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1、(10)申请公布号 CN 102757510 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102757510 A *CN102757510A* (21)申请号 201210132340.0 (22)申请日 2012.04.28 C08B 37/00(2006.01) A23L 1/09(2006.01) A61K 31/715(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 江苏大学 地址 212013 江苏省镇江市京口区学府路 301 号 (72)发明人 仰榴青 赵婷 吴向阳 邹烨 茆广华 李芳 任月娜 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 。
2、32200 代理人 楼高潮 (54) 发明名称 低分子量五味子多糖及其制备方法和用途 (57) 摘要 本发明公开了低分子量五味子多糖及其 制备方法和用途， 属于医药技术领域。该多糖 组分的分子量为 3.4103Da ； 单糖组成为甘露 糖葡萄糖半乳糖 =1 11.38 3.55 ； 具有 (1 3)-glucan （葡聚糖） 和三螺旋结构。本 发明的 SCPP11 多糖组分的体内抗肝癌活性表明， 其具有显著地抗肝癌 （HepG-2） 活性， 可显著抑制 肝癌的生长， 并与 5-Fu 相比， 该多糖组分毒性低， 可显著增强小鼠自身免疫能力和体内抗氧化活 性。本发明水溶性低分子量五味子多糖活性成分。
3、 明确， 质量可控， 可用作抗肝癌药物或提高机体免 疫功能的保健品。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种低分子量五味子多糖， 其特征在于该多糖分子量为 3.4103 Da ； 单糖组成为 ： 甘露糖 (man) : 葡萄糖 (glu) : 半乳糖 (gal) = 1 : 11.38 : 3.55 ； 该多糖具有 - 糖 苷键和 - 糖苷键 ； 该多糖具有 (1 3) - 葡聚糖 （glucan） ； 该多糖具有三股螺。
4、旋 结构。 2. 权利要求 1 所述的一种低分子量五味子多糖的制备方法， 其特征在于按照下述步骤 进行 ： (1) 五味子粗多糖的提取方法 ： 将原料水洗， 60烘干， 粉碎， 并置索氏提取器中， 馏程60-90石油醚脱脂15 h， 过滤， 滤渣 60 烘干， 备用 ； 脱脂五味子粉末以料液比1:8-1:12， 在温度80-100水中提取3-5h， 提取1-3次， 合并 上清液， 上清液经浓缩后， 加入乙醇醇沉， 使得多糖的浓缩液中乙醇浓度为 80%， 所得沉淀离 心、 经冷冻干燥 24-48h 后得五味子粗多糖 ； 取五味子粗多糖适量， 复溶后使用三氯乙酸法 除蛋白， 降蛋白后的糖液透析冻干。
5、， 得到脱蛋白五味子多糖 ； (2) 低分子量五味子多糖的制备 ： 取脱蛋白五味子粗多糖， 用适量水溶解， 离心除去不溶物， 上清液通过 DEAE-52 离子交 换柱进行分离 ； 逐步以0-0.2 mol/L的NaCl水溶液洗脱， 用硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线， 根 据洗脱曲线分别收取合并洗脱液， 其中0 mol/L NaCl水溶液即水的洗脱液经浓缩、 透析后， 上葡聚糖凝胶柱， 以 0.1 mol/L NaCl 水溶液洗脱， 根据洗脱曲线收取合并洗脱液， 经浓缩、 透析、 冻干得低分子量五味子多糖。 3. 权利要求 1 所述的一种低分子量五味子多糖在制备抗肝癌药物中的应用。 4. 权利要求 1。
6、 所述的一种低分子量五味子多糖在制备提高机体免疫功能的保健品中 应用。 权 利 要 求 书 CN 102757510 A 2 1/10 页 3 低分子量五味子多糖及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 涉及一种低分子量五味子多糖的制备方法及其在抗肝 癌和提高机体免疫力方面的应用。 背景技术 0002 恶性肿瘤是世界公认的对人类健康危害最严重的疾病之一， 其危害程度仅次于 心血管疾病。据国际癌症研究机构 GLOBOCAN 2008 统计报告报道 (Jemal， A.， Bray， F.， Center， M.M.， Ferlay， J.， Ward， E.， Forma。
