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1、(10)申请公布号 CN 103204790 A (43)申请公布日 2013.07.17 CN 103204790 A *CN103204790A* (21)申请号 201210011431.9 (22)申请日 2012.01.15 C07C 323/59(2006.01) C07C 319/20(2006.01) A61K 31/223(2006.01) A61P 29/00(2006.01) (71)申请人 复旦大学 地址 200433 上海市杨浦区邯郸路 220 号 (72)发明人 王洋 朱依谆 刘新华 贾尧玲 潘礼龙 杨荷贝 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所 ( 。
2、普通合伙 ) 31268 代理人 吴桂琴 (54) 发明名称 丹参素衍生物及其制备方法和在制药中的用 途 (57) 摘要 本发明属中药制药领域， 涉及中草药丹参中 有效成分丹参素衍生物及其制备方法和在制药中 的应用， 尤其是在制备防治炎症相关疾病药物中 的用途。 本发明通过体外炎症模型实验， 结果显示 所述的丹参素衍生物显著抑制炎症介质的表达， 能减少炎症诱导的一氧化氮的释放， 明确了该丹 参素衍生物抑制细胞炎症的调控机制， 证实所述 的丹参素衍生物对炎症相关疾病具有明显的抗炎 作用， 可制备防治炎症相关疾病的药物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 3 页 (。
3、19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103204790 A CN 103204790 A *CN103204790A* 1/2 页 2 1. 式 (I) 结构的丹参素衍生物， 其中， R1、 R2、 R3为低级酰基或烃基， R4为低级烃基， 选自甲叉基、 甲基、 乙基、 丙基、 异丙 基、 苄基、 乙酰基、 丙酰基或苯甲酰基。 2. 权利要求 1 的丹参素衍生物的制备方法， 其特征在于， 通过如下反应流程制备合成 ： 3.根据权利要求1所述的丹参素衍生物， 其特征在于， 所述的丹参素衍生物是下式1结 构的化合。
4、物 (2R)-3- 苄硫基 -2-2- 乙酰氧基 -3-(3， 4- 二乙酰氧基苯基 ) 丙酰氨基 丙酸 甲酯 (1) 的立体异构体及其类似物， 4. 权利要求 3 所述的丹参素衍生物的制备方法， 其特征在于， 从 3， 4- 二羟基苯甲醛 (2) 和乙酰甘氨酸 (3) 出发， 通过如下反应流程制备合成 ： 权 利 要 求 书 CN 103204790 A 2 2/2 页 3 5. 权利要求 1 或 3 的丹参素衍生物在制备防治炎症相关疾病药物中的用途。 6. 按权利要求 5 的用途， 其特征是， 所述的丹参素衍生物通过抑制炎症相关基因的蛋 白表达水平发挥抗炎作用。 7. 根据权利要求 5 所。
5、述的用途， 其特征是， 所述的丹参素衍生物抑制一氧化氮的释放 发挥抗炎作用。 8. 根据权利要求 5 所述的用途， 其特征是， 所述的丹参素衍生物抑制 LPS 对信号通路 PI3K/Akt 的激活， 抑制转录因子 NF-B 的激活及转位， 发挥抑制炎症作用。 权 利 要 求 书 CN 103204790 A 3 1/7 页 4 丹参素衍生物及其制备方法和在制药中的用途 技术领域 0001 本发明属中药制药领域， 涉及中草药丹参中有效成分丹参素衍生物及其制备方法 和在制药中的应用， 尤其是在制备防治炎症相关疾病药物中的用途。 背景技术 0002 据研究证实， 炎症反应是缺血性心脏病的首要发病因素。
