一种快速检测水稻温敏不育系的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103026821 A (43)申请公布日 2013.04.10 CN 103026821 A *CN103026821A* (21)申请号 201110292922.0 (22)申请日 2011.09.30 A01C 1/00(2006.01) (71)申请人 中国科学院遗传与发育生物学研究 所 地址 100101 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 2 号遗传与发育生物学研究所 申请人 湖南亚华种业科学研究院 (72)发明人 曹晓风 杨远柱 周明 胡小淳 (54) 发明名称 一种快速检测水稻温敏不育系的方法 (57) 摘要 本发明的目的是提供一种快速检测水稻温敏 不育。

2、系的方法。首先对要检测的株系和野生型提 取基因组 DNA ； 利用引物进行 PCR 反应 ； 对 PCR 产 物进行电泳 ； 电泳结果中比野生型产物电泳速度 快的为携带不育基因的温敏不育系。此结果还可 以进一步利用测序反应准确检测。该方法大大减 少了育种的时间和工作量， 对于加快我国杂交水 稻的新品种的选育、 提高水稻产量、 解决我国粮食 问题具有重要的意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1.。

3、 一种快速便捷检测水稻温敏不育系的方法， 包括以下步骤 ： 对要检测的株系和野生型提取基因组 DNA ； 利用引物进行 PCR 反应 ； 对 PCR 产物进行电泳 ； 电泳结果中比野生型产物电泳速度快的为携带不育基因的温敏不育系 ； 步骤 2） 所述的引物， 其特征在于， 引物序列由 A 或 B 所示的序列之一组成 ： A、 RMZ-11F ： CCTCTGTATCCACGAAGGAT 和 RMZ-11R: CACTCGGAGGTCTACAATCT ； B、 RMZ-13F: GTAATGTCGTAAGGAAATGCCC 和 RMZ-13R: GCGATGACTTGCCGCTGT。 2. 一种。

4、快速准确检测水稻温敏不育系的方法， 包括以下步骤 ： 对要检测的待检测材料提取基因组 DNA ； 进行测序反应 ； 测序序列与野生型以及株 1S 序列比较， 与株 1S 相同的为携带不育基因的不育系 ； 步骤 3） 所述的测序序列与野生型不同的为携带不育基因的不育系， 其特征在于， 所述 不同包含以下特征之一 ： A、 与野生型相比， 待测株系第 +70 的核苷酸由 G 变成 A ； B、 与野生型相比， 待测株系第 -1640 位的核苷酸从 C 到 T ； C、 与野生型相比， 待测株系第 -1132 位的核苷酸从 T 到 A ； D、 与野生型相比， 待测株系第 -1222 位缺失 AGA。

5、 ； E、 与野生型相比， 第 -791 位的核苷酸 A 到 C ； F、 与野生型相比， 待测株系第 -468 位的核苷酸 T 到 C ； G、 与野生型相比， 待测株系第 -122 位的核苷酸从 A 到 C ； H、 与野生型相比， 待测株系第 +69 位的核苷酸从 G 到 T ； I、 与野生型相比， 待测株系或第 +70 位的核苷酸 C 到 A ； J、 与野生型相比， 待测株系第 -121 位的核苷酸缺失 T ； K、 与野生型相比， 待测株系第 +1128 位的核苷酸从 G 到 A ； L、 与野生型相比， 待测株系或第 +1199 位的核苷酸从 A 到 T。 权 利 要 求 书 。

6、CN 103026821 A 2 1/5 页 3 一种快速检测水稻温敏不育系的方法 技术领域 0001 本发明涉及植物品种的检测方法， 具体涉及快速检测水稻温敏不育系株 1S 及其 他温敏不育系的方法。 背景技术 0002 随着世界人口的不断增长以及工业的发展， 人们对粮食的需求量日益增加， 水稻 作为主要的粮食作物之一， 普遍受到人们的欢迎。据报道， 世界上近一半人口， 包括几乎整 个东亚和东南亚的人口， 都以稻米为食。同样， 水稻作为我国主要粮食作物之一， 是我国人 民最受欢迎的日常食物。随着人口的增长和耕地面积的减少， 提高水稻产量成为解决我国 粮食问题的重要途径。 0003 现代生物技。