7、n， DGlobal Cancer Statistics.CA ： A Cancer Journal for Clinicians.2011， 61(2)， 69-90 ； GLOBOCAN 2008， Cancer Incidence and Mortality Worldwide ： International Agency for Research on Cancer ； Available at ： http:/globocan.iarc.fr/.)， 2008 年， 全球有 1270 万新发癌症病例， 760 万人死于癌症， 预测2030年， 癌症死亡病例预计上升72， 死亡人数由2。
8、008年的760万上升至1300万人。 可见， 恶性肿瘤已是当今世界影响社会发展的重大问题之一。 肝癌是常见的恶性肿瘤疾病， 据统计 (GLOBOCAN 2008， Cancer Incidence and Mortality Worldwide ： International Agency for Research on Cancer ； Available at ： http:/globocan.iarc.fr/.)2008 年 全球有 69.4 万人死于肝癌， 其死亡率在全球范围内排第三位， 且肝癌的发病率有增长趋 势。 治疗肿瘤的药物很多， 但由于肿瘤细胞与正常组织细胞间缺少根本性的代。
9、谢差异， 大多 数抗肿瘤药在抑制或杀伤肿瘤细胞的同时也会对机体的某些正常细胞、 组织和器官造成损 害， 对人体产生毒性， 在很大程度上制约了药物的使用。因此， 研究开发高效低毒抗肿瘤药 物是当前研究的重点课题之一。 0003 多糖是一种天然高分子化合物， 具有抗肿瘤、 免疫调节、 抗氧化等多种活性， 且毒 性低、 安全性高， 有着很好的抗肿瘤药物应用前景 ( 庞春红 . 多糖药理作用研究进展 . 浙江 中医药大学学报， 2011， 35(4) ： 639-640.)。于荣敏等申请了专利 “一种具有抗肿瘤作用的 红豆杉多糖的制备方法及用途” ( 申请号 ： 200910192993.6)， 发现。
10、不同浓度的红豆杉多糖 溶液对多种癌细胞 ( 人乳腺肿瘤细胞 MCF-7、 人纤维瘤细胞 HT1080、 人宫颈癌细胞 Hela、 人 慢性髓性细胞 K562、 人前列腺癌细胞 PC3、 人肝癌细胞 SMMC7721、 人急性早幼粒白血病细胞 HL-60) 均具有抑制作用， 且抑制作用与浓度呈线性关系。朱振元等申请的专利 “一种具有 抗肿瘤活性的水溶性低分子虫草多糖及其制备方法和用途” (申请号 ： 200910070325.6)， 发 现该多糖对人肝癌细胞株 Bel-7204 和人胃癌细胞株 SGC-7901 的增殖有显著地抑制效果， 对植入小鼠体内的 S180 肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作。
11、用， 并可提高机体免疫功能。 0004 五味子为木兰科五味子 (Schisandra chinensis(Turcz.)Baill， 俗称北五味子 ) 或华中五味子 (S.sphenanthera Rehd.et Wils， 俗称南五味子 ) 的干燥成熟果实， 因其果 实甘、 酸、 辛、 苦、 咸五味， 故名五味子， 又名五梅子、 玄及、 会及、 山花椒等。具有收敛固涩、 益气生津和补肾宁心之功效， 用于久咳虚喘、 梦遗滑精、 遗尿尿频、 久泻不止、 自汗、 盗汗、 津 伤口渴和心悸失眠等症， 为中医常用滋阴强肾药， 广泛应用于肝炎、 神经衰弱等病的治疗。 五味子资源丰富， 含有木脂素、 多糖。
12、、 挥发油等多种活性成分， 是一种开发前景广阔的药食 说 明 书 CN 102757510 A 3 2/10 页 4 兼用的中药材。多糖作为五味子中重要活性成分之一， 现代药理学研究表明， 其具有抗肿 瘤、 免疫促进、 升白细胞、 保肝、 抗衰老和降血糖等多种药理作用 ( 闫舒， 仰榴青， 赵婷， 赵 江丽， 邹艳敏 . 五味子多糖的最新研究进展 J. 江苏大学学报， ( 医学版 )， 2009， 19(4) ： 366-368.)， 已成为人们关注的焦点。朱蓓薇等申请的专利 “五味子活性成分多糖的制备方 法” ( 申请号 ： 200710159047.2)， 提供了一种从五味子中提取活性成分。
