纳米磁性颗粒分离纯化链酶亲合素的方法 【技术领域】
本发明涉及一种分离纯化链酶亲合素的方法，具体是一种纳米磁性颗粒分离纯化链酶亲合素的方法。属于生物分离技术领域。
背景技术
生物素-亲合素系统(Biotin-Avidin System简称BAS)是近几年来发展很迅速的一门生物学技术。应用这技术就须要解决生物素和亲合素的原料，生物素又称维生素H为小分子物质，现已能人工合成。亲合素包括卵白亲合合素、链霉亲合素、卵黄亲合素及类亲合素，后两种因其亲和力低，研究不多，前两种是目前主要应用的。经文献检索发现，刘丽等人在《河北医科大学学报》(Vol.2，No.5，P42，2001)发表的“分泌链霉亲合素菌株的筛选及其链霉亲合素性质的研究”，该文中分离纯化方法是先用饱和硫酸铵沉淀、透析后，再用亚胺生物素化的琼脂糖或CM-纤维素进行柱层析分离，得到链霉亲合素纯品。由于受色谱柱层析技术的限制，要求分离用的填料具有松散的多孔网络和颗粒均匀的球形，并具刚性，一方面要便于生物大分子能均匀地进出，另一方面在液体流过色谱柱时所施加的静压下，要保证颗粒不致变形，故载体制作时技术含量高，国内用的柱层析分离填料几乎都是国外产品，价格昂贵，用于规模化生产成本高，且操作复杂要通过盐析、透析、柱层析分离，时间长。
【发明内容】
本发明针对现有技术的上述不足和缺陷，提供一种纳米磁性颗粒分离纯化链酶亲合素地方法，通过应用表面带有亲和配基的磁性颗粒直接从细菌发酵液中分离出链霉亲合素，使其具有操作简单，不需要盐析、透析、柱层析，分离速度快，成本低等特点，可用于少量或大批量的分离纯化。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明以表面带有功能基团的纳米磁性颗粒为载体，借助于磁性分离装置，对目标生物分子进行负载、运载和卸载等分离操作，实现目标生物分子的磁性分离过程，运用生物分子特异性亲合作用原理，将亚胺生物素、生物素或生物胞素配基偶联在磁性颗粒载体表面，在外加磁场的定向控制下，通过亲和吸附、清洗和解吸等操作，从而一步从复杂的原始细菌发酵液中直接分离纯化链霉亲合素。
以下对本发明方法作进一步的限定，方法包括如下步骤：
(1)制备表面带有功能基团(羧基、氨基、醛基、巯基等)的磁性颗粒；
①采用共沉淀法、沉淀氧化法制备超顺磁性纳米Fe3O4，或少量掺入过渡金属Mn、Cu、Zn、Co、Mg等，提高磁颗粒的饱和磁化强度。
②采用有机分子处理纳米Fe3O4粒子使其表面带有功能基团，新制备的纳米Fe3O4表面带有很多羟基，在酸性介质中，可用硅烷偶联剂修饰，如γ-氨丙基三乙氧基硅烷、γ-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷、γ-巯丙基三甲氧基硅烷等，使其表面带有氨基、环氧基、巯基等两种以上的功能基团；也可采用能高分子材料包覆纳米Fe3O4粒子，通过对纳米Fe3O4表面化学改性，使纳米Fe3O4与聚合单体具有良好的相容性和稳定性，在聚合过程中纳米Fe3O4均匀分布于聚合物微球内部，利用分散聚合法、乳液聚合法和悬浮聚合法制备高分子磁性微球，并引入两种以上的功能基团(羧基、氨基、醛基、巯基等)。
(2)以磁性颗粒为载体偶联与链霉亲合素有亲和作用的亚胺生物素、生物素或生物胞素配基；
①亚胺生物素化的磁性颗粒的制备：表面带有醛基、巯基、羟基的磁颗粒在弱碱性溶液中与肼化亚胺生物素反应生成亚胺生物素化的磁性颗粒；表面带有氨基的磁颗粒同样在弱碱性溶液中与亚胺生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯反应生成亚胺生物素化的磁性颗粒。反应方程式如下：
②生物素化的磁性颗粒的制备：采用表面带有醛基、巯基、羟基的磁颗粒在弱碱性溶液中与生物素肼反应生成生物素化的磁性颗粒；表面带有氨基的磁颗粒同样在弱碱性溶液中与生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯反应生成生物素化的磁性颗粒。
③生物胞素化的磁性颗粒的制备：采用表面带有羧基的磁颗粒在N，N-二甲基甲酰胺溶液中，加入碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，摇动反应过夜，在磁场下分离，再与生物胞素反应生成生物胞素化的磁性颗粒。
(3)用亚胺生物素化的磁性颗粒、生物素化的磁性颗粒或生物胞素化的磁性颗粒通过亲和反应直接从细菌发酵液中分离纯化链霉亲合素。
