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1、(10)申请公布号 CN 103004888 A (43)申请公布日 2013.04.03 CN 103004888 A *CN103004888A* (21)申请号 201210587557.0 (22)申请日 2012.12.29 201210151985.9 2012.05.16 CN A01N 63/04(2006.01) A01N 25/12(2006.01) A01P 7/04(2006.01) A01P 7/02(2006.01) A01P 5/00(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院植物保护研究所 地址 100093 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人。
2、 农向群 张英财 张泽华 曹广春 王广君 (74)专利代理机构 北京法思腾知识产权代理有 限公司 11318 代理人 高宇 (54) 发明名称 绿僵菌颗粒制剂及其制备方法 (57) 摘要 本申请涉及生物农药领域， 具体地涉及绿 僵菌颗粒制剂及其制备方法。绿僵菌颗粒制剂 包含 ： 绿僵菌孢子粉 15%、 载体 9095%、 促活剂 0.010.45%、 保护剂0.010.10%、 润滑剂15%。 根 据本申请的技术方案大量降低了助剂的添加， 从 而较大幅度地降低了颗粒剂的加工制造成本。在 不添加粘合剂、 崩解剂、 助崩解剂的前提下， 通过 利用载体本身的理化性能和加水量的调节， 很好 的解决了载。
3、体的成粒性和崩解性。颗粒剂相对易 于干燥， 降低干燥耗能。调节加水量， 可以大幅度 降低造粒产热， 降低造粒过程对绿僵菌孢子的损 伤。添加少量的促活剂， 可以明显促进绿僵菌孢 子的萌发 ； 可以明显降低造粒过程对对孢子的损 伤， 较好地解决了造粒过程的热损伤和机械损伤 问题。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 一种绿僵菌颗粒制剂， 其特征在于， 按照重量百分比其包含 ： 绿僵菌孢子粉 15%、 载体 。
4、9095%、 促活剂 0.010.45%、 保护剂 0.010.10%、 润滑剂 15%， 其中， 孢子粉含孢量为 2.05.01010/ 克， 活孢率大于 80%。 2. 根据权利要求 1 所述的僵菌颗粒制剂， 其特征在于， 在其制备过程中， 基于绿僵菌颗 粒制剂的总组分， 加水量为 2740wt%（加水量是基于权 1 中组分的总重量） 。 3. 根据权利要求 1 所述的僵菌颗粒制剂， 其特征在于， 所述载体为选自钙质膨润土、 高 岭土、 滑石粉、 活性白土和轻质碳酸中的一种或多种。 4. 根据权利要求 3 所述的僵菌颗粒制剂， 其特征在于， 所述载体为滑石粉。 5. 根据权利要求 1 所述。
5、的僵菌颗粒制剂， 其特征在于， 促活剂为海藻糖、 酪氨酸， 优选 为酪氨酸。 6. 根据权利要求 1 所述的僵菌颗粒制剂， 其特征在于， 所述保护剂为海藻糖。 7. 根据权利要求 1 所述的僵菌颗粒制剂， 其特征在于， 润滑剂为选自大豆油、 石蜡油、 助剂油、 车辆齿轮油、 双曲线齿轮油中的一种或多种， 优选为助剂油。 8.根据权利要求1所述的僵菌颗粒制剂， 其特征在于， 所述绿僵菌为绿僵菌菌株CGMCC No.4275。 9. 一种制备绿僵菌颗粒制剂的方法， 其特征在于， 按照重量百分比其包含 ： 绿僵菌孢 子粉 15%、 载体 9095%、 促活剂 0.010.45%、 保护剂 0.010。
