甘油氧化酶制剂的制备方法及其在测定血清甘油三酯中的应用.pdf

甘油氧化酶(GO)制剂的制备方法及其在测定血清甘油三酯中的应用。制备方法由菌种选育与培养，亚硝基胍诱变，菌体收集，液氮研磨，硫酸铵分级沉淀，蛋白脱盐，凝胶过滤层析，离子交换层析，冷冻干燥等步骤完成。GO的应用方法包括试剂配制：即0.1mol/L TES缓冲液配制、储存液配制、三酶合剂配制；贮存液与三酶合剂按体积比14∶1比例配制成工作液，空白管、标准管、样品管各注入3.0ml工作液，并分别注入0.05ml蒸馏水、0.05ml甘油标准液、0.05ml待测样品液，37℃水浴保温20分钟，500nm波长比色，计算TG含量。本发明解决了GO的批量化生产问题，其应用代替了磷酸甘油氧化酶法(GPO法)中的GK和GPO两种酶，大大降低了原材料成本，其推广应用可产生明显的社会效益和经济效益。

1.  一种甘油氧化酶制剂的制备方法，其特征为该方法是按照以下步骤实现的：
——菌种选育与培养：取日本曲霉AS8586接孢子于土豆斜面培养基上，30℃培养4天；
——亚硝基胍诱变：将培养的AS8586土豆斜面培养基用无菌水冲洗制备孢子悬液，并稀释至10⁷/ml孢子；按重量体积比1∶1的比例，称取亚硝基胍于三角瓶中，接入上述孢子悬液并充分混匀后，摇床震荡100分钟时取出0.5ml菌液，用生理盐水稀释至10²/ml孢子，取0.1ml涂布土豆斜面培养基上30℃温箱培养，长出单菌落时，随即挑取20个菌落划斜面，温箱培养24小时，将菌种斜面用无菌水冲洗制备孢子悬液按体积比1∶100的比例将孢子悬液接入盛有原始发酵液体培养基的三角瓶中，30℃摇床培养48小时；
——菌体收集：以布氏漏斗真空抽滤菌体，蒸馏水充分洗涤去除残留的发酵液体培养基至滤液无色透明为止，抽干后的菌体称重；
——液氮研磨：将10²/ml的菌体放入研钵，按菌体1ml加1克石英沙和1ml液氮的比例，加入石英沙和液氮，充分研磨，重复6次，溶于100ml的0.05mol/L硼酸缓冲液中使pH为9.5，充分混匀，于8000rpm离心30分钟，收集上清液；
——硫酸铵分级沉淀：将盛有上清液的烧杯放在另一装有冰水的大烧杯内，磁力搅拌，边搅拌边徐徐加入硫酸铵至40％饱和度，4℃静止1小时后20000g离心20分钟，收集上清液继续加入硫酸铵至80％饱和度，搅拌10分钟，4℃静止1小时后20000g离心20分钟，收集沉淀；
——蛋白脱盐：将分离得到的沉淀物，溶于0.05mol/L的硼酸缓冲液中，装入透析带，在体积比为1∶100的同种缓冲液中透析除盐24小时，其中更换透析液3次；
——凝胶过滤层析：将透析后样品上样于预先经0.05mol/L硼酸缓冲液充分平衡的1×100cm的Sephadex G-200柱进行层析分离，流速为0.2ml/min每管收集20min；洗脱液与平衡液相同，层析时监测A280紫外吸收和酶的活性，确定GO所在的蛋白峰，合并收集液；
——离子交换层析：将上述合并收集的组分上样于DEAE-SephadexA-25柱，进行离子层析分离、收集紫外吸收部分酶活在5u/ml以上组分；
——冷冻干燥：将上述得到的样品放入培养皿，-20℃冷冻过夜，第二天放入冷冻干燥机冻干10小时，即可制得甘油氧化酶制剂成品。