13、多糖的方法。于赫 等研究发现五味子粗多糖具有体内抗肿瘤活性， 且可提高荷瘤小鼠的机体免疫。( 于赫， 李 冀， 齐彦.五味子多糖对肝癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及其免疫学机理初探.中医药信息， 2010， 27(2) ： 26-27 ； 于赫， 李冀， 王艳杰 . 五味子多糖对 H22荷瘤小鼠血清 IL-2、 IL-10 和 VEGF表达的干预作用研.中医药学报2010， 38(2) ： 39-41 ； 于赫 ,李冀， 李淑莲五味子多糖 对 H22荷瘤小鼠血清 Zn、 Se 水平变化的于预作用研究 . 中医药信息， 2010， 27(3) ： 25-26.)。 许珂玉等发现一种纯五味子多糖 ( 含。
14、量 60.3mg/g) 可在细胞水平上有效地抑制 survivin 表达， 增加细胞的凋亡率 ( 许珂玉， 肖建英 . 味子多糖对甲状腺癌细胞株 SW579 凋亡及 survivin 表达的影 . 吉林大学学报， 2011， 37(2) ： 279-284.)。本发明人对五味子多糖进 行分离纯化， 确定多糖组分的结构特征， 研究五味子多糖纯化组分体内抗肝癌 (HepG-2) 活 性。但目前有关五味子多糖纯化组分体内抗人肝癌细胞 HepG-2 的研究未见国内外文献报 道， 也未见相应专利公开。 发明内容 0005 基于以上背景技术中存在的不足， 本发明的目的在于提供一种具有肿瘤治疗作用 的中草药。
15、有效部位 - 低分子量五味子多糖组分的制备方法与其药物应用。 0006 一、 本发明的第一个目的在于提供一种低分子量五味子多糖组分 (SCPP11)。 0007 一种低分子量五味子多糖 (SCPP11)， 该多糖分子量为 3.4103Da ； 单糖组成为 ： 甘露糖 (man) 葡萄糖 (glu) 半乳糖 (gal) 1 11.38 3.55 ； 该多糖具有 - 糖苷 键和 - 糖苷键 ； 该多糖具有 (1 3)-glucan( 葡聚糖 ) ； 该多糖具有三股螺旋结构。 0008 二、 本发明的第二个目的在于提供上述低分子量五味子多糖组分 (SCPP11) 的制 备方法， 按照下述步骤进行 ：。
16、 0009 (1) 五味子粗多糖的提取方法 ： 0010 将原料水洗， 60烘干， 粉碎， 并置索氏提取器中， 石油醚 ( 馏程 60-90 ) 脱脂 15h， 过滤， 滤渣 60烘干， 备用 ； 脱脂五味子粉末以料液比 1 8-1 12， 在温度 80-100 水中提取 3-5h， 提取 1-3 次， 合并上清液， 上清液经浓缩后， 加入乙醇醇沉， 使得多糖的浓缩 液中乙醇浓度为 80， 所得沉淀离心、 经冷冻干燥 24-48h 后得五味子粗多糖 ； 取五味子粗 多糖适量， 复溶后使用三氯乙酸法除蛋白， 除蛋白后的糖液透析冻干， 得到脱蛋白五味子多 糖。 0011 (2) 低分子量五味子多糖。
17、的制备 0012 取脱蛋白五味子多糖， 用适量水溶解， 离心除去不溶物， 上清液通过 DEAE-52 离子 交换柱进行分离 ； 逐步以 0-0.2mol/L 的 NaCl 水溶液洗脱， 用硫酸 - 苯酚法绘制洗脱曲线， 根据洗脱曲线分别收取合并洗脱液， 其中 0mol/L NaCl 水溶液 ( 即水 ) 的洗脱液经浓缩、 透 析后， 上葡聚糖凝胶柱， 以0.1mol/L NaCl水溶液洗脱， 根据洗脱曲线收取合并洗脱液， 经浓 缩、 透析、 冻干得低分子量五味子多糖。 说 明 书 CN 102757510 A 4 3/10 页 5 0013 三、 本发明的第三个目的在于提供低分子量五味子多糖组。
18、分 (SCPP11) 作为抗肝 癌药物和提高机体免疫功能保健品中的应用。 0014 四、 根据本发明， 该多糖主要以口服的给药形式使用， 口服给药形式主要有片剂、 胶囊和颗粒剂等。 0015 该发明的优点是 ： 本发明是以中药五味子为原料， 经石油醚脱脂、 热水浸提、 过滤、 浓缩、 醇沉、 离子交换层析等工艺制备而成， 操作简单， 成本低廉 ； 体内抗肝癌 (HepG-2) 活 性研究表明， 该水溶性低分子量五味子多糖组分可显著抑制肿瘤增长， 并且毒性低， 可显著 提高小鼠自身免疫和体内抗氧化活性 ； 该多糖组分可作为抗肝癌药物和提高机体免疫功能 保健品。 附图说明 0016 图 1 是 S。