6、之一， 并在其发生发展过 程及愈后中始终伴有重要角色。 缺血心肌中的炎症反应是巨噬细胞和心肌细胞功能紊乱的 诱因， 同时又是心肌内氧化应激的诱因。 研究者认为， 干预其免疫相关炎症反应将能有效的 预防心肌缺血损伤的发生、 发展。通过干预缺血心肌中的炎症反应将可有效的防止缺血引 起的心肌功能紊乱。 0003 丹参为双子叶植物唇形科鼠尾草属植物丹参 Salvia miltiorrhiza Bge. 的干燥 根及根茎。出于 神农本草经 ， 生于山坡草地林边道旁， 或疏林干燥地上。性味苦， 微寒。 归心、 肝经。功效主要有活血调经， 祛瘀止痛， 凉血消痈， 清心除烦， 养血安神。在中医中主 治月经不调。
7、， 经闭痛经， 症瘕积聚， 胸腹刺痛， 热痹疼痛， 疮疡肿痛， 心烦不眠 ； 肝脾肿大， 心 绞痛。 0004 丹参素衍生物是传统中药丹参的特异成分丹参素的改造产物， 有文献表明， 丹参 具有调节免疫因子的分泌， 并且通过减少 Ic 和抗体的数量， 减轻免疫损伤的作用。丹参素 (Danshensu， 化学名 ： (R)-(+)-3-(3， 4- 二羟基苯基 )-2- 羟基丙酸 ) 作为丹参中的有效成 分之一， 其抗氧化、 抗凋亡的作用也见有相关报道， 但是其作用效果不明显、 结构不稳定以 及作用机制不明确的问题有待进一步的改进和研究。 0005 0006 L- 半胱氨酸为人体内源性的氨基酸， 。
8、无毒、 稳定并可通过体内 - 胱硫醚分解酶 和 - 胱硫醚合成酶代谢释放内源性 H2S。近年来研究已证实内源性 H2S 具有多种重要的 生理功能， 包括使 HMG-CoA 还原酶失活而产生抑制胆固醇合成的活性， 可使血管平滑肌舒 张和抑制血管平滑肌细胞增殖、 预防暂时性高血压的产生， 还具有通过增加抗氧化酶系统 的活性和直接去除部分自由基来改善缺血再灌注损伤的作用， 其在调节血管舒张功能及血 管重建中均居于重要地位， 被认为是继 NO 和 CO 之后发现的又一种新型神经调节因子和信 号传递因子。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种中草药丹参中有效成分丹参素衍生物及其制备方法。 0008。
9、 本发明的进一步目的是提供制得的丹参素衍生物的在制备药物组合物中的新的 用途， 尤其是制得的丹参素衍生物在制备防治炎症相关疾病的药物组合物中的用途。 说 明 书 CN 103204790 A 4 2/7 页 5 0009 本发明对丹参素进行结构改造， 合成了其与 L- 半胱氨酸衍生物通过酰胺键结合 的互联体前药。本发明的互联体前药中， 丹参素与 L- 半胱氨酸衍生物的结合体既能将不稳 定的结构因素 ( 两个酚羟基 ) 保护起来、 提高脂溶性， 又能分别释放药物活性成分， 可通过 协同作用增强活性。 0010 本发明的丹参素衍生物具有下式 (I) 的结构特征 ： 0011 0012 其中， R1。
10、、 R2、 R3为低级酰基或烃基， R4为低级烃基， 如甲叉基、 甲基、 乙基、 丙基、 异 丙基、 苄基、 乙酰基、 丙酰基或苯甲酰基等。 0013 本发明中， 上述化合物通过如下反应流程制备合成 ： 0014 0015 本 发 明 中， 优 选 的 丹 参 素 衍 生 物， 是 下 式 1 结 构 的 化 合 物 (2R)-3- 苄 硫 基 -2-2- 乙酰氧基 -3-(3， 4- 二乙酰氧基苯基 ) 丙酰氨基 丙酸甲酯 (1) 的立体异构体及 其类似物， 0016 0017 本发明中， 式 1 结构的化合物的制备方法为， 从 3， 4- 二羟基苯甲醛 (2) 和乙酰甘 氨酸 (3) 出发。
11、， 通过如下反应流程制备合成 ： 0018 说 明 书 CN 103204790 A 5 3/7 页 6 0019 本发明提供了所制得的丹参素衍生物的抗炎活性。 0020 本发明通过革兰氏阴性菌内毒素主要成分脂多糖 (LPS) 诱导的小鼠巨噬细胞系 RAW264.7 炎症模型进行丹参素衍生物对炎症反应的保护作用试验 ； 通过 Westernblot 方 法检测丹参素衍生物 Toll 样受体 4(TLR4)， Toll 样受体 2(TLR2)， 诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) 的蛋白表达以及细胞上清中释放一氧化氮 (NO) 的影响， 结果表明， 所述的丹参素衍 生物能明显抑制 Toll 样受体。
