酶法分析试剂及其制法 【技术领域】
本发明涉及酶法分析试剂及其制法
背景技术
采用还原型烟酰胺辅酶或其类似物(如：NADH、NADPH、thioNAD或thioNADPH)测定体液样本中的被测物，是一种广泛使用的方法，试剂中还原型烟酰胺辅酶或其类似物的氧化程度，与样本中被测物的浓度成正比。根据样本中不同的被测物，采用相应的酶反应机制经过酶与底物反应，试剂中还原型烟酰胺辅酶或其类似物被氧化，反应系统的吸光度发生变化，通过测定反应系统的吸光度变化值，就可计算出样本中被测物的浓度。
例如血浆样本中氨浓度的测定，血浆中的氨在谷氨酸脱氨酶作用下与a-酮戊二酸反应生成谷氨酸盐，同时NADPH被氧化为NADP+，反应系统在340nm处的吸光度值下降。通过测定340nm处吸光度的下降值，就可以计算出样本中氨的浓度。
再例如血清样本中丙氨酸氨基转移酶浓度的测定，样本中丙氨酸氨基转移酶催化丙氨酸氨基转换至a-氧化戊二酸，生成丙酮酸和L-谷氨酸；生成的丙酮酸被试剂中的乳酸脱氢酶还原为L-乳酸，同时NADH被氧化为NAD，反应系统在340nm处地吸光度值下降。通过测定340nm处吸光度的下降值，就可以计算出样本中丙氨酸氨基转移酶的浓度。
但是由于还原型烟酰胺辅酶或其类似物，特别是NADH和NADPH在这类酶试剂中只能采用干粉试剂或液体双试剂。干粉试剂通过保持试剂的干燥状态，试剂的水分含量一般低于20％，保持NADH或NADPH的稳定；液体双试剂通过调整含有NADH或NADPH试剂部分的PH值，这部分试剂PH值一般在7.5-11.5之间，保持NADH或NADPH的稳定。
还原型烟酰胺辅酶在液体单一试剂的应用中，Joseph De Giorgio等(参见美国专利：5804402和5705356)发明了在测定试剂中加入NADH或NADPH的稳定酶系统，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及其非专一性底物葡萄糖，将试剂保存过程中NADH或NADPH被氧化生成的NAD或NADP再缓慢还原为NADH或NADPH，从而保持测定试剂中有效的还原型烟酰胺辅酶的浓度。在他们的发明中，测定试剂生产或配制时不加入反应产物NAD或NADP，仍然按照传统的试剂生产或配制方法，加入NADH或NADPH，嵌入的再生酶系统仅仅用于NADH或NADPH氧化后的单向再生，并不生成新的NADH或NADPH。此外，这一发明中，Joseph DeGiorgio等也未提出利用反应产物生产测定试剂的方法。
RichardA.Kaufman等(参见美国专利：5589348)利用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及其专一性底物葡萄糖-6-磷酸，在试剂测定过程中原位同时或先于测定样本快速生成还原型辅酶，用于被测物的测定。在他们的发明中，还原型烟酰胺辅酶的生成速率必需大于被被测物酶系统再氧化的速率。被测物的测定是在生成还原型辅酶的同时或以后进行的，试剂中葡萄糖-6-磷酸的摩尔浓度必须低于用于还原型辅酶的氧化型辅酶的摩尔浓度，因此这类测定试剂配制成单一液体试剂后，生成NADH或NADPH与普通测定试剂中一样不稳定。该方法多用于液体双试剂。在他们的发明中，相对于被测物酶系统将还原后的辅酶再氧化的速率，生成还原型辅酶的速率不可能以绝对快的速率完成，因此，测定样本中被测物含量时需要测定书籍浓度的标准样本进行对照计算，从而求出要本中被测物的含量。采用这一方法在实际应用中很难对体液样本中的酶含量进行测定。
【发明内容】
本发明是在测定试剂生产或配制时加入辅酶或其类似物的反应产物，如NAD、NADP、thioNAD或thioNADP，及其慢反应酶和底物，形成慢反应酶-底物-NAD、酶-底物-thioNAD、酶-底物-NADP或酶-底物-thioNADP等系统。测定试剂中有效的NADH、thio-NADH、NADPH或thio-NADPH含量是由该系统生成的，同时该由于不断生成测定所需的还原型辅酶或其类似物，从而大大提高了试剂的稳定性，测定试剂可以配制成液体稳定的单一试剂，并大大降低试剂的生产成本。
本发明是在于应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶(NAD、NADP或其类似物，如thio-NAD、thio-NADP等)配制测定试剂，用于测定体液样本中被测物的酶法测定试剂。其特点是在生产或配制过程中，本发明所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而是加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物(如：NAD、NADP、thio-NAD或thio-NADP等)及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD、酶-底物-(thio-NAD)、酶-底物-NADP或酶-底物-(thio-NADP)等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其类似物，当被还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，本发明所指的酶法试剂就可达到测定被测定物的目的。由于内嵌的酶和底物系统还原氧化型烟酰胺辅酶或其类似物的速率显著低于被测物及其测定酶或底物系统对还原型烟酰胺辅酶或其类似物氧化速率，因此该内嵌的酶和底物系统不影响被测物的测定反应。这类试剂包括丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等。