19、CPP11 的 IR 谱图 ； 0017 图 2 是 SCPP11 的 13C-NMR 谱图 ； 0018 图 3 是 SCPP11-Congo red 复合物的最大吸收波长变化趋势图 ； 0019 图 4 是 SCPP11 对荷瘤小鼠分泌 TNF- 和 IL-2 的影响 , 其中 (a) 对 TNF- 的影 响 ;(b) 对 IL-2 的影响。 具体实施方式 0020 实施例 1 0021 将原料水洗， 60烘干， 粉碎， 并置索氏提取器中， 石油醚 ( 馏程 60-90 ) 脱脂 15h， 过滤， 滤渣 60烘干， 备用。称取 100g 脱脂五味子粉末， 置于圆底烧瓶中， 按料液比 1 8。
20、、 浸提时间 3h、 浸提温度 80， 在热水浴中回流浸提 1 次， 冷却后离心， 合并上清液 ； 上述清 液经减压浓缩， 加入 4 倍体积 95乙醇进行沉淀， 使得多糖的浓缩液中乙醇浓度为 80， 所得沉淀经离心、 冷冻干燥 24h 后得五味子粗多糖样品粉末 ； 取五味子粗多糖适量， 复溶后使用三氯乙酸法除蛋白， 降蛋白后的糖液透析冻干， 得到脱蛋白五味子多糖。 0022 实施例 2 0023 将原料水洗， 60烘干， 粉碎， 并置索氏提取器中， 石油醚 ( 馏程 60-90 ) 脱脂 15h， 过滤， 滤渣 60烘干， 备用。称取 100g 脱脂五味子粉末， 置于圆底烧瓶中， 按料液比 1。
21、 10、 浸提时间 4h、 浸提温度 90， 在热水浴中回流浸提 2 次， 冷却后离心， 合并上清液 ； 上述清液经减压浓缩， 加入 4 倍体积 95乙醇进行沉淀， 使得多糖的浓缩液中乙醇浓度为 80， 所得沉淀经离心、 冷冻干燥 36h 后得五味子粗多糖样品粉末 ； 取五味子粗多糖适量， 复溶后使用三氯乙酸法除蛋白， 降蛋白后的糖液透析冻干， 得到脱蛋白五味子多糖。 0024 实施例 3 0025 将原料水洗， 60烘干， 粉碎， 并置索氏提取器中， 石油醚 ( 馏程 60-90 ) 脱脂 15h， 过滤， 滤渣 60烘干， 备用。称取 100g 脱脂五味子粉末， 置于圆底烧瓶中， 按料液比。
22、 1 12、 浸提时间 5h、 浸提温度 100， 在热水浴中回流浸提 3 次， 冷却后离心， 合并上清液 ； 上述清液经减压浓缩， 加入 4 倍体积 95乙醇进行沉淀， 使得多糖的浓缩液中乙醇浓度为 80， 所得沉淀经离心、 冷冻干燥 48h 后得五味子粗多糖样品粉末 ； 取五味子粗多糖适量， 复溶后使用三氯乙酸法除蛋白， 降蛋白后的糖液透析冻干， 得到脱蛋白五味子多糖。 说 明 书 CN 102757510 A 5 4/10 页 6 0026 实施例 4 五味子多糖的制备 ： 0027 步骤一、 脱蛋白五味子多糖的纯化 0028 1、 实验材料 0029 1.1 药品与试剂 0030 脱蛋。
23、白五味子多糖 ； 0031 DEAE-52 纤维素交换树脂， 英国 Whatman 公司 ； 0032 sephadex G-100， 英国 Whatman 公司。 0033 Dextran T-10， T-40， T-70， T-500， T-2000 和 Blue Dextran T-2000， Pharmacia 公司。 0034 1.2 仪器 0035 UV-7502PC 可见分光光度计， 上海茂欣仪器有限公司 0036 层析柱 ： 1.6cm50cm， 上海沪西分析仪器厂有限公司 0037 DHL-A 电脑恒流泵， 上海沪西分析仪器厂有限公司 0038 DBS-100 电脑自动分部收。
24、集器， 上海沪西分析仪器厂有限公司 0039 2、 实验方法 0040 称取上述实施例1-3中制备的脱蛋白五味子多糖200mg， 溶于10mL蒸馏水中， 充分 溶解后离心， 将上清液滴加到DEAE-52层析柱中， 0-0.2mol/L的NaCl水溶液进行洗脱， 使用 DHL-A 恒流泵， 控制流速 1mL/min， 用自动分部收集器收集。6min 收集一管， 每管收集 6mL， 收集液每管用苯酚 - 硫酸法跟踪检测， 以蒸馏水为空白， 于 490nm 的波长下测定吸光度， 直 到不再有糖检出。根据洗脱曲线， 合并各洗脱峰的洗脱液， 其中水洗脱液部分减压浓缩， 冻 干， 上述步骤所得多糖组分上葡。
