-Glu-Asn-Cys-NH2 0042 BMJBT010: 0043 Ac-Cys-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0044 BMJBT011: 0045 Ac-Ser-Cys-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。

22、 0046 BMJBT012: 0047 Ac-Ser-Asp-Cys-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0048 BMJBT013: 0049 Ac-Ser-Asp-Ala-Cys-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0050 BMJBT014: 0051 A。

23、c-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Cys-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0052 BMJBT015: 0053 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Cys-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 说 明 书 CN 102757500 A 6 4/14 页 7 0054 BMJBT0。

24、16: 0055 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Cys-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0056 BMJBT017: 0057 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Cys-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0058 BMJBT018: 0059 Ac-Ser-Asp-Al。

25、a-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Cys-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0060 BMJBT019: 0061 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Cys-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0062 BMJBT020: 0063 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-。

26、Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Cys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0064 BMJBT021: 0065 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Cys-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0066 BMJBT022: 0067 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Ly。

27、s-Asp-Leu-Ly s-Cys-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0068 BMJBT023: 0069 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Cys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0070 BMJBT024: 0071 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys。

28、-Cys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0072 BMJBT025: 0073 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Cys-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0074 BMJBT026: 0075 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Cys-Glu-G。

29、lu-Ala-Glu-Asn-OH 0076 BMJBT027: 0077 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Cys-Ala-Glu-Asn-OH 0078 BMJBT028: 0079 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Cys-Glu-Asn-OH 说 明 。

30、书 CN 102757500 A 7 5/14 页 8 0080 BMJBT029: 0081 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Cys-Asn-OH 0082 BMJBT030: 0083 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-C。

31、ys-OH 0084 根据本发明， 本发明优选的 T1 的 PEG 化修饰物为 ： 0085 BTJB005， 0086 BTJB006， 0087 BTJB007， 0088 BTJB008， 0089 BTJB009， 0090 BTJB010， 0091 BTJB011， 0092 BTJB012， 0093 BTJB013， 0094 BTJB014， 0095 BTJB015， 0096 BTJB016， 0097 BTJB017， 0098 BTJB018， 0099 BTJB019， 0100 BTJB020， 0101 BTJB021， 0102 BTJB022， 0103 B。

32、TJB023， 0104 BTJB024。 0105 根据本发明， 符号 “BMJBT” 表示由一个 cys 在 T1 不同位点取代的 T1 序列 ； “BMJB” 表示 PEG 化的 BMJBT。 附图说明 0106 图 1T1 的小鼠体内血药浓度 - 时间曲线。 0107 图 2T1 及其 PEG 修饰物 BMJB013 的小鼠体内血药浓度 - 时间曲线。 0108 图 3T1 及其 PEG 修饰物 BMJB014 的小鼠体内血药浓度 - 时间曲线。 0109 图 4T1 及其 PEG 修饰物 BMJB015 的小鼠体内血药浓度 - 时间曲线。 0110 图 5T1 及其 PEG 修饰物 。

33、BMJB016 的小鼠体内血药浓度 - 时间曲线。 0111 图 6T1 及其 PEG 修饰物 BMJB017 的小鼠体内血药浓度 - 时间曲线。 0112 图 7T1 及其 PEG 修饰物 BMJB018 的小鼠体内血药浓度 - 时间曲线。 0113 图 8T1 及其 PEG 修饰物的小鼠体内血药浓度 - 时间曲线。 说 明 书 CN 102757500 A 8 6/14 页 9 0114 图 9T1 及其类似物的小鼠体内血药浓度 - 时间曲线。 0115 根据本发明中使用的缩写词具有下面的含义 ： 0116 T1 胸腺素 1 PEG 聚乙二醇 0117 Ala 丙氨酸 Arg 精氨酸 01。

34、18 Asn 天冬酰胺 Asp 天冬氨酸 0119 Cys 半胱氨酸 Gln 谷氨酰胺 0120 Glu 谷氨酸 Gly 甘氨酸 0121 His 组氨酸 Ile 异亮氨酸 0122 Leu 亮氨酸 Lys 赖氨酸 0123 Met 甲硫氨酸 Phe 苯丙氨酸 0124 Pro 脯氨酸 Ser 丝氨酸 0125 Thr 苏氨酸 Trp 色氨酸 0126 Tyr 酪氨酸 Val 缬氨酸 0127 Ac 乙酰基 MAL 马来酰亚胺 0128 Fmoc 芴甲氧羰基 DMF 二甲基甲酰胺 0129 DCC 二环己基碳二亚胺 0130 HBTU 2-（1H-1- 羟基苯并三唑） -1,1,3,3- 四甲。