2.  一种权利要求1所述的甘油氧化酶制剂在测定血清甘油三酯中的应用方法，其特征是该应用方法按以下步骤完成；
——试剂配制：

0.  1mol/L TES缓冲液配制：准确称取5.72g TES，0.508g MgCl₂溶于蒸馏水中，加水至250ml，使其pH为8；
储存液配制：准确称量48.8mg 4-AA，238.5mg的3，5二氯对羟基苯磺酸钠，溶于上述TES缓冲液100ml；
三酶合剂：准确称取比活力≥526U/mg的Lipase 10mg，比活力≥250U/mg的POD4mg，比活力≥50U/mg的GO10mg溶于10ml TES缓冲液内冻干；
——测定方法：
贮存液与三酶合剂按体积比14∶1比例配制成工作液，取三个试管各加入3.0ml工作液，分别标注为空白管、标准管、样品管，空白管注入0.05ml蒸馏水，标准管注入0.05ml甘油标准液，样品管注入0.05ml待测样品液，37℃水浴保温20分钟，500nm波长比色，按下列公式计算TG含量；
                   C_样品＝A_样品/A_标准×C_标准
其中：C_样品＝被测样品浓度
      C_标准＝甘油标准液浓度
      A_样品＝被测样品吸光度
      A_标准＝甘油标准液吸光度。

甘油氧化酶制剂的制备方法及其在测定血清甘油三酯中的应用
技术领域：本发明涉及甘油氧化酶制剂的制备及其在测定血清甘油三酯中的应用领域。
背景技术：甘油氧化酶(Glycerol Oxidase GO)是二十世纪七十年代后期才被发现的新酶，至今尚未被国际酶学委员会确定其标号。该酶主要存在于微生物体内如曲霉菌属和青霉菌属中，所以可通过菌株发酵制备该酶。由于该酶发现较晚，国外只有关于该酶的实验室研究工作，没有工业化的生产，所以诸如Sigma公司、罗氏公司等大的生化制剂公司均无产品出售，更没有使用该酶配制的检测血清甘油三酯试剂盒在临床推广应用。
发明内容：本发明的目的就是提供一种甘油氧化酶制剂的制备方法及其在测定血清甘油三酯中的应用。
本发明甘油氧化酶制剂的制备方法，是按照以下步骤实现的：
——菌种选育与培养：取日本曲霉AS8586接孢子于土豆斜面培养基上，30℃培养4天；
——亚硝基胍诱变：将培养的AS8586土豆斜面培养基用无菌水冲洗制备孢子悬液，并稀释至10⁷/ml孢子；按重量体积比1∶1的比例，称取亚硝基胍于三角瓶中，接入上述孢子悬液并充分混匀后，摇床震荡100分钟时取出0.5ml菌液，用生理盐水稀释至10²/ml孢子，取0.1ml涂布土豆斜面培养基上30℃温箱培养，长出单菌落时，随即挑取20个菌落划斜面，温箱培养24小时，将菌种斜面用无菌水冲洗制备孢子悬液按体积比1∶100的比例将孢子悬液接入盛有原始发酵液体培养基的三角瓶中，30℃摇床培养48小时；——菌体收集：以布氏漏斗真空抽滤菌体，蒸馏水充分洗涤去除残留的发酵液体培养基至滤液无色透明为止，抽干后的菌体称重；