12、 4， (TLR4)， Toll 样受体 2(TLR2)， 诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) 的蛋白的表达， 同时减少培养液中一氧化氮的释放。 0021 本发明通过检测相应的信号转导通路 PI3K/Akt 的激活， 明确了所述的丹参素衍 生物能抑制小鼠巨噬细胞炎症的调控机制 ； 所述的丹参素衍生物能抑制脂多糖 (LPS) 对 Akt 的激活， 抑制 NF-B 的激活及转位， 从而抑制炎症反应 ； 检测结果表明， 所述的丹参素 衍生物能明显抑制 LPS 诱导的炎症反应。 0022 本发明制得的丹参素衍生物对炎症相关疾病具有显著的抗炎作用， 可作为药物活 性成分制备防治炎症相关疾病的药物。 附图说。
13、明 0023 图 1 是 MTT 方法检测丹参素衍生物对小鼠巨噬细胞 RAW264.7 的毒性结果， 0024 其中显示了丹参素衍生物 200M 浓度与正常细胞比较未见毒性。 0025 图 2 是 Griess 法及 Western blot 分别检测丹参素衍生物对 NO 的释放量及相关 基因 iNOS 的蛋白水平的影响结果， 0026 其中， (A) 正常组数据用 100表示， 其余各组和正常组的相对浓度表示 ； 说 明 书 CN 103204790 A 6 4/7 页 7 0027 (B) 数据用目的基因和相应内参 GAPDH 相比 ； 0028 Dex ： 阳性对照药地塞米松 ； 002。
14、9 # ： 和未处理组细胞相比 p 0.05 ； 0030 ： 丹参素衍生物治疗组及抑制剂和模型组相比 p 0.05 ； 0031 Com 1 ： Compound 1。 0032 图 3 是 Western blot 方法检测丹参素衍生物对炎症相关基因 TLR4， TLR2 的蛋白 表达的影响结果， 0033 其中， 数据用目的基因和相应内参相比 ； 0034 Dex ： 阳性对照药地塞米松 ； 0035 # ： 和未处理组细胞相比 p 0.05 ； 0036 ： 丹参素衍生物治疗组和模型组相比 p 0.05 ； 0037 Com 1 ： Compound 1。 0038 图 4 是用 Gr。
15、iess 法及 Western blot 分别检测丹参素衍生物及各个信号通路抑制 剂对 NO 的释放量及相关基因 iNOS 的蛋白水平的影响， 0039 其中， 数据用目的基因和相应内参相比 ； 0040 # ： 和未处理组细胞相比 p 0.05 ； 0041 ： 丹参素衍生物治疗组及信号通路抑制剂组和模型组相比 p 0.05 ； 0042 Com 1 ： Compound 1。 0043 图 5 是用 western blot 方法检测转录因子 NF-B 的激活， 0044 其中， 数据用目的基因和相应内参相比 ； 0045 # ： 和未处理组细胞相比 p 0.05 ； 0046 ： 丹参素。
16、衍生物治疗组及抑制剂 LY394002 组和模型组相比 p 0.05 ； 0047 Com 1 ： Compound 1。 具体实施方式 0048 通过下述各实施例将有助于进一步理解本发明， 但并不限制本发明的内容。 0049 以化合物 (2R)-3- 苄硫基 -2-2- 乙酰氧基 -3-(3， 4- 二乙酰氧基苯基 ) 丙酰氨 基 丙酸甲酯 (1) 的立体异构体及其类似物为代表化合物， 0050 0051 从 3， 4- 二羟基苯甲醛 (2) 和乙酰甘氨酸 (3) 出发， 通过如下反应流程制备合成 ： 0052 说 明 书 CN 103204790 A 7 5/7 页 8 0053 本发明的。
17、制备方法可以进一步用代表性化合物制备过程体现如下 ： 0054 实施例 1(Z)-2- 乙酰氨基 -3-(3， 4- 二乙酰氧基苯基 ) 丙烯酸 (5) 的合成 0055 0056 在 500mL 茄形瓶中加入 3， 4- 二羟基苯甲醛 (2)(21.6g， 0.156mol)、 N- 乙酰甘 氨酸 (3)(18.4g， 0.156mol)、 无水醋酸钠 (12.8g， 0.156mol) 和无水醋酐 (60mL， 64.8g， 0.638mol)， 加热至 120反应 2h， 以石油醚 / 乙酸乙酯 (V/V) 2 1 为展开剂， TLC 显示 原料点 (Rf 0.2) 消失， 原料点浸磷钼。