①用亚胺生物素化的磁性颗粒分离时：首先发酵液过滤，滤液用NaON调至PH9.5～11，加入亚胺生物素化的磁性颗粒，摇动反应0.5小时，在外加磁场作用下除去上清夜，用PH10～11的碳酸缓冲液洗磁性颗粒3-4次后，除去上清液，磁性颗粒用PH4.0缓冲液洗下链霉亲合素，用重蒸水4℃透析，得纯化的链霉亲合素。
②当用生物素化的磁性颗粒或生物胞素化的磁性颗粒分离时：首先发酵液过滤，滤液中加入生物素化(或生物胞素化)的磁性颗粒，摇动反应0.5小时在外加磁场作用下除去上清液，用1M NaCl洗磁性颗粒3-4次后，除去上清夜，磁性颗粒用PH2.5 HCl-甘氨酸缓冲液，或5M尿素，或6M盐酸胍洗下链霉亲合素，用0.05M磷酸缓冲液PH7.0 4℃透析，再用重蒸水4℃透析，得纯化的链霉亲合素(SA)。
本发明以纳米磁性颗粒为核，表面通过有机小分子或高分子包覆修饰使其带有功能基团(羧基、氨基、醛基、巯基等)，这些功能基团可偶联生物素衍生物，制得亚胺生物素化、生物素化或生物胞素化的磁性颗粒，用于分离纯化亲合素。它是利用磁性颗粒在纳米尺度上表现出来的新颖的物理、化学特性，即纳米磁性粒子的超顺磁性，以及粒子小、表面积大、吸附容量大的特点，在纯化洗脱过程中它们可以完全悬浮，不会发生阻塞现象，外加磁场能快速分离；同时利用生物分子特异的亲和作用原理，通过链霉亲合素与偶联亚胺生物素、生物素或生物胞素配基的磁性颗粒亲和吸附、清洗和解吸等操作，可以一步从复杂的原始细菌发酵液中直接分离纯化链霉亲合素，分离简单、快速、高效。纯化得到的链霉亲合素纯度大于98％，活性15.56ug/mg，分子量为58000Da。
【具体实施方式】
结合本发明的内容提供以下实施例，对本发明技术方案作进一步理解。
实施例一
称取FeSO4·7H2O(分析纯)4.12克，FeCl3·6H2O(分析纯)8.03克，加双蒸水150mL，在氮气的保护下溶解，并加入300mL 5M NaOH(分析纯)溶液，剧烈搅拌，80℃反应60分钟，制备了磁性纳米Fe3O4，在外加磁场下，用去离子水洗涤至中性，再用甲醇洗，在甲醇溶液中(用醋酸调PH＝3)，加入3.5克硅烷化试剂γ-氨丙基三乙氧基硅烷(Si(OC2H5)3C3H7NH2)，60℃水浴中反应4小时，冷却，用去离子水洗涤，得到的磁性粒子表面带有氨基。透射电镜检测颗粒的大小，粒子20nm；红外检测表面硅烷化修饰后的颗粒，得氨基(-NH2)的特征吸收在3300cm-1，N-H弯曲振动在1600cm-1，表明磁颗粒表面带有氨基；用电感耦合等离子体发射光谱仪测元素铁和硅的含量(重量百分比)得：Fe：68.83；Si：1.316，计算得每克磁性颗粒所带氨基量0.47mmol。
将制备的表面带有氨基的磁性粒子30mg，用蒸馏水洗后，加入3mL 0.05M不含氨基的缓冲液(PH4.8～9.5)，以及1.2mL 25％的戊二醛，室温摇动反应3小时，洗涤后，得到表面带有醛基的磁颗粒，加入3mL 0.05M NaHCO3和0.5mL10mg/mL溶于二甲亚砜的亚胺生物素肼室温摇动反应过夜，用0.05M NaHCO3洗涤，得到亚胺生物素化的磁性颗粒。或者将制备的表面带有氨基的磁性粒子30mg，用0.05M NaHCO3洗后，加入3mL 0.05M NaHCO3溶液，以及6mg亚胺生物素-N-羟基丁二酰亚胺酯溶于0.5mL二甲基甲酰胺的溶液，室温摇动3小时，用0.05M NaHCO3洗涤，得到亚胺生物素化的磁性颗粒。
取链霉菌的发酵液200mL过滤后，用6N的NaOH调滤液PH至9.5～11，加入制备的亚胺生物素化的磁性颗粒30mg，室温摇动反应15分钟，外加磁场分离，用0.05M碳酸缓冲液(PH10～11)含1M NaCl洗涤磁颗粒，测上清液OD282值，当上清液OD282≤0.005时，换用0.05M的醋酸缓冲液PH＝4洗脱，外加磁场分离，测上清液OD282值，计算(链霉亲合素吸光值ε＝3.356ml/mg)得精制的链霉亲合素为4.16mg。
实施例二