6、.10%、 润滑剂 15%， 所述方法包 括以下步骤 ： （1） 将促活剂、 保护剂按比例配成水溶液， 其中基于绿僵菌颗粒制剂的总组分， 加水量 为 2740wt% ； （2） 向上述水溶液加入载体中， 混合搅拌均匀 ； （3） 将绿僵菌孢子粉加入上述湿润的载体中吸附， 搅拌均匀， 造粒， 干燥。 10. 根据权利要求 9 所述的方法， 其特征在于， 造粒温度为 48.253.5。 权 利 要 求 书 CN 103004888 A 2 1/7 页 3 绿僵菌颗粒制剂及其制备方法 技术领域 0001 本申请涉及生物农药领域， 具体地涉及绿僵菌颗粒制剂及其制备方法。 背景技术 0002 金龟子绿僵。
7、菌 （Metarhizium anisopliae） 是世界性分布的杀虫真菌， 能寄生 8 目 30 科 200 余种昆虫、 螨类及线虫， 作为生物杀虫剂用于多种农林害虫的防治。因此， 为了便 于贮藏、 田间施用和提高防治效果， 通常需要将绿僵菌加工成各种剂型。 0003 颗粒剂是防治地下害虫的理想剂型， 不仅便于投撒， 更重要的作用是为绿僵菌提 供有利于生存和定殖的微环境， 从而提高其环境抗逆性和对害虫的防治效果。 0004 中国发明专利 （授权公告号 CN101411338A,2009.4.22） 公开了” 白僵菌颗粒剂及 其制备方法， 所述颗粒剂由白僵菌孢子粉、 载体、 粘合剂、 崩解剂。
8、、 助崩解剂、 分散剂、 抗紫外 剂、 润滑剂和着色剂混合后造粒而成。该方法的缺点是 ： 添加大量助剂， 成本明显提高 ； 所 使用的粘合剂、 崩解剂、 助崩解剂、 分散剂和着色剂会对菌体活性产生不利影响 ； 加入粘合 剂后不利于颗粒干燥， 曾加耗能。 发明内容 0005 因此， 本申请的发明人为了解决上述问题， 提供一种不添加粘合剂、 崩解剂的绿僵 菌颗粒制剂提出并完成了本发明。 0006 本发明的目的是提供一种绿僵菌颗粒制剂。 0007 本发明的再一目的是提供制备上述绿僵菌颗粒制剂的方法。 0008 根据本申请的绿僵菌颗粒制剂， 其按照重量百分比包含 ： 绿僵菌孢子粉 15%、 载 体 9。
9、095%、 促活剂 0.010.45%、 保护剂 0.010.10%、 润滑剂 15%， 其中， 孢子粉含孢量为 2.05.01010/ 克， 活孢率大于 80%。优选地， 在其制备过程中， 基于绿僵菌颗粒制剂的总 组分， 加水量为 2740wt%。 0009 根据本发明的绿僵菌颗粒制剂， 其中， 所述载体为选自高岭土、 轻质碳酸钙、 滑石 粉、 钙质膨润土、 活性白土的一种或多种， 优选为滑石粉， 滑石粉可以延长绿僵菌孢子的贮 存期， 在造粒过程中对绿僵菌孢子的损伤最小。根据本发明的绿僵菌颗粒制剂， 其中， 所述 促活剂为海藻糖、 酪氨酸， 优选为酪氨酸。 海藻糖和酪氨酸都可以显著提高绿僵菌。
10、孢子的萌 发率。 0010 根据本发明的绿僵菌颗粒制剂， 其中， 所述保护剂为海藻糖。 保护剂海藻糖可以降 低造粒过程对绿僵菌孢子的热损伤。 0011 根据本发明的绿僵菌颗粒制剂， 其中， 所述润滑剂为选自大豆油、 石蜡油、 助剂油、 车辆齿轮油、 双曲线齿轮油中的一种或多种， 优选为助剂油。 润滑剂可以明显降低造粒过程 对绿僵菌孢子的机械损伤。 0012 根据本申请的制备僵菌颗粒制剂的方法包括以下步骤 ： 0013 （1） 将促活剂、 保护剂按比例配成水溶液 ； 说 明 书 CN 103004888 A 3 2/7 页 4 0014 （2） 向上述水溶液加入载体中， 混合搅拌均匀 ； 001。