18、酸烤出红色， 出现新点 (Rf 0.45)， 浸磷钼酸烤不 出颜色。停止反应趁热向反应液中加入 400mL 冷水静置过夜， 有黄色固体析出， 将固体过滤 后溶于乙酸乙酯重结晶， 得到黄色固体产物 (5)37.5g， 收率 75 ： mp 181-183 . 0057 实施例 2(Z)-3-(3， 4- 二羟基苯基 )-2- 羟基丙烯酸 (6) 的合成 0058 0059 在 250mL 茄形瓶中加入化合物 5(10g， 0.031mol)， 并加入 9盐酸 40mL， 在加热回 流条件下反应 3h， 反应液为深红色， 以氯仿 / 甲醇 / 乙酸 (V/V/V 20 4 1) 为展开剂， 说 明。
19、 书 CN 103204790 A 8 6/7 页 9 TLC 显示原料点 (Rf 0.9) 消失， 有新点 (Rf 0.3) 生成有拖尾， 浸磷钼酸后新点能烤出 深蓝色， 而原料点烤不出颜色， 停止反应， 待反应液冷却静置过夜有红色固体析出， 用少量 水洗得浅黄色固体 (6)1.94g， 收率 32 ： mp 177-181 . 0060 实施例 3(Z)-2- 乙酰氧基 -3-(3， 4- 二乙酰氧基苯基 ) 丙烯酸 (7) 的合成 0061 0062 在 100mL 茄 形 瓶 中 加 入 化 合 物 6(1.5g， 7.65mmol)、 无 水 乙 酐 (10mL， 10.8g， 0.。
20、107mol) 和无水醋酸钠 (0.8g， 9.76mmol)， 室温搅拌反应 6h， 以乙酸乙酯 ( 加入两滴醋 酸 ) 为展开剂， TLC 显示原料消失， 有新点 (Rf 0.3) 产生， 原料点拖尾严重， 产物为一圆 点。停止反应， 加水约 15mL， 用乙酸乙酯萃取， 合并有机相， 无水 Na2SO4干燥， 过滤， 浓缩， 有 黄色固体析出， 得黄色固体化合物 (7)2.2g， 收率 90 ： mp 188-190 . 0063 实施例 42- 乙酰氧基 -3-(3， 4- 二乙酰氧基苯基 ) 丙酸 (9) 的合成 0064 0065 将化合物 7(1g， 3.1mmol)、 10 P。
21、d-C(200mg) 和 9mL 甲醇， 加入高压釜中， 在 15bar 压力的氢气下， 室温搅拌24h后， TLC(展开剂石油醚/乙酸乙酯51， 加两滴醋酸)显 示与原料同等高度有点， 但紫外显色较弱， 在 (Rf 0.9) 处出现一个新点。硅藻土过滤后， 柱层析分离纯化， 收集对应洗脱液得粘稠液体化合物 (9)0.68g， 收率 68 .1H NMR(CDCl3， 400MHz)2.17(s， 3H， 2-OCOCH3)， 2.27(s， 6H， Ph-OCOCH3)， 3.12-3.18(m， 2H， 3-CH2)， 5.21(br， 1H， -COOH)， 7.09-7.12(m， 3。
22、H， Ph-H).收集对应于Rf0.9处洗脱液蒸干得白色固 体化合物 (8)148mg， 收率 15： mp75-78 .1H NMR(CDCl3， 400MHz)2.28(s， 6H， -OCOCH3)， 2.68(t， J 7.6， 2H， 3-CH2)， 2.95(t， J 7.6， 2H， 2-CH2)， 7.04(s， 1H， Ph-H)， 7.10(s， 2H， Ph-H). 0066 实施例5(2R)-3-苄硫基-2-2-乙酰氧基-3-(3， 4-二乙酰氧基苯基)丙酰氨基 丙酸甲酯 (1) 的合成 0067 0068 在 50mL 茄形瓶中加入化合物 9(162mg， 0.5mm。