25、聚糖凝胶柱， 用 0.1mol/LNaCl 水溶液洗脱， 使用 DHL-A 恒 流泵， 控制流速 0.3mL/min， 用分部自动收集器收集， 每管收集 3mL， 收集液每管用苯酚 - 硫 酸法跟踪检测， 以蒸馏水为空白， 于 490nm 的波长下测定吸光度， 直到不再有糖检出。绘制 洗脱曲线， 合并洗脱峰的洗脱液， 用蒸馏水透析 72h， 减压浓缩， 冻干得到五味子多糖组分 (SCPP11)。 0041 3、 实验结果 0042 得到水溶性低分子量五味子多糖组分 (SCPP11)。 0043 步骤二、 水溶性低分子量五味子多糖的物化性质及结构特征 0044 1、 实验材料 0045 1.1 。
26、药品与试剂 0046 五味子多糖 ； 氯化钠、 硫酸、 三氯乙酸、 苯酚、 氢氧化钠、 盐酸、 醋酸钠、 盐酸羟胺、 肌醇、 吡啶、 醋酸酐、 葡萄糖、 鼠李糖、 木糖、 阿拉伯糖、 甘露糖、 高碘酸钠、 刚果红等均为分析 纯。 0047 1.2 仪器 0048 LC-10AVP 高效液相色谱系统， 日本岛津 0049 TSK-GEL G4000PW(7.5300mm)， TOSOH 公司 0050 预柱 ： TSK-GUARD COLUMN PWH(7.575mm)， TOSOH 公司 0051 ALPHA2-4 冷冻干燥设备， 德国 CHRIST 公司 0052 PHS-2C 型酸度计， 。
27、上海分析仪器厂 0053 R-200 型旋转蒸发器， 瑞士 Bchi 公司 说 明 书 CN 102757510 A 6 5/10 页 7 0054 GC 2010 气相色谱系统， 日本岛津 0055 RTS-5 气相毛细管柱， (30m0.32mm) 0056 NEXUS 670 智能型傅立叶红外光谱仪， 美国尼高利公司 0057 核磁共振仪， Braker 0058 2、 实验方法 0059 2.1 分子量的测定 0060 按照多糖的常规方法， 以分子量已知的 T-10， T-40， T-70， T-500 和 T-2000 为标 准， LC-10AVP 岛津高效液相色谱系统， 色谱柱为 。
28、TSK-GEL G4000PW(7.5300mm)， 流动相为 0.003mol/L 的醋酸钠溶液， 流速 0.8mL/min ； 检测器 SHIMADZU RID-10A， 温度 25。多糖溶 液过 0.45m 的滤膜， 进样 10L。 0061 2.2 单糖组成分析 0062 精密称取多糖样品 5mg 于安瓿瓶中， 用 2mol/L 的硫酸溶液溶解， 封口， 100烘箱 中加热水解 8h 后， 水解液加碳酸钡中和至中性， 以 4000r/min 离心除去 BaSO4沉淀， 上清液 冷冻干燥。水解产物经乙酰化后用岛津 GC 2010 气相色谱系统分析。 0063 2.3IR 测定 0064 。
29、取 1mg 经干燥的多糖样品， 与 100 200mg 经干燥的 KBr 粉末在玛瑙研钵中轻轻 研磨均匀(在红外灯下操作)。 经压片机压成薄片， 于NEXUS 670智能型傅立叶红外光谱仪 测定获得红外光谱图。 0065 2.4NMR 测定 0066 取多糖样品 20mg 经 D2O 交换 3 次后， 溶于 0.5mLD2O 中， 用 BRUKER400 型核磁共振 仪， 13C-NMR(100MHz， 温度 673.2K)( 参见图 2)。 0067 2.5 刚果红实验 0068 称取五味子多糖组分5mg， 加入2mL蒸馏水和2mL80mol/L的刚果红试剂， 之后逐 渐加入 1mol/L 。
30、的 NaOH 溶液， 使混合液的浓度从 0 逐渐提高到 0.5mol/L(0、 0.1、 0.15、 0.2、 0.25、 0.3、 0.35、 0.4、 0.45、 0.5mol/L)， 并用紫外可见光谱仪扫描， 测定各碱性梯度下最大 吸光值 ( 参比为 2mL 蒸馏水和 2mL80mol/L 的刚果红试剂， 逐渐加入 1mol/L 的 NaOH 溶 液， 使混合液的浓度从 0 逐步提高到 0.5mol/L)， 以 NaOH 浓度为横坐标， 最大吸收波长为纵 坐标绘图。 0069 3、 实验结果 0070 SCPP11分子量为3.4103Da。 SCPP11由甘露糖， 葡萄糖和半乳糖组成， 。