7、术是培育高产水稻的重要手段之一， 中国的杂交水稻为粮食增产作出 了重要贡献。 目前， 中国杂交水稻年种植面积占水稻种植总面积的， 产量约占水稻总 产的， 中国亚种间杂交稻一般比品种间杂交稻具有以上的增产潜力。利用水 稻亚种间杂交优势是现阶段战略重点， 二系法杂交水稻是突破亚种间水稻杂交困难的重要 方法。 0004 水稻光、 温敏两系不育资源的发现和在杂交水稻上的广泛应用， 为利用两系法选 育超级杂交水稻打开了新的局面。由于光温敏两系不育系受隐性核基因控制， 与三系不育 系相比， 两系不育系具有自我繁殖， 配组范围广， 基因资源丰富等特点。 因此， 利用两系不育 系选育超级杂交稻成为我国杂交水稻。

8、育种的主攻方向和发展趋势。 0005 根据光周期和温度对育性的影响， 两系不育系分为光敏型、 温敏型和光温敏互作 型等三个主要类型。农垦 58S 及其衍生的粳稻不育系属于典型的光敏型核不育系， 在长日 照条件下表现为不育， 短日照条件下又可以恢复育性。而安农 S-1、 Y58S、 株 1S 等则属于典 型的温敏性不育系， 即在高温不育， 低温可育。另外， 还有一些不育系既受光照影响同时也 受到温度的调控， 这类不育系称为光温互作型， 如培矮 64S 等。 0006 株 1S 和陆 18S 是在生产实践中广泛应用的两系不育系， 属于典型的温敏型不育 系。 株1S和陆18S是从遗传距离较远的不同生。

9、态型水稻杂交组合F2群体中发现的不育株， 经 “自然环境和人工环境双重压力选择法” 选育的新低不育起点温度核不育系。由于淘汰 了低世代变异群体中不育起点温度高和短期低温引起的育性波动不育类型， 株 1S 和陆 18S 不育起点温度低， 不育性稳定。其中， 株 1S 的育性转育温度在 22.6左右， 陆 18S 在 23 左右 ； 并且对连续 6 天日平均 23的低温不敏感， 是国内不育起点温度低， 不育性稳定的优 良两系不育系。在实际生产中， 株 1S 和陆 18S 生殖生长期耐低温能力强， 大面积制种安全 可靠， 繁殖产量高， 解决了低不育起点温敏不育系的繁殖难题。株 1S 和陆 18S 综。

10、合农艺性 状好， 抗性强， 米质较优， 分别于 1999、 2000 年通过湖南省品种鉴定。目前， 株 1S 已成为培 育两系不育系的重要不育基因资源， 利用株1S已转育成湘陵628S、 潭农S等6个新不育系。 株 1S 和陆 18S 配合力强， 亲和谱广， 已育成 48 个组合通过审定， 其中国审早稻组合 10 个， 省审早稻组合 34 个， 分别占同期长江流域国审和省审两系早稻组合的 62.5% 和 44.2%。株 说 明 书 CN 103026821 A 3 2/5 页 4 1S 和陆 18S 所配组合亚种间优势明显， 其中株两优 819 比对照增产 10%， 被农业部认定为首 个早熟超。

11、级杂交早稻， 并作为南方稻区区试对照和农业主导品种。陆两优 819 比对照增产 8.08%， 也被农业部认定为超级杂交早稻。截止到 2010 年， 株 1S 及陆 18S 所配品种在我国 的累计种植面积超过 9100 万亩。株 1S 是培育两系超级水稻的重要不育资源， 但是由于株 1S 株系缺少分子检测标记， 在利用株 1S 培育其他不育系时， 只能通过不育基因纯合后代的 表型来鉴定， 需要到 F2代才能通过表型观察判定。通常而言， 在某一品种与株 1S 杂交获得 具有温敏特点的新不育系时， 需要将纯合的杂交后代不育系与目标品种回交 5 代， 以得到 具有该品种特性的新不育系， 在常规育种条件。