11、5 （3） 将绿僵菌孢子粉加入上述湿润的载体中吸附， 搅拌均匀， 造粒， 干燥。 0016 根据本发明的绿僵菌颗粒制剂及其制备方法不添加粘合剂、 崩解剂， 同时解决了 颗粒剂成粒性和崩解性问题， 降低加工过程对绿僵菌孢子的损伤， 提高颗粒中孢子的活性。 0017 根据本发明的绿僵菌颗粒制剂的制备方法， 加水量对造粒产热的影响 ： 加水量对 造粒产热影响非常明显 （图 2） 。在一定范围内随着加水量的增加造粒温度逐渐降低。在系 列加水量下， 钙质膨润土的造粒温度为 86.650.2， 高岭土的造粒温度为 98.654.3， 滑石粉的造粒温度为 56.2 48.2， 活性白土的造粒温度为 97.4。
12、51.3， 轻质碳酸钙的 造粒温度为 78.549.6。 0018 本申请的优点 ： 大量降低了助剂的添加， 从而较大幅度地降低了颗粒剂的加工 制造成本。在不添加粘合剂、 崩解剂、 助崩解剂的前提下， 通过利用载体本身的理化性能 和加水量的调节， 很好的解决了载体的成粒性和崩解性。同时， 由于不添加粘合剂， 颗粒剂 相对易于干燥， 降低干燥耗能。通过调节加水量， 可以大幅度降低造粒产热， 降低造粒过 程对绿僵菌孢子的损伤。 添加少量的促活剂， 可以明显促进绿僵菌孢子的萌发 ； 添加少量 保护剂和润滑剂， 可以明显降低造粒过程对对孢子的损伤， 较好地解决了造粒过程的热损 伤和机械损伤问题。 附图。
13、说明 0019 图 1A 图 1E 显示加水量对不同载体成粒性的影响， 图 1A ： 钙质膨润土 ； 图 1B ： 高 岭土 ； 图 1C ： 滑石粉 ； 图 1D ： 活性白土 ； 图 1E ： 轻质碳酸钙 .。 0020 图 2A 图 2E 显示加水量对不同载体造粒温度的影响， 图 2A ： 钙质膨润土 ； 图 2B ： 高岭土 ； 图 2C ： 滑石粉 ； 图 2D ： 活性白土 ； 图 2E ： 轻质碳酸钙。 具体实施方式 0021 实施例 1 绿僵菌颗粒制剂的制备 0022 使用高效杀虫真菌绿僵菌菌株 MBJQH2-2， 其保藏编号为 ： CGMCC No.4275， 其记载 于中国。
14、专利公开文本 CN102021122A， 孢子粉含孢量为 2.05.01010/ 克， 活孢率大于 80%， 绿僵菌颗粒制剂的配方如以下表 1 所示 0023 表 1 绿僵菌颗粒配方 0024 说 明 书 CN 103004888 A 4 3/7 页 5 0025 15 号造粒后， 颗粒中绿僵菌孢子的损伤率分别为 96.82%、 95.08%、 100.00%、 100.00% 和 28.84%。610 号造粒后， 颗粒中绿僵菌孢子的损伤率分别， 25.83%、 24.76%、 23.39%、 23.02% 和 21.94%， 与 5 号相比保护率分别为 3.42%、 4.91%、 6.82%。
15、、 7.34% 和 8.85%， 绿僵菌孢子的损伤率均有改善， 同时添加促活剂和保护剂的 810 号的孢子损失率要低于 只添加促活剂的 6 号和只添加保护剂的 7 号， 其中 10 号效果最明显， 其保护率 （8.85%） 要大于 6 号 （3.42%） 7 号 （4.91%） 之和。1116 号造粒后， 颗粒中绿僵菌孢子的损伤率分 别 16.01%、 12.52%、 18.22%、 16.57%、 17.76% 和 8.87%， 与 5 号相比保护率分别为 17.32%、 22.20%、 14.23%、 16.54%14.88% 和 28.06%， 绿僵菌孢子的损伤率均有改善， 同时添加促 。