31、其摩尔比为 甘露糖葡萄糖半乳糖111.383.55。 五味子多糖在3395cm-1、 2927cm-1、 1384cm-1 和 1025-1152cm-1处均出现强吸收峰， ( 为糖的特征吸收峰， 其中 3395cm-1为 -OH 伸缩振动 峰、 2927cm-1和 1384cm-1分别为亚甲基的 C-H 伸缩振动峰和 C-H 弯曲振动峰、 1025-1152cm-1 为吡喃糖环的振动峰 ) ； 852cm-1和 893cm-1特征吸收峰表明， SCPP11 同时具有 - 糖苷键和 - 糖苷键 ； 855cm-1和 931cm-1特征吸收峰表明， SCPP11 具有 (1 3)-glucan。。
32、图 2 为 五味子多糖的 13C-NMR 谱图， 104ppm， 102ppm， 99ppm， 95ppm 和 91ppm 为异头碳的 化 学位移， 表明SCPP11同时具有-糖苷键和-糖苷键 ； 7770ppm之间的峰为未发 生取代的 C2、 C3、 C4、 C5的化学位移 ； 61 和 60ppm 为未发生取代的 C6的化学位移。另外， 170180ppm未见碳信号， 表明其不含糖醛酸， 与红外和组成分析结果一致。 图3为SCPP11 说 明 书 CN 102757510 A 7 6/10 页 8 与刚果红形成了络合物的最大吸收波长变化， 络合物的最大吸收波长较刚果红的最大吸收 波长红移。。
33、当 NaOH 浓度升高时， 络合物的最大吸收波长急剧下降， 说明高浓度的 NaOH 破坏 了多糖的螺旋结构， 使其解体为单股线团， 而导致最大吸收波长下降， 推测 SCPP11 具有三 螺旋结构。 0071 试验一五味子多糖组分体内抗肝癌 (HepG-2) 活性研究 0072 1 仪器、 材料与试剂 0073 1.1 仪器 0074 Spectra Max 190 酶标仪， 美国 molecular device 公司 0075 Sigma 1-13 高速台式离心机， Sigma 公司 0076 数控恒温水浴锅， 巩义市英峪予华仪器厂 0077 HSS-1 型恒温浴槽， 江苏金坛医疗仪器厂， 。
34、中国 0078 BS124S 型电子天平， 北京赛多利斯仪器系统有限公司 0079 匀浆机， 德国 IKA 公司 0080 1.2 材料与试剂 0081 1.2.1 实验动物 0082 ICR 小鼠， 雌性， 体重 202g， 清洁级， 购于扬州大学比较医学中心， 合格证编号 ： SCXK( 苏 )2007-0001。实验前检疫 3d， 饲养温度为 211， 湿度为 605。 0083 1.2.2 实验试剂与药品 0084 五味子多糖 ( 自制 ) ； 5- 氟脲嘧啶 ； 生理盐水 ； 苦味酸 ； 0085 IL-2 酶联免疫试剂盒 ； TNF- 酶联免疫试剂盒 ； 丙二醛 (MDA) 试剂盒。
35、 ； 超氧化物 岐化酶 (SOD) 试剂盒 ； 南京建成生物工程研究所 ； 0086 冰醋酸、 CaCl2等都为市售分析纯。 0087 1.3 统计学处理 0088 数据用 SPSS15.0 统计软件进行处理。结果用 表示， 两组间差异采用 t- 检 验 ； 多组间差异采用单因素方差分析 (One-way ANOVA)。P 0.05 有统计学意义。 0089 2 实验方法 0090 2.1 荷瘤小鼠瘤株的保种、 传代及移植瘤模型建立 0091 (1) 瘤株的保种 0092 取体重202g的昆明小鼠23只， 每只接0.2ml， 腹腔接种Heps腹水瘤瘤株， 定 期每 7 9 天传一代。 0093。
36、 (2) 腋下移植瘤模型的建立 0094 取腹腔传代 7 天且生长良好的 Heps 腹水瘤小鼠， 脱颈椎处死， 75乙醇消毒动 物皮肤， 在无菌条件下， 剪开小鼠腹腔， 吸取生长良好的腹水， 观察腹水颜色 ( 腹水为乳白 色无絮状沉淀物者为佳， 血性腹水则不可用 ) 并用台盼蓝染色法观察活细胞数 ( 活细胞数 98 ) ； 腹水用生理盐水稀释， 吹打混匀， 细胞计数板计数， 调整细胞数为 2107个活细 胞 /mL ； 取昆明种小鼠， 右侧腋部皮肤常规酒精消毒， 持 1mL 注射器于小鼠右腋下皮下注射 0.2mL 瘤细胞悬液， 制成局灶性肿瘤模型。 0095 2.2 实验分组与给药 0096 。