12、下， 由于每一次回交都需要在 F2代才能确定 不育系的表型， 大大增加了育种的时间和工作量。 0007 本发明提供一种利用分子标记检测株 1S 或温敏不育系中控制温敏不育基因的方 法， 该方法在杂交 F1代即可检测到携带温敏不育基因的株系， 利用该株系与目标品种继续 回交， 直到回交目标代数， 自交即获得具有温敏不育基因的新不育系， 大大减少了育种的时 间和工作量， 对于加快我国杂交水稻的新品种的选育、 提高水稻产量、 解决我国粮食问题具 有重要的意义。 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种快速检测水稻温敏不育系的方法。 0009 本发明所述的温敏不育性是指株 1S 或不育基因来源于株 。

13、1S 的不育系， 包括但不 限于株 1S、 以及由株 1S 培育的不育系。 0010 本发明所述的快速检测水稻温敏不育系的方法， 包括以下步骤 ： 1） 对要检测的不育系和野生型材料提取基因组 DNA ； 2） 利用引物进行 PCR 反应 ； 3） 对 PCR 产物进行电泳 ； 4） 电泳结果中比野生型材料 PCR 产物电泳条带， 电泳速度快的为携带不育基因的不育 系。 0011 步骤 2） 所述的引物， 其特征在于， 引物序列由 A 或 B 所示的序列之一组成 ： A、 RMZ-11F:CCTCTGTATCCACGAAGGAT 和 RMZ-11R: CACTCGGAGGTCTACAATCT 。

14、； B、 RMZ-13F: GTAATGTCGTAAGGAAATGCCC 和 RMZ-13R: GCGATGACTTGCCGCTGT ； 本发明还提供准确检测水稻温敏不育系的方法， 包括以下步骤 ： 1） 对要检测的不育系和野生型材料提取基因组 DNA ； 2） PCR 进行测序反应 ； 3） 比较不育系与野生型材料测序序列的差异， 区分是否为温敏不育系 ； 步骤 3） 所述的温敏型不育系测序序列与野生型的差异为携带不育基因的不育系， 其特 征在于， 所述不同包含以下特征之一 （以 LOC_Os02g12290 基因的起始密码子 “ATG” 的 “A” 为 0 位置，“A” 前面的序列为 “-。

15、” ， ATG 以后的序列为 “+” ， 并其与 “A” 的碱基数代表其位置。 ） ： A、 与野生型相比， 待测株系第 +70 的核苷酸由 C 变成 A ； B、 与野生型相比， 待测株系第 -1640 位的核苷酸从 C 到 T ； 说 明 书 CN 103026821 A 4 3/5 页 5 C、 与野生型相比， 待测株系第 -1132 位的核苷酸从 T 到 A ； D、 与野生型相比， 待测株系第 -1125 位缺失 AGA ； E、 与野生型相比， 第 -791 位的核苷酸 A 到 C ； F、 待测株系第 -468 位的核苷酸 T 到 C ； G、 野生型相比， 待测株系第 -122。

16、 位的核苷酸从 A 到 C ； H、 与野生型相比， 待测株系第 +69 位的核苷酸从 G 到 T ； I、 与野生型相比， 待测株系或第 +70 位的核苷酸 A 到 C ； J、 与野生型相比， 待测株系第 -121 位的核苷酸缺失 T ； K、 待测株系第 +1128 位的核苷酸从 G 到 A ； L、 与野生型相比， 待测株系或第 +1199 位的核苷酸从 A 到 T。 0012 附图说明 0013 图 1 为 RMZ-11F 和 RMZ-11R 为引物 PCR 电泳图， 1 ： 杂合株系， 2 ： 93-11， 3 ： 株 1S， 4 ： 陆 18S ； 。 0014 图 2 为 RM。

17、Z-13F 和 RMZ-13R 为引物 PCR 电泳图， 1 ： 杂合株系， 2 ： 株 1S， 3 ： 93-11， 4 ： 陆 18S。 0015 图 3 为以 CX7958 测序的峰图。 具体实施方式 0016 实施例 1、 株 1S 温敏不育基因的图位克隆 首先， 我们将株 1S 与 93-11 进行杂交， 获得 F1种子。F1 种植以后自交， 得到 F2群体。 在 7500 株 F2群体中， 我们一共鉴定出 1872 株不育单株。通过 SSR 引物进行连锁分析， 我们将控制株 1S 育性的基因初步定位在标记 RM7575 与 RM5897 之间。进一步加密标记， 最 终将控制株 1S。