16、活剂、 保护剂和润滑剂的 16 号孢子损伤率要低于 6 号、 7 号和 12 号， 且 16 号的保护率 说 明 书 CN 103004888 A 5 4/7 页 6 （28.06%） 要大于 7 号 （4.91%） 12 号 （22.20%） 。 0026 实施例 2 0027 实施例 2-1 载体对绿僵菌活力的影响 0028 （1） 载体浸出液对孢子萌发的影响 0029 分别称取载体各 1g， 置于灭过菌的装有玻璃珠和 0.1% 吐温 -80 的试管中， 用漩涡 振荡器振匀， 浸泡 24h 后离心取上清液。取适量孢子粉， 置于灭过菌的装有玻璃珠的试管 中， 加入上述载体上清液， 漩涡振荡匀。
17、散， 制成孢子悬浮液， 经血球计数板显微计数后调整 到 107 孢子 /mL 浓度， 吸取 100L， 接种到蔗糖琼脂平板上。每种载体接种 3 个平板作为重 复。以 0.1% 吐温 -80 配制的孢悬液为对照。25培养 24h 后显微镜检查孢子萌发率。 0030 方差分析显示， 供试的 10 种载体对绿僵菌孢子萌发没有显著影响 （F 1.3690， P=0.2261） 。不同载体作用下， 孢子萌发率为 51.73% 63.12%。其中， 最低为滑石粉， 最高 为凹凸棒土 （表 2） 。 0031 表 2 不同载体对绿僵菌孢子萌发的影响 0032 0033 0034 实施例 2-2 载体对孢子贮。
18、存活性的影响 0035 将孢子粉与灭过菌的各载体按质量 5:95 比例混合均匀， 分装到 1.5mL 离心管中， 密封后分别贮存于4、 15和25， 定期于1周、 2周、 3周、 4周后取出， 检测单位质量所含 的活孢量 （菌落数） ， 每种载体 5 个平板， 以纯孢子粉为对照。 0036 不同载体对孢子的贮存活性的影响不尽相同， 而同一载体在不同温度下对孢子的 贮存活性的影响是一致的。 相对于纯孢子粉的贮存， 钙质膨润土、 高岭土、 滑石粉、 活性白土 和轻质碳酸可以延缓孢子失活 ； 珍珠岩和硅藻土在2周内可以保持孢子活力， 但2周后孢子 活力下降快于纯孢子粉对照 ； 凹凸棒土、 菜籽粕、 。
19、钠质膨润土不利于孢子贮藏。 0037 通过载体对绿僵菌活力的影响， 筛选出了钙质膨润土、 高岭土、 滑石粉、 活性白土 和轻质碳酸 5 种载体对孢子萌发率影响较小， 能延缓孢子失活。 0038 实施例 2-3 促活剂对绿僵菌活力的影响 0039 在含 2% 蔗糖的琼脂培养基中分别添加不同量的促活剂海藻糖和酪氨酸， 使促活 剂终浓度为 0.01% 0.45% 范围的 10 个浓度梯度， 制成平板。接种 100L 孢子悬浮液， 每 处理 3 个平板， 以不加促活剂的平板为对照。25培养 24h 后显微镜查测孢子萌发率。 0040 试验结果表明， 在 0.01% 0.45% 浓度范围内促活剂海藻糖和。
20、酪氨酸都能显著地 说 明 书 CN 103004888 A 6 5/7 页 7 促进绿僵菌孢子的萌发， 但浓度间并没有显著差异 （F 1.2080， P=0.3435 ； F 1.6880， P 0.1578） 。不同浓度海藻糖和酪氨酸对孢子萌发的促进率分别为 15.12% 24.88% 和 15.06% 29.67%， 两者差异不明显， 浓度与萌发促进率间没有显著相关性 （表 3） 。 0041 表 3 不同浓度促活剂对绿僵菌孢子萌发的影响 0042 0043 0044 通过添加促活剂海藻糖和酪氨酸， 可以显著提高绿僵菌孢子的萌发率， 而且添加 量较低， 0.01% 即可。 0045 实施例。
21、 2-4 加水量对载体成粒性和造粒产热的影响 0046 将载体分别与不同水量 （表 4） 搅拌均匀， 进行挤压造粒 （DJ-18 多功能挤压造粒 机， 孔径 2mm） ， 干燥后用筛分法测定 2mm 孔径筛上的存留颗粒重量占样品总重的百分率， 即 成粒率， 评价载体成粒性。 0047 同时检测各载体不同加水量下的造粒温度 （温度计测量颗粒的温度） ， 评价造粒产 热作用。 0048 表 4 不同载体设计加水量 说 明 书 CN 103004888 A 7 6/7 页 8 0049 0050 （1） 加水量对载体成粒性的影响 0051 加水量对载体成粒性影响非常明显 （图 1） 。在一定范围内随。