本发明同时首次提出了一种利用反应产物逆向生成原反应物的测定试剂的生产方法。
本发明同时公开了一种节约和改良的测定试剂配制和生产方法，由于试剂生产配制时不使用NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH或其类似物，从而大大降低了试剂的原料成本。采用这一生产方法配制的试剂包括丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等。
本发明同时公开了一种改良的测定试剂，这类试剂包括丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等。
根据本发明的原理，试剂测定中可以采用的还原型辅酶或其类似物的生成系统很多，包括葡萄糖脱氢酶-葡萄糖-氧化型烟酰胺酶或其类似物系统、乳酸脱氢酶-丙酮酸-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、甘油脱氢酶-甘油-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、以及(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统等。为了有效地降低还原型烟酰胺辅酶或其类似物的生成速率，不影响试剂的测定性能，可以对上述生成系统中的酶和底物及其浓度进行调整，使其生成还原型烟酰胺辅酶或其类似物的速率在测定被测物时不影响还原型烟酰胺辅酶或其类似物的氧化速率。例如，葡萄糖脱氢酶-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统可调整为葡萄糖脱氢酶-木糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、乳酸脱氢酶-丙酮酸-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统可调整为乳酸脱氢酶-a-酮戊二酸-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统，甘油脱氢酶-甘油—氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统可调整为甘油脱氢酶-乙二醇-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、以及(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统可调整为(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统等。考虑到测定样本时样本中可能含有的底物物质影响到还原型烟酰胺辅酶或其类似物的生成速率，进而影响被测物的测定反应上述各系统中优先选用的系统为甘油脱氢酶-乙二醇-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统和(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统，最为优先选用的系统为(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统。以下以(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统为例，进一步阐述本发明试剂的原理和制法。
本发明中的还原型辅酶或其类似物生成系统生成的还原型辅酶在达到一定的浓度后，即可与试剂其它测定成分一起进行被测物的浓度测定，此时还原型辅酶或其类似物生成系统可以已经完全完成了还原型辅酶或其类似物的生成反应，也可以仍在继续生成还原型辅酶或其类似物。这一特点保证了采用本发明可以配制或生产出单一稳定的液体试剂。本发明中的还原型辅酶或其类似物生成系统生成还原型辅酶或其类似物的速率可以是任何不干扰测定反应的速率，可以采用的生成有效还原型烟酰胺辅或其似物的浓度的速率在0.001-365天内之间，生成的还原型辅酶或其类似物的吸光度在0.5-5.0范围之内(340nm或405nm波长，光径10mm)；生成速率小于0.001天，生成系统会影响测定系统的测定性能，生成速率大于365天，测定试剂的配制非常困难。更为合适的生成速率是在1-30天之内，生成的还原型辅酶或其类似物的吸光度为0.8-3.0(波长340nm或405nm或405nm，光径10mm)；优先采用的生成速率是在1-7天内，生成的还原型辅酶的吸光度为1.0-2.8，波长340nm或405nm，光径10mm。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度范围在100-100000U/L之间，更为合适10000U/L之间，优先选用的范围在2000-8000U/L范围之间。葡萄糖浓度的选择范围较大，较为合适的范围在1-500mM之间，优先选用的范围在10-200mM之间。氧化型辅酶或其类似物较为合适的浓度范围在0.05-0.85mM之间。优先选用的范围在0.20-0.50mM之间。