23、ol)、 化合物 10(244mg， 0.55mmol)、 HOBt(82mg， 0.6mmol)、 DIPEA(0.1mL， 0.6mmol) 和 8mL 二 氯 甲 烷 搅 拌， 最 后 加 入 EDC 盐 酸 盐 (116mg， 0.6mmol)， 室 温 搅 拌 反 应 2h 后， TLC( 展 开 剂 石 油 醚 / 乙 酸 乙 酯 1 1) 显示原料 9 基本消失， 有新点生成 (Rf 0.3)， 停止反应， 直接拌硅胶柱层析 分离纯化， 收集对应的洗脱液， 蒸干溶剂得白色粘稠状化合物 (1)207mg， 收率 78 ： 说 明 书 CN 103204790 A 9 7/7 页 1。
24、0 1H NMR(CDCl 3， 400MHz)2.12(d，J 7.9， 3H， -OCOCH3)， 2.25-2.27(m， 6H， -2OCOCH3， )， 2.78-2.87(m， 2H， -SCH2-)， 3.11-3.21(m， 2H， -CH2Ar)， 3.65(s， 2H， -CH2Ph)， 3.74(s， 3H， -COOCH3)， 4.71-4.75(m， 1H， -NHCH-)， 5.36-5.40(m， 1H， -NHCH-)， 6.75(t， J 7.9Hz， 1H， 5 -H)， 7.05-7.09(m， 3H， Ar-H)， 7.24-7.33(m， 4H， Ar。
25、-H).ESI-MS m/z( ) ： 554.8(M+Na+).HRMS calcd mass for C26H29NO9SM+H+532.1636， found 532.1633. 0069 当 R1、 R2、 R3为低级酰基或烃基、 R4为低级烃基 ( 如甲叉基、 甲基、 乙基、 丙基、 异丙 基、 苄基、 乙酰基、 丙酰基或苯甲酰基 ) 时， 均可采用上述反应流程合成制得相应的产物。 0070 实施例 6 丹参素衍生物对体外小鼠巨噬细胞系 RAW264.7 炎症反应的保护作用 0071 分组 ： 将 1105个巨噬细胞种入 12 孔培养皿培养 3 天达 85-90， 细胞同步化 4h，。
26、 随机分成 6 组， 即 ： 正常对照组 ； 模型组 ； 丹参素衍生物低剂量组 ； 丹参素衍生 物中剂量组 ； 丹参素衍生物高剂量组 ； 阳性药组。给药 ： - 加入终浓度为 10M、 50M、 100M 的丹参素衍生物， 地塞米松 10M， 培养 4h。加入 LPS(1g/ml) 培养诱导 巨噬细胞炎症反应。收集上清及蛋白， 测定的炎症相关产物及蛋白 ： NO 和诱导型一氧化氮 合成酶 iNOS。实验数据进行单因素方差分析， p 0.05， 结果显示丹参素衍生物能抑制炎 症相关产物 NO 的产生。采用 Western blot 方法检测炎症相关蛋白 iNOS 的表达。结果表 明， 丹参素衍生。
27、物明显抑制 iNOS 的表达。 0072 实验结果证明， 所述的丹参素衍生物对 LPS 诱导的炎症反应具有明显的保护作 用， 可制备防治炎症相关疾病的药物。 0073 实施例 7 丹参素衍生物对 LPS 诱导的巨噬细胞炎症反应调控机制的影响 0074 分组 ： 将1105个巨噬细胞种入12孔培养皿培养3天达85-90， 细胞同步化4h， 随机分成6组， 即 ： 正常对照组 ； 模型组 ； 丹参素衍生物组 ； 丹参素衍生物加LPS诱 导组 ； PI3K 抑制剂 LY294002 加 LPS 诱导组 ； 给药 ： 加入终浓度为 50M 的丹参素衍 生物， LY29400210M， 培养 4h。加入 LPS(10ng/ml) 作用 15min 后， 收集细胞蛋白， 采用 Western blotting 测定 NF-B p65 的激活， 结果表明， 丹参素衍生物抑制 LPS 对信号通路 PI3K/Akt 的激活， 抑制转录因子 NF-B 的激活及转位， 从而抑制炎症反应。 说 明 书 CN 103204790 A 10 1/3 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103204790 A 11 2/3 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103204790 A 12 3/3 页 13 图 5 说 明 书 附 图 CN 103204790 A 13 。