22、着加水量的增加载体 的成粒率提高。在间隔 5% 的加水量梯度条件下， 钙质膨润土在 5% 25% 加水量时， 成粒率 为 55.11% 91.26% ； 高岭土在 25% 45% 的加水量时， 成粒率为 36.02% 93.37% ； 滑石 粉在 20% 40% 的加水量时， 成粒率从 81.48.% 95.00% ； 酸性白土在 5% 25% 的加水量 时， 成粒率为 47.29% 96.43% ； 轻质碳酸钙在 20% 50% 的加水量时， 成粒率为 58.47% 93.47%。 虽然增加加水量可以提高载体的成粒率， 但加水量增加到一定限值时， 载体颗粒出 现粘结现象。当钙质膨润土、 高岭。
23、土、 滑石粉、 活性白土和轻质碳酸钙加水量分别达到 25%、 40%、 40%、 25% 和 45% 时出现颗粒粘结， 不宜再增加加水量。 0052 （2） 加水量对造粒产热的影响 0053 加水量对造粒产热影响非常明显 （图 2） 。在一定范围内随着加水量的增加造粒温 度逐渐降低。在系列加水量下， 钙质膨润土的造粒温度为 86.6 50.2， 高岭土的造粒温 度为 98.6 54.3， 滑石粉的造粒温度为 56.2 48.2， 活性白土的造粒温度为 97.4 51.3， 轻质碳酸钙的造粒温度为 78.5 49.6。 0054 结论 0055 在不添加粘合剂的情况下， 通过调节加水量使载体成粒。
24、率达到 90% 以上， 降低了 生产成本 ； 使造粒温度下降到 50左右， 从而降低造粒过程对菌体的损伤。 0056 实施例 2-5 海藻糖对绿僵菌的热保护作用 0057 将海藻糖按 0.01%、 0.05%、 0.10% 的比例与载体、 孢子粉加水混合均匀， 进行造粒。 测定造粒前后孢子活性变化。 0058 三种浓度的海藻糖都起到一定的保护作用， 保护率分别为 7.66%、 8.18% 和 9.70%。 0059 表 5 不同浓度海藻糖对绿僵菌的热保护作用 0060 说 明 书 CN 103004888 A 8 7/7 页 9 0061 通过添加保护剂海藻糖， 可以降低造粒过程对绿僵菌孢子的。
25、损伤。 0062 实施例 2-6 润滑剂对孢子的机械保护作用 0063 将大豆油、 助剂油、 石蜡油、 车辆齿轮油、 双曲线齿轮油 5 种润滑剂按比例与载体、 孢子粉加水混合均匀， 进行造粒， 测定造粒前后孢子活性变化。 0064 5 种润滑剂都能显著降低造粒过程对绿僵菌孢子的损伤。5 种润滑剂对绿僵菌 孢子的机械保护作用效果比较明显， 保护率分别为 17.32%、 22.20%、 14.23%、 16.54% 和 14.88%， 其中助剂油效果最好。 0065 表 65 种润滑剂对绿僵菌孢子的机械保护作用 0066 0067 通过添加润滑剂， 可以明显降低造粒过程中机械挤压对绿僵菌孢子的损伤。 说 明 书 CN 103004888 A 9 1/5 页 10 图 1A 图 1B 说 明 书 附 图 CN 103004888 A 10 2/5 页 11 图 1C 图 1D 说 明 书 附 图 CN 103004888 A 11 3/5 页 12 图 1E 图 2A 说 明 书 附 图 CN 103004888 A 12 4/5 页 13 图 2B 图 2C 图 2D 说 明 书 附 图 CN 103004888 A 13 5/5 页 14 图 2E 说 明 书 附 图 CN 103004888 A 14 。