本发明配制的测定试剂，其中的还原型辅酶或其类似物的含量，也可以采用本发明中的还原型辅酶或其类似物生成系统部分生成，其它部分仍然采用传统方法加入，以缩短还原型辅酶或其类似物的生成时间，有利于灵活适应试剂的市场供应。
还原型辅酶或其类似物生成系统可以结合测定试剂，加入缓冲液、防腐剂、重金属络合剂、表面活性剂和酶稳定剂等。常用的缓冲液包括：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、咪唑缓冲液、二乙醇胺缓冲液、磷酸盐缓冲液、Good’s缓冲液，如：3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPOS)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、2-(N-吗啉代)乙基丙磺酸(MES)、哌嗪-N，N-双(2-乙基磺酸)(PIPES)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙基磺酸)(HEPES)、3-[N，N-双(羟乙基)氨]-2-氨羟基丙磺酸(DIPSO)、N-(2-羟乙)乙哌嗪-N-2-羟丙基磺酸(HEPPSO)、哌嗪-N，N-双(2-羟丙基磺酸)(POPSO)、N-三(羟甲基)甲基]-3-氨基-2-羟丙基磺酸(TAPSO)等，其中三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液的应用较为普遍，本发明中优先选用缓冲液为三(羟甲)甲氨基甲烷(Tris)缓冲液，缓冲液的浓度一般选择在10-20mM范围之内，50-100mM范围更加适合。可以优先采用的防腐剂为叠氮钠，采用其他生物防腐则更好。重金属络合剂包括EDTA、EGTA、HEDTA等，本发明中优先选用的重金属络合剂为EDTA。本发明中酶稳定剂采用牛血清白蛋白，甘露糖醇，磷酸盐用于稳定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶并提高其反应活性。必要时，试剂中可以加入表面活性剂如TritonX-100等。
采用本发明配制酶法试剂时，可以配制成单一液体试剂，也可根据需要配制成液体双试剂。由于不使用还原型辅酶或其类似物，试剂配制要求简单，可以不考虑原料的溶解顺序。建议试剂在配制时，先将一般化合物称量完毕并加入配制容器，再加入配制所需的纯水，轻轻搅拌至完全溶解，再加入其它活性成分和酶蛋白，轻轻搅拌至完全溶解，密封后置2-8℃，让还原型辅酶或其类似物生成系统缓慢生成还原型辅酶或其类似物。当还原型辅酶或其类似物的生成量达到一定的浓度时，试剂就可用于测定，配制液体双试剂时，采用的还原型辅酶七其类似物的生成系统，如甘油脱氢酶-乙二醇-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统等，应在同一试剂部分。
具体实施例
实施例1：配制：丙氨酸氨基转移酶试剂、由下述组份按每升的含量组成，
Tris缓冲液100mM，PH7.15，37℃，
L-丙氨酸500mM，
乳酸脱氢酶2.7ku/L，
a-酮戊二酸15mM，
EDTA.Na2.2H2O6mM，
NAD 0.27mM，
D-葡萄糖50mM，
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(明串珠菌属)3700U/L，
磷酸氢二钾5mM
叠氮钠1.5mM
根椐上述配制试剂溶液的方法，以上丙氨酸氨基转移酶试剂配制完成后，置2-8℃ 1-3天，试剂空白吸光度≥1.10，340nm，10mm光径。测定样本时，采用速率法，样本试剂比为1∶12，温度37℃，延迟时间90秒，测定时间180秒，读数次数≥6点。
实施例2：天门冬氨酸氨基转移酶试剂
Tris缓冲液80mM，PH7.65，37℃，
L-天门冬氨酸240mM，
苹果酸脱氢酶600U/L
乳酸脱氢酶1000U/L，
a-酮戊二酸12mM，
EDTA.Na2.2H2O6mM，
NAD 0.28mM，
D-葡萄糖80mM，
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(明串珠菌属)3700U/L，
磷酸氢二钾5mM
叠氮钠1.5mM
根椐上述配制试剂溶液的方法，以上丙氨酸氨基转移酶试剂配制完成后，置2-8℃，1-5天，试剂空白吸光度≥1.20，340nm，10mm光径。测定样本时，采用速率法，样本试剂比为1∶12，温度37℃，延迟时间90秒，测定时间180秒，读数次数≥6点。
举例2：天门冬氨酸氨基转移酶试剂
Tris缓冲液80mM，pH7.65，37℃
L-天门冬氨酸240mM
苹果酸脱氢酶600U/L
乳酸脱氢酶1000U/L
a-酮戊二酸12mM
EDTA.Na2.2H2O 6mM，
NAD 0.28mM，
D-葡萄糖80mM，
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(明串珠菌属)3700U/L
磷酸氢二钾5mM
叠氮钠1.5mM
根据上述配制试剂溶液的方法，以上天门冬氨酸氨基转移酶试剂配制完成后，