——液氮研磨：将10²/ml的菌体放入研钵，按菌体1ml加1克石英沙和1ml液氮的比例，加入石英沙和液氮，充分研磨，重复6次，溶于100ml的0.05mol/L硼酸缓冲液中使pH为9.5，充分混匀，于8000rpm离心30分钟，收集上清液；
——硫酸铵分级沉淀：将盛有上清液的烧杯放在另一装有冰水的大烧杯内，磁力搅拌，边搅拌边徐徐加入硫酸铵至40％饱和度，4℃静止1小时后20000g离心20分钟，收集上清液继续加入硫酸铵至80％饱和度，搅拌10分钟，4℃静止1小时后20000g离心20分钟，收集沉淀；
——蛋白脱盐：将分离得到的沉淀物，溶于0.05mol/L的硼酸缓冲液中，装入透析带，在体积比为1∶100的同种缓冲液中透析除盐24小时，其中更换透析液3次；
——凝胶过滤层析：将透析后样品上样于预先经0.05mol/L硼酸缓冲液充分平衡的1×100cm的Sephadex G-200柱进行层析分离，流速为0.2ml/min每管收集20min；洗脱液与平衡液相同，层析时监测A280紫外吸收和酶的活性，确定GO所在的蛋白峰，合并收集液；
——离子交换层析：将上述合并收集的组分上样于DEAE-SephadexA-25柱，进行离子层析分离、收集紫外吸收部分酶活在5u/ml以上组分；
——冷冻干燥：将上述得到的样品放入培养皿，-20℃冷冻过夜，第二天放入冷冻干燥机冻干10小时，即可制得甘油氧化酶制剂成品。
一种甘油氧化酶制剂在测定血清甘油三酯中的应用方法，该应用方法按以下步骤完成；
——试剂配制：
0.1mol/L TES缓冲液配制：准确称取5.72g TES，0.508g MgCl₂溶于蒸馏水中，加水至250ml，使其pH为8；
储存液配制：准确称量48.8mg 4-AA，238.5mg的3，5二氯对羟基苯磺酸钠，溶于上述TES缓冲液100ml；
三酶合剂：准确称取比活力≥526U/mg的Lipase 10mg，比活力≥250U/mg的POD 4mg，比活力≥50U/mg的GO10mg溶于10ml TES缓冲液内冻干；
——测定方法：
贮存液与三酶合剂按体积比14∶1比例配制成工作液，取三个试管各加入3.0ml工作液，分别标注为空白管、标准管、样品管，空白管注入0.05ml蒸馏水，标准管注入0.05ml甘油标准液，样品管注入0.05ml待测样品液，37℃水浴保温20分钟，500nm波长比色，按下列公式计算TG含量；
C_样品＝A_样品/A_标准×C_标准
其中：C_样品＝被测样品浓度          C_标准＝甘油标准液浓度
      A_样品＝被测样品吸光度        A_标准＝甘油标准液吸光度。
测定原理：
血清甘油三酯(TG)在脂肪酶(Lipase)作用下生成甘油(G)和脂肪酸(FFA)：
G在有氧条件下经GO催化生成甘油醛和过氧化氢(H₂O₂)：