37、50只雌性小鼠于实验前适应喂养3天， 接种后次日将其随机分为5组， 每组10只， 说 明 书 CN 102757510 A 8 7/10 页 9 设正常组、 模型组、 阳性对照组 (5-Fu)、 SCPP11 高、 低两个剂量组 ； 接种 24h 后开始给药， 每 天 1 次， 连续 10d。( 灌胃量均为 0.2mL/ 只， 腹腔注射 0.1ml/ 只 ) 分组、 剂量和给药途径如 下 ： 0097 正常组 ： 健康小鼠， 每天灌胃相同剂量的生理盐水 (0.2mL/10g/d， i.g)+ 腹腔注射 生理盐水 (0.1mL/10g/d， i.p)， 自由进食和饮水 ； 0098 模型组 ： 。
38、接种小鼠， 每天灌胃相同剂量的生理盐水 (0.2mL/10g/d， i.g)+ 腹腔注射 生理盐水 (0.1mL/10g/d， i.p)， 自由进食和饮水 ； 0099 5- 氟尿嘧啶组 ： 接种小鼠， 每天灌胃相同剂量的生理盐水 (0.2mL/10g/d， i.g)+ 腹 腔注射相同剂量的 5-Fu(25mg/kg/d， i.p)， 自由进食和饮水 ； 0100 五味子多糖给药组 ： 接种小鼠， 分高、 低两个剂量组， 0101 SCPP11-H 每天分别灌胃相同剂量五味子多糖 (200mg/kg/d， i.g/)， 自由进食和 饮水 ； 0102 SCPP11-L 每天分别灌胃相同剂量五味。
39、子多糖 (50mg/kg/d， i.g/)， 自由进食和 饮水 ； 0103 2.3 相关考察指标 ： 0104 2.3.1、 动物生长状况 0105 每日观察动物一次， 观察动物精神状况、 行为和毛色有无异常， 称重并记录以了解 动物体重变化情况 (0、 14 天称重 )。 0106 2.3.2、 器官指数和抑瘤率 0107 末次给药后次日， 禁食 8h， 称体重， 摘眼球取血后处死 ； 取出瘤块、 胸腺、 脾脏、 心、 肝、 肾， 经生理盐水洗涤后用滤纸吸干， 称重。按下式计算抑瘤率和各脏器指数 ： 0108 抑瘤率 ( ) (C-T)/C100 0109 式中 C 为模型对照组平均瘤重，。
40、 T 为实验组平均瘤重。 0110 脏器指数脏器重量 (mg)/ 体重 (g) 0111 2.3.3、 血液学指标 0112 末次给药 24 小时候后眼球取血 0.5 1mL， 收集血液于抗凝管 ( 紫色 ： EDTA-K2 ； 血常规 ( 血液细胞分析 ) 中， 充分混匀后， 于 4冰箱储存， 备用。进行血常规分析。 0113 2.3.4、 血液生化指标 0114 末次给药 24h 后摘眼球取血 0.5 1mL， 收集血液， 放置 4h 后离心， 3000r/min 离 心 15min， 取血清置于 4 保存， 备用。测定谷丙转氨酶 (ALT) 和谷草转氨酶 (AST)。 0115 酶联免疫。
41、试剂盒测定血清中 IL-2 和 TNF- 的含量。 0116 2.3.5、 对心肝肾组织中 SOD 和 MDA 的影响 0117 心、 肝、 肾各取150-400mg左右置于10ml离心管中， 加入7ml生理盐水， 制成5的 组织匀浆， 经 3000rpm/min 离心后， 取上清液， 用试剂盒测定丙二醛 (MDA) 和超氧化物岐化 酶 (SOD) 的含量。 0118 2.3.6、 数据统计 0119 数据用 SPSS15.0 统计软件进行处理。结果用 表示， 用组间 one-way ANOVA 检验比较各给药组与对照组之间的显著性。P 0.05 有统计学意义。 0120 3、 实验结果 说 。
42、明 书 CN 102757510 A 9 8/10 页 10 0121 3.1 SCPP11 对 HepG-2 荷瘤小鼠肿瘤生长的影响 0122 表 1 SCPP11 对 HepG-2 荷瘤小鼠抗肿瘤活性的影响 0123 0124 与正常对照组相比， ap 0.05 0125 与阴性对照组相比， bp 0.05 0126 与阳性对照组相比， cp 0.05 或ccp 0.01 0127 如表 1 所示， 给药 10 天后， SCPP11 在低剂量 50mg/kg 时， 对 HepG-2 的体内抑制率 达到了 68.54， 高于阳性药 (5-Fu) 的抑制率 (61.71 )。 0128 3.2。