18、 育性的基因定位在标记 RMZ-17 与 RMZ-11 之间。对表及之间的基因片段进 行测序， 结果发现 LOC_Os02g12290 的编码区出现了一个单碱基突变， 该突变造成了一个终 止密码子， 使翻译提前终止。这证明 LOC_Os02g12290 为造成株 1S 温敏不育系的主要候选 基因。 0017 实施例 2、 LOC_Os02g12290 基因组片段回复株 1S 的育性 我们利用酶切的方法从 BAC 上克隆了包含 LOC_Os02g12290 的基因组 DNA 片段， 并将其 构建进 pCAMBIA2300 的双元表达载体。通过农杆菌介导的方法， 我们将 LOC_Os02g1229。

19、0 的 基因组片段导入株 1S 的基因组中。在高温条件下， 株 1S 完全不育， 没有花粉产生 ； 而转基 因互补植株能够恢复株 1S 的育性， 并且能够很好地结实。这证明 LOC_Os02g12290 是控制 株 1S 温敏不育的育性基因。 0018 实施例 3、 利用 PCR 反应检测不育系 我们对 LOC_Os02g12290 附近的 DNA 进行了基因组测序， 并鉴定出新的标记 RMZ-11 和 RMZ-13。标记 RMZ-11 距离 LOC_Os02g12290 约 3.34kb， 是一个 75bp 的缺失。在 93-11 基因 说 明 书 CN 103026821 A 5 4/5 。

20、页 6 组中含有这一片段， 株 1S， 陆 18S 中均不含有该片段。我们根据 RMZ-11 和 RMZ-13 位置设计 引物进行 PCR 反应检测不育系。 0019 首先按照以下方法对待检测的株系和野生型水稻提取 DNA ： 1， 将适量植物材料在研钵中研磨， 加入 1ml CTAB 溶液， 转入 1.5ml EP 管中， 65温育 30-60 分钟， 并不时颠倒地混匀。 0020 2， 12000rpm 离心 5-10 分钟， 取上清， 加入等体积氯仿 : 异戊醇 （24:1） 混合液， 颠 倒混匀， 10000rpm 离心 5 分钟， 取上清移至新 EP 管中。 0021 3， 上清中加。

21、入700 uL异丙醇， -20沉淀1小时， 12000rpm离心5分钟， 沉淀用75% 乙醇洗涤， 干燥后， 溶于 100 uL 水中， 待用。 0022 试 剂 配 置 ： 2CTAB 溶 液 ： 2%CTAB， 0.1%PVP40， 20mM EDTA (pH 8.0)， 100mM Tris-HCl (pH 8.0)， 1.4M NaCl。 0023 RMZ-11F: CCTCTGTATCCACGAAGGAT 和 RMZ-11R: CACTCGGAGGTCTACAATCT 为引物， 以提取的基因组 DNA 为模板， 进行 PCR 反应， PCR 反应体系如下 ： 10PCR buffer。

22、 2.0 uL 2.5mM each dNTP 1.0 uL RMZ-11F （10 uM） 0.5 uL RMZ-11R（10 uM） 0.5 uL DNA 模板 1.0uL rTaq 0.2 uL 用 H2O 补充到 20 uL PCR反应条件 ： 95 for 2min; (95 for 20s, 58 for 30s, 72 for 20s)32 个循环 ; 72 for 10min; keep at 4。 0024 PCR 产物用 1.5% 琼脂糖进行电泳， 150V 电泳 20 分钟， 不育性的产物比野生型的产 物电泳速度快， 如附图 1 所示。 0025 标记 RMZ-13 距离。

23、 LOC_Os02g12290 编码区起始密码子仅 6bp， 较野生型多出 6bp。 0026 以 RMZ-13F: GTAATGTCGTAAGGAAATGCCC 和 RMZ-13R: GCGATGACTTGCCGCTGT 为引物， PCR 反应体系如下 ： 10PCR buffer 2.0 uL 2.5mM each dNTP 1.0 uL RMZ-13F （10 uM） 0.5 uL RMZ-13R （10 uM） 0.5 uL DNA 模板 1.0uL rTaq 0.2 uL 用 H2O 补充到 20 uL PCR反应条件 ： 95 for 2min; (95 for 20s, 60 f。