H₂O₂在过氧化物酶(POD)催化下可与4-氨基安替比林(4-AA)及色源物质作用，生成醌类化合物：

在Lipase、GO、POD、4-AA及色源适量情况下，TG浓度与呈色反应深浅成正比，因而可通过在500nm波长处分光光度比色对TG进行定量测定。
发明的优点及效果：1、在本发明GO制剂的制备方法中，为了提高菌种GO的产率采用了亚硝基胍诱变，这是制备中的关键步骤，为本发明的独创之处，这一措施大大提高了GO的产率，为GO的制备提供了可靠的保证；由于GO是上世纪七十年代才被发现的新酶，至今尚未被国际酶学委员会确定其酶的标号，更没有工业化产品上市，本发明GO的制备可为GO的理化性质何酶促反应的动力学研究提供必要的条件，因此本发明具有重要的科学价值。2、本发明GO制剂在测定血清甘油三酯中的应用方法与已有的国内外通用的磷酸甘油氧化酶法(GPO法)比较，本法用GO制剂取代了GPO法中的甘油激酶(GK)和磷酸甘油氧化酶(GPO)，本法目前国内外均没有上市使用，具有创新性，其次由于本法是以“1”代“2”，即以一种GO代替GK和GPO两种酶，大大降低了原材料成本，因此具有较强的市场竞争能力，这种新技术在测定血清甘油三酯上推广应用可产生明显的社会效益和经济效益。
具体实施方式：
实施例1
甘油氧化酶制剂的制备，该方法是按照以下步骤实现的：
——菌种选育与培养：取日本曲霉AS8586接孢子于土豆斜面培养基上，30℃培养4天；
——亚硝基胍诱变：将培养的AS8586土豆斜面培养基用无菌水冲洗制备孢子悬液，并稀释至10⁷/ml孢子；按重量体积比1∶1的比例，称取亚硝基胍(本例取10mg)于三角瓶中，接入上述孢子悬液(本例取10ml)并充分混匀后，摇床震荡100分钟时取出0.5ml菌液，用生理盐水稀释至10²/ml孢子，取0.1ml涂布土豆斜面培养基上30℃温箱培养，长出单菌落时，随即挑取20个菌落划斜面，温箱培养24小时，将菌种斜面用无菌水冲洗制备孢子悬液，按体积比1∶100的比例将孢子悬液接入盛有原始发酵液体培养基的三角瓶中(本例取1ml孢子悬液，接入盛有100ml原始发酵液体培养基的三角瓶中)，30℃摇床培养48小时；
——菌体收集：以布氏漏斗真空抽滤菌体，蒸馏水充分洗涤去除残留的发酵液体培养基至滤液无色透明为止，抽干后的菌体称重；
——液氮研磨：将10²/ml的菌体放入研钵，按菌体1ml加1克石英沙和1ml液氮的比例，加入石英沙和液氮，充分研磨，重复6次，溶于100ml的0.05mol/L硼酸缓冲液中使pH为9.5，充分混匀，于8000rpm离心30分钟，收集上清液；
——硫酸铵分级沉淀：将盛有上清液地烧杯放在另一装有冰水的大烧杯内，磁力搅拌，边搅拌边徐徐加入硫酸铵至40％饱和度，4℃静止1小时后20000g离心20分钟，收集上清液继续加入硫酸铵至80％饱和度，搅拌10分钟，4℃静止1小时后20000g离心20分钟，收集沉淀；
——蛋白脱盐：将分离得到的沉淀物，溶于0.05mol/L的硼酸缓冲液中，装入透析带，在体积比为1∶100的同种缓冲液中透析除盐24小时，其中更换透析液3次；
——凝胶过滤层析：将透析后样品上样于预先经0.05mol/L硼酸缓冲液充分平衡的1×100cm的Sephadex G-200柱进行层析分离，流速为0.2ml/min每管收集20min；洗脱液与平衡液相同，层析时监测A280紫外吸收和酶的活性，确定GO所在的蛋白峰，合并收集液；
——离子交换层析：将上述合并收集的组分上样于DEAE-SephadexA-25柱，进行离子层析分离、收集紫外吸收部分酶活在5u/ml以上组分；
——冷冻干燥：将上述得到的样品放入培养皿，-20℃冷冻过夜，第二天放入冷冻干燥机冻干10小时，即可制得甘油氧化酶制剂成品。
GO成品的分析与鉴定：
1、蛋白含量：采用Bradford法测定样品中蛋白含量；
2、酶活力测定：将冻干粉GO定量称取后用4-氨基安替比林-苯酚法测定GO活力为100U/mg。
甘油氧化酶制剂在测定血清甘油三酯中的应用，该应用方法按以下步骤完成；
——试剂配制：
0.1mol/L TES缓冲液配制：准确称取5.72g TES，0.508g MgCl₂溶于蒸馏水中，加水至250ml，使其pH为8；
储存液配制：准确称量48.8mg 4-AA，238.5mg的3，5二氯对羟基苯磺酸钠，溶于上述TES缓冲液100ml；
三酶合剂：准确称取比活力≥526U/mg的Lipase 10mg，比活力≥250U/mg的POD 4mg，比活力≥50U/mg的GO10mg溶于10ml TES缓冲液内冻干；
——测定方法：
贮存液与三酶合剂按体积比14∶1比例配制成工作液，取三个试管各加入3.0ml工作液，分别标注为空白管、标准管、样品管，空白管注入0.05ml蒸馏水，标准管注入0.05ml甘油标准液，样品管注入0.05ml待测样品液，37℃水浴保温20分钟，500nm波长比色，按下列公式计算TG含量：C_样品＝A_样品/A_标准×C_标准
在全自动生化分析仪或半自动生化分析仪上用本试剂加入被测样品——血清进行甘油三酯含量测定。
如：应用本法对100例患者血清TG进行测定，同时用GPO法测定，结果见下表：