置2-8℃1-5天，试剂空白吸光度≥1.20，340nm，10mm光径。测定样本时，采用速率法，样本试剂比为1∶12，温度37℃，延迟时间90秒，测定时间180秒，读数次数≥6点。
举例3：尿素试剂
Tirs缓冲液120mM，pH 7.5，37℃
a-酮戊二酸7.5mM，
牛血清白蛋白5g/L，
二磷酸腺苷钾盐1.3mM，
谷氨酸脱氢酶(微生物来源)550U/L，
脲酶12000U/L，
NAD0.29mM，
D-葡萄糖100mM，
葡萄糖磷酸脱氢酶(明串珠菌属)3700U/L，
磷酸氢二钾5mM，
EDTA.Na2.2H2O 1mM，
叠氮钠4.0mM，
根据上述配制试剂溶液的方法，以上尿素试剂配制完成后，置2-8℃1-7天，试剂空白吸光度≥1.2，340nm，10mm光径。测定样本或校准品时，采用两点法，样本试剂比为1∶100，温度37℃，延迟时间30秒，测定时间120秒，读数在测定时间内选择2个有效点。
举例4：氨试剂
Tris缓冲液100mM，pH8.0，37℃，
a-酮戊二酸7.5mM，
牛血清白蛋白5g/L，
二磷酸腺苷钾盐2.5mM，
谷氨酸脱氨酸(牛肝来源)4500U/L，
NADP 0.32mM，
D-葡萄糖40mM，
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(明串珠菌属)3700U/L，
磷酸二氢钾5mM，
EDTA.Na2.2H2O 1mM，
叠氮钠7.0mM，
根据上述配制试剂溶液的方法，以上氨试剂配制完成后，置2-8℃天，试剂空白吸光度≥1.20，340nm，10mm光径。测定样本或校准品时，采有用两点法，样本试剂比为1∶10，温度37℃，延迟时间0秒，测定时间120秒，读数测定时间内选择2个有效点。
举例5：肌酐液体双试剂
试剂1：
Tris缓冲液100mM，pH8.0，37℃，
a-酮戊二酸7.5mM，
牛血清白蛋白5g/L，
二磷酸腺苷钾盐2mM，
谷氨酸脱氨酶(牛肝来源)3500U/L，
NADP0.40mM，
D-葡萄糖40mM，
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(明串珠菌属)3700U/L，
磷酸二氢钾5mM，
EDTA.Na2.2H2O 1mM，
叠氮钠7.0mM，
根据上述配制试剂溶液的方法，以上肌酐试剂配制完成后，置2-8℃1-7天，试剂空白吸光度≥1.20，340nm，10mm光径。
试剂2：
Tris缓冲液100mM，pH8.0，37℃，
a-酮戊二酸7.5mM，
牛血清白蛋白5g/L，
二磷酸腺苷钾盐2mM，
谷氨酸脱氢酶(牛肝来源)3500U/L，
EDTA.Na2.2H2O 1mM，
肌酐亚氨基脱氢酶1100U/L
甘酐糖醇55mM
叠氮钠7.0mM，
根据上述配制试剂溶液的方法，配置肌酐试剂2，置2-8℃保存，测定样本时，采用两点法，试剂1∶样本∶试剂2的比例为200∶20∶50，温度37℃，试剂1加样本或校准品后在测定温度孵育300秒，加入试剂2开始测定，延迟时间0秒，测定时间120秒，读数在测定时间内选择2个有效点。肌酐试剂优选选用液体双试剂剂型有利于排除样本中氨的干扰。根据本发明的原理，肌酐试剂也可配制成液体单一试剂，此时测定时，样本中氨的干扰被忽略。
举例6：二氧化碳试剂
Tris缓冲液50mM，Ph8.0，37℃，
磷酸烯醇式丙酮酸1.8mM，
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶500U/L，
苹果酸脱氢酶1250U/L
牛血清白蛋白1g/L
硫酸镁10mM，
草氨酸钠2.5mM，
NADH0.1mM
NAD0.45mM
D-葡萄糖100mM，
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(明串珠菌属)7500U/L，
磷酸二氢钾5mM
叠氮钠7.7mM，
根据上述配制试剂溶液的方法，以上二氧化碳试剂配制完成后，置2-8℃密闭静置1-15天，试剂空白吸光度≥1.20，340nm，10mm光径。测定样本或校准品加入试剂后立刻读取第1点吸光度值，300秒时读取第2点吸光度值。 由于环境中二氧化碳广泛存在，建议配置二氧化碳试剂时采用新鲜去离子水煮沸冷却后配制，配制后试剂完全密闭保存。刻例试剂中加入部分NADH是为了有交地排除环境中的二氧化碳扰。
举例7：丙氨酸氨基转移酶试剂
Tris缓冲液100mM，pH7.15，37℃，
L-丙氨酸500mM，
乳酸脱氢酶2.7ku/L，
a-酮戊二酸15mM，
EDTA.Na2.2H2O 6mM，
Thio-NAD0.27mM，
D-葡萄糖50mM，
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(明串珠菌属)3700U/L，
磷酸氢二钾5mM
叠氨钠1.5mM
根据上述配制试剂溶液的方法，以上丙氨酸氨基转移酶试剂配制完成后，置2-8℃1-10天，试剂空白吸光度≥1.10，405nm，10mm光径。测定样本时，采用束率法，样本试剂比为1∶12，温度37℃，延迟时间90秒，测定时间180秒，读数次数≥6点。
上述举例1-举例7试剂的配制方法仅用于说明本发明的原理及其应用，本发明绝不局限于上述举例的应用范围；此外，在本发明相关领域中的专业技术人员，可以根据本发明的原理和方法配制出与之类的各种测定试剂，但并不脱离出本发明的原理应用范围。