24、or 20s, 72 for 20s)32 个循环 ; 72 for 10min; keep at 4。 0027 PCR 产物电泳速度慢的为不育系。用 10%PAGE 胶进行电泳， 400V 电泳 180 分钟， 如 说 明 书 CN 103026821 A 6 5/5 页 7 附图 2 所示。 0028 实施例 4、 利用测序反应检测不育系 通过对 LOC_Os02g12290 基因组片段进行直接测序， 我们鉴定出 9 个 SNP， 即 SNP-Z1 SNP-Z9。另外， 还检测到两个 InDel， 即 InDel-Z1 和 InDel-Z2。以下通过测序获得的覆盖 LOC_Os02g12。

25、290 的株 1S 基因组序列， 共约 3.6 kb。在携带不育基因的株系中上述 SNP 和 InDel 的序列与野生型不同， 所以可以用测序的方法检测上述 SNP 和 InDel， 从待检测材料 中检测出不育株系。 0029 利用实施例 3 所述的提取基因组的方法提取待检测株系和野生型株系的基因 组 DNA， 利用实施例 3 所述的 PCR 体系以 cx8867: CCGAGTAGACATTGACTTGG 和 cx7958: GTCTTGAAGGCCTTCACCTT为引物， 进行PCR反应， PCR产物经琼脂糖回收后， 提交测序， 测序引 物是 cx7958。经测序后 +70 位置的核苷酸从。

26、 C 变成 A， 由于 cx7958 是反向测序引物， 即为 附图 3 箭头所示的从 G 变成 T。由于该位点的突变直接导致了株 1S 的温敏不育， 所以直接 对该位点直接测序是检测株 1S 温敏不育基因最直接、 最准确的方法。同时， 我们对国内主 要的温敏不育系进行了 DNA 直接测序， 结果发现生产应用主要温敏不育系均是该位点发生 了有 C 到 A 的突变。由此我们证明该方法不仅适用于株 1S 和由株 1S 不育基因培育的不育 系， 还包括其他生产上应用的主要温敏不育系， 如 C815S， Y58S， 广占 63S 以及有它们为不育 基因供体培育不育系， 如图 4 所示。 0030 其他 。

27、SNP 和 InDel 的检测方法如下 ： 以 cx7953: CTCAGCAACAGACAGAGGAGT; cx7954: AAATTTCGGACCCTCACCGG 为引物， 进行 PCR 反应， PCR 产物经琼脂糖回收后， 提交测序， 测序引物是 cx7953。与野生型相比， 待测 株系第 -1640 位的核苷酸从 C 到 T， 即为附图 4 箭头， 或第 -1132 位的核苷酸从 T 到 A， 或 第 -1222 位缺失 AGA ； 以 cx7955: GGTTGCTCGATCTGAAGCAT; cx7956: TTGAGAAGGGCTTCTCCTCG 为引物， 进行 PCR 反应， 。

28、PCR 产物经琼脂糖回收后， 提交测序， 测序引物是 cx7955。与野生型相比， 第 -791 位的核苷酸 A 到 C， 第 -468 位的核苷酸 T 到 C。 0031 以 cx7957: TGCCGATGCAACCTCTTGC; cx7958: GTCTTGAAGGCCTTCACCTT 为引物， 进 行 PCR 反应， PCR 产物经琼脂糖回收后， 提交测序， 测序引物是 cx7957。与野生型相比， 待测 株系第 -122 位的核苷酸从 A 到 C， 或第 +69 位的核苷酸从 G 到 T， 或第 +70 位的核苷酸 C 到 A， 第 -121 位的核苷酸缺失 T。 0032 以 cx。

29、7961: CTTCAAGCACGGATATCAG; cx7962: CTCTACTTCTGAAAGAGGGT 为引 物， 进行 PCR 反应， PCR 产物经琼脂糖回收后， 提交测序， 测序引物是 cx7961。与野生 型相比， 待测株系第 +1128 位的核苷酸从 G 到 A， 或第 +1199 位的核苷酸从 A 到 T。 说 明 书 CN 103026821 A 7 1/5 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103026821 A 8 2/5 页 9 0003 序 列 表 CN 103026821 A 9 3/5 页 10 0004 序 列 表 CN 103026821 A 10 4/5 页 11 0005 序 列 表 CN 103026821 A 11 5/5 页 12 序 列 表 CN 103026821 A 12 1/1 页 13 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103026821 A 13 。