称取FeSO4·7H2O(分析纯)4.12克，FeCl3·6H2O(分析纯)8.03克，加双蒸水150mL，在氮气的保护下溶解，并加入300mL 5M NaOH(分析纯)溶液，剧烈搅拌，80℃反应60分钟，制备了磁性纳米Fe3O4，在外加磁场下，用去离子水洗涤至中性，再用甲醇洗，在甲醇溶液中(用醋酸调PH＝3)，加入3.5克硅烷化试剂γ-氨丙基三乙氧基硅烷(Si(OC2H5)3C3H7NH2)，60℃水浴中反应4小时，冷却，用去离子水洗涤，得到的磁性粒子表面带有氨基。透射电镜检测颗粒的大小，粒子在20nm；红外检测表面硅烷化修饰后的颗粒，得氨基(-NH2)的特征吸收在3300cm-1，N-H弯曲振动在1600cm-1，表明磁颗粒表面带有氨基；用电感耦合等离子体发射光谱仪测元素铁和硅的含量(重量百分比)得：Fe：68.83；Si：1.316，计算得每克磁性颗粒所带氨基量0.47mmol。
将制备的表面带有氨基的磁性粒子30mg，悬于3mL N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.5mL 10mg/mL溶于N，N-二甲基甲酰胺的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)，室温摇动反应过夜，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤后，再用蒸馏水洗涤，得到生物素化的磁性颗粒。
取链霉菌的发酵液200mL过滤后，滤液中加入制备的生物素化的磁性颗粒30mg，室温摇动反应15分钟，外加磁场分离，用1M NaCl洗涤磁颗粒，测上清液OD282值，当上清液OD282≤0.005时，换用PH2.5 HCl-甘氨酸缓冲液(或5M尿素，或6M盐酸胍)洗下链霉亲合素，用0.05M磷酸缓冲液PH7.0 4℃透析，再用重蒸水4℃透析，测OD282值，计算(链霉亲合素吸光值ε＝3.356ml/mg)得精制的链霉亲合素为3.14mg。
实施例三
在500mL的烧杯中加入油酸包覆的磁流体15.0g，32mL苯乙烯和0.84mL二乙烯基苯的混合液，以及5％十二烷基硫酸钠的水溶液240mL，搅拌1小时后，再加入0.6g偶氮二氰基戊酸，然后以4000r/min的速度高速分散30mmin，将混合液转移到带有搅拌器、冷凝管和氮气入口的四口瓶。在氮气保护下，80℃搅拌反应12小时，乳液呈棕色，用磁场分离洗净，收集到磨口瓶中。透射电镜检测颗粒的大小，粒子在300nm；用红外检测微球表面带有羧基功能团，羧基中(-C＝O)的特征吸收在1720cm-1，(-C-O)伸缩振动的特征吸收在1315cm-1，(-O-H)的非平面变角振动在915cm-1。用电导滴定法，测定磁性微球表面的羧基含量为0.2mmol/g。
将制备的表面带有基羧的磁性微球400mg悬于10mLN，N-二甲基甲酰胺，加入50mg N-羟基丁二酰亚胺(HO-SU)和60mg二环己基碳二亚胺(DCC)，室温摇动反应过夜，用乙醚洗3次后，改用二甲基甲酰胺洗涤，加入10mL3mg/mL溶于N，N-二甲基甲酰胺的生物胞素，室温摇动反应过夜，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤后，再用蒸馏水洗涤，得到生物胞素化的磁性微球。
取链霉菌的发酵液200mL过滤后，滤液中加入生物胞素化的磁性颗粒300mg，室温摇动反应15分钟，外加磁场分离，用1MNaCl洗涤磁颗粒，测上清液OD282值，当上清液OD282≤0.005时，换用PH2.5 HCl-甘氨酸缓冲液(或5M尿素，或6M盐酸胍)洗下链霉亲合素，用0.05M磷酸缓冲液PH7.0 4℃透析，再用重蒸水4℃透析，测OD282值，计算(链霉亲合素吸光值ε＝3.356ml/mg)得精制的链霉亲合素为3.80mg。
链霉亲合素活性测定：取实施例一、实施例二、实施例三纯化得到的链霉亲合素1.16mg(282nm定量)，在233nm测OD值，加入10uL生物素(1mg/ml)233nm测OD233值，再加入2uL生物素测OD233值，当OD233值不再增加时，加入生物素的量就是链霉亲合素的活性，共加入生物素的量为18mg，纯化得到链霉亲合素的活性为15.52ug/mg。
链霉亲合素分子量和纯度的测定：实施例一、实施例二、实施例三纯化得到的链霉亲合素用常规SDS-PAGE电泳法(5％浓缩胶和12％分离胶)，分别上样，同时上样低分子量的标准蛋白(Sigma公司)，用Bio-Rad MP3型电泳槽走电泳后，凝胶用0.25％考马斯亮蓝R250染色15min，脱色至清晰，纯化得到的链霉亲合素都只有一条带，纯度大于98％，将低分子量标准蛋白的相对分子量取对数，与他们在SDS-PAGE中的迁移距离做线性回归得亚基的分子量为14500Da，因链霉亲合素由4个亚基组成，所以链霉亲合素的分子量为58000Da。