35、基脲六氟磷酸盐 0131 HOBt 1 羟基苯并三唑 HOSu N 羟基琥珀酰亚胺 0132 NMM N 甲基吗啡啉 TFA 三氟乙酸 0133 TsCl 对甲苯磺酰胺 EDT 巯基乙醇 0134 RP HPLC 反相高效液相色谱 0135 IFN 干扰素 具体实施方式 0136 实施例 0137 下述实施例代表本发明的说明性实施方案， 但本发明不受这些实施例的限制。实 施例所用平均分子量为 2000 85000 的 mPEG 修饰剂， 固相合成载体 Wang 树脂为南开合成 产品， TFA、 Rink 酰胺树脂、 DCC、 HOBt、 Fmoc 氨基酸为吉尔生化产品。 0138 实施例 1 。

36、： Ac Cys5（mPEG5000 MAL） T1（BTJB005） 0139 1.1Ac Cys5T1 的合成 ： 0140 用固相法合成 Cys5T1 ： 以 Wang 树脂 100mg 为固相载体， Fmoc AA OH （1 10 倍量） 为原料， DCC（1 10 倍量） 、 HOBt（1 10 倍量） 为缩合剂， 除以 Cys5替换 Val5 外， 其余氨基酸残基按T1序列合成， 得到AcCys5T1的全保护肽树脂。 干燥后， TFA 裂解， 室温反应 20-200 分钟， 滤除树脂， 加入乙醚沉淀出白色固体， 水溶解， 冰冻干燥， 得白 色固体 161mg。RP HPLC 纯化。

37、， ESI MS 鉴定， M2+峰 ： 1551.0（理论值 ： 3098） 。 0141 1.2Ac Cys5（mPEG5000 MAL） T1 的合成 0142 将纯化后的AcCys5T1溶于水中， 调pH510范围内， 加入mPEG5000修饰剂， 室温反应， 用 RP HPLC 分离产物， 冰冻干燥， 得到白色固体 17.8mg， 收率 38.2%。 0143 Ac Cys5（mPEG5000 MAL） T1 经 MALDI TOF MS 鉴定， 在 8373 附近有一 说 明 书 CN 102757500 A 9 7/14 页 10 系列峰， 相邻两峰分子量相差约 44， 具有聚乙二。

38、醇的典型结构特征。 0144 实施例 2 ： Ac Cys8（mPEG5000 MAL） T1（BMJB008） 0145 按照实施例 1.1 方法合成 Ac Cy s8T1， 得粗肽 116mg。RP HPLC 纯化， ESI MS 鉴定， M2+峰 ： 1543.0（理论值 ： 3083） 。 0146 按照实施例 1.2 方法合成 Ac Cys8（mPEG5000 MAL） T1， HPLC 分离产物， 冰 冻干燥， 得到白色固体 16.9mg， 收率 37.1%。 0147 Ac Cys8（mPEG5000 MAL） T1 经 MALDI TOF MS 鉴定， 在 8247 附近有一 。

39、系列峰， 相邻两峰分子量相差约 44， 具有聚乙二醇的典型结构特征。 0148 实施例 3 ： Ac Cys11（mPEG5000 MAL） T1（BMJB011） 0149 按照实施例1.1方法合成AcCys11T1， 得粗肽143mg。 RPHPLC纯化， ESI MS 鉴定， M3+峰 ： 1034.9（理论值 ： 3098） 。 0150 按照实施例 1.2 方法合成 Ac Cys11（mPEG5000 MAL） T1， HPLC 分离产物， 冰 冻干燥， 得到白色固体 21.4mg， 收率 28.9%。 0151 Ac Cys11（mPEG5000 MAL） T1 经 MALDI T。

40、OF MS 鉴定， 在 8282 附近有一 系列峰， 相邻两峰分子量相差约 44， 具有聚乙二醇的典型结构特征。 0152 实施例 4 ： Ac Cys16（mPEG5000 MAL） T1（BMJB016） 0153 按照实施例1.1方法合成AcCys16T1， 得粗肽147mg。 RPHPLC纯化， ESI MS 鉴定， M3+峰 ： 1034.0（理论值 ： 3098） 。 0154 按照实施例 1.2 方法合成 Ac Cys16（mPEG5000 MAL） T1， HPLC 分离产物， 冰 冻干燥， 得到白色固体 15.6mg， 收率 53.3%。 0155 Ac Cys16（mPEG。