43、 SCPP11 对 HepG-2 荷瘤小鼠免疫的影响 0129 表 2 SCPP11 对脏器指数的影响 0130 0131 与正常对照组相比， ap 0.05 0132 与阴性对照组相比， bp 0.05 0133 与阳性对照组相比， cp 0.05 或ccp 0.01 0134 SCPP11对荷瘤小鼠免疫指数的影响如表2所示， 给药10天后， 与阴性对照组相比， 阳性对照组 (5-Fu) 胸腺指数和脾脏指数显著降低 (p 0.05)， 可见， 5-Fu 对荷瘤小鼠免疫 有抑制作用。 而SCPP11给药组的胸腺指数和脾指数均有增加， 特别是在剂量为50mg/kg时， SCPP11 对胸腺指数的。
44、增加具有显著性差异 (p 0.05)。可见， SCPP11 能激活荷瘤小鼠的 免疫系统。 0135 SCPP11 对荷瘤小鼠血清中 TNF- 和 IL-2 水平的影响如图 4 所示， 与阴性对照组 相比， 阳性对照组的 TNF- 和 IL-2 水平显著降低 (p 0.05)， 可见 5-Fu 对这两种细胞因 子的分泌有抑制作用。而 SCPP11 在剂量为 50mg/kg 时， 对荷瘤小鼠血清中 TNF- 和 IL-2 的分泌有一定的促进作用。 0136 3.3 SCPP11 对 HepG-2 荷瘤小鼠毒性的影响 0137 从表1可以看出， 给药10天后， SCPP11给药组的体重增加率显著高于。
45、阳性对照组， 表明 SCPP11 对机体毒副作用小。 0138 表 3 SCPP11 对荷瘤小鼠外周血象的影响 0139 说 明 书 CN 102757510 A 10 9/10 页 11 0140 与空白对照组相比， ap 0.05 0141 与阴性对照组相比， bp 0.05 0142 与阳性对照组相比， cp 0.05 或ccp 0.01 0143 从表 3 可以看出， 5-Fu 可降低荷瘤小鼠血液中白细胞数量， 红细胞数量和血小板 含量， 而 SCPP11 可使荷瘤小鼠外周血中血小板和红细胞数量正常化， 并且可升高外周血中 白细胞的数量， 特别是在剂量为 50mg/kg 时， 与阴性对。
46、照组和阳性对照组相比， 白细胞数具 有显著性差异。 0144 表 4 SCPP11 对荷瘤小鼠外周血生化指标的影响 0145 0146 与空白对照组相比， ap 0.05 0147 与阴性对照组相比， bp 0.05 0148 与阳性对照组相比， cp 0.05 或ccp 0.01 0149 表 5 SCPP11 对荷瘤小鼠肝肾心组织中 SOD 活性和 MDA 水平的影响 0150 0151 与空白对照组相比， ap 0.05 0152 与阴性对照组相比， bp 0.05 0153 与阳性对照组相比， cp 0.05 或ccp 0.01 0154 从表 2 可以看出， 与正常对照组相比， SC。
47、PP11 给药组的肝脏指数， 肾脏指数和心脏 指数都没有显著性差异 ； 而阳性对照的肝脏指数有一定的增加。从表 4 可以看出， 5-Fu 可 显著增加荷瘤小鼠血清中的 AST 和 ALT 浓度， 而 SCPP11 可使荷瘤小鼠血清中 AST 水平正常 化。从表 5 可见， 5-Fu 可降低荷瘤小鼠肝脏组织中 SOD 的活性和 MDA 的含量， 而 SCPP11 在 50mg/kg 时， 可显著提高荷瘤小鼠肝脏组织中 SOD 的活性 (p 0.05)。由上可见， 5-Fu 肝脏 有一定的毒性， 而 SCPP11 不具有肝毒性且对肝脏有一定的保护作用。 0155 4、 结论 说 明 书 CN 102757510 A 11 10/10 页 12 0156 SCPP11 具有显著地抗肝癌 (HepG-2) 活性， 可显著抑制肝癌的生长， 并与 5-Fu 相 比， 该多糖组分毒性低， 可显著增强小鼠自身免疫能力和体内抗氧化活性。 说 明 书 CN 102757510 A 12 1/3 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102757510 A 13 2/3 页 14 图 3 说 明 书 附 图 CN 102757510 A 14 3/3 页 15 图 4 说 明 书 附 图 CN 102757510 A 15 。