41、5000 MAL） T1 经 MALDI TOF MS 鉴定， 在 8296 附近有一 系列峰， 相邻两峰分子量相差约 44， 具有聚乙二醇的典型结构特征。 0156 实施例 5 ： Ac Cys17（mPEG5000 MAL） T1（BMJB017） 0157 按照实施例1.1方法合成AcCys17T1， 得粗肽133mg。 RPHPLC纯化， ESI MS 鉴定， M3+峰 ： 1029.6（理论值 ： 3083） 。 0158 按照实施例 1.2 方法合成 Ac Cys17（mPEG5000 MAL） T1， HPLC 分离产物， 冰 冻干燥， 得到白色固体 17.4mg， 收率 42.。

42、6%。 0159 Ac Cys17（mPEG5000 MAL） T1 经 MALDI TOF MS 鉴定， 在 8237 附近有一 系列峰， 相邻两峰分子量相差约 44， 具有聚乙二醇的典型结构特征。 0160 实施例 6 ： Ac Cys21（mPEG5000 MAL） T1（BMJB021） 0161 按照实施例 1.1 方法合成 Ac Cy s21T1， 得粗肽 166mg。RP HPLC 纯化， ESI MS 鉴定， M3+峰 ： 1029.0（理论值 ： 3082） 。 0162 按照实施例 1.2 方法合成 Ac Cys21（mPEG5000 MAL） T1， HPLC 分离产物，。

43、 冰 冻干燥， 得到白色固体 28.3mg， 收率 49.3%。 0163 Ac Cys21（mPEG5000 MAL） T1 经 MALDI TOF MS 鉴定， 在 8263 附近有一 系列峰， 相邻两峰分子量相差约 44， 具有聚乙二醇的典型结构特征。 0164 实施例 7 ： Ac Cys24（mPEG5000 MAL） T1（BMJB024） 0165 按照实施例1.1方法合成AcCys24T1， 得粗肽162mg。 RPHPLC纯化， ESI MS 鉴定， M3+峰 ： 1029.0（理论值 ： 3082） 。 说 明 书 CN 102757500 A 10 8/14 页 11 0。

44、166 按照实施例 1.2 方法合成 Ac Cys24（mPEG5000 MAL） T1， HPLC 分离产物， 冰 冻干燥， 得到白色固体 17.3mg， 收率 37.4%。 0167 Ac Cys24（mPEG5000 MAL） T1 经 MALDI TOF MS 鉴定， 在 8281 附近有一 系列峰， 相邻两峰分子量相差约 44， 具有聚乙二醇的典型结构特征。 0168 实施例 8 ： T1、 Ac CysxT1 类似物及其 PEG 修饰产物诱导小鼠脾细胞产生 IFN 。 0169 无菌取脾制备脾细胞悬液， 用含 20小牛血清的 RPMI-1640 培养液调细胞浓度为 5106细胞/m。

45、L， 于24孔培养板中分别加入0.5mL细胞悬液、 0.25mLCon A(终浓度为0.5ug/ mL) 和 0.25mL 不同浓度的待测样品， 对照孔用 RPMI-1640 培养液代替， 置 37、 5 CO2孵 温箱中孵育 24 小时， 离心收集上清， 采用双抗体夹心 ELISA 法测定上清中 IFN- 的含量， 按照 ELISA 试剂盒说明书操作。 0170 表 1-1 T1 及其修饰物在 Con A 刺激下诱导脾细胞产生 IFN- 试验结果 （1） . 0171 0172 注 ： 每个样品中均加入 Con A， n=3， *P0.05， *P0.01， *P0.001， t 检验。 0。

46、173 表 1-2T1 及其修饰物在 Con A 刺激下诱导脾细胞产生 IFN- 试验结果 （2） . 说 明 书 CN 102757500 A 11 9/14 页 12 0174 0175 注 ： 每个样品中均加入 Con A， n=3， *P0.05， *P0.01， *P0.001， t 检验。 0176 表 1-3T1 及其修饰物在 Con A 刺激下诱导脾细胞产生 IFN- 试验结果 （3） . 说 明 书 CN 102757500 A 12 10/14 页 13 0177 0178 注 ： 每个样品中均加入 Con A， n=3， *P0.05， *P0.01， *P0.001， t 检验。 0179 结论 ： T1 经 PEG 修饰后， 仍具有促脾细胞产生 INF 的活性。 0180 实施例 9 ： T1、 Ac-CysxT1 类似物及其 PEG 修饰产物刺激 T 淋巴细胞增殖反 应 0181 首先活杀放血处死小鼠， 无菌条件下迅速取出脾脏， 制成脾细胞悬液 ； 裂解红细胞 后， 洗涤三次， 用台盼蓝染色， 活细胞数需在 95% 以上 ； 用 10% 小牛